Name: isogenic kidney glomerulus chip engineered from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2022-11-04T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Pratt School of Engineering an der Duke University, der Abteilung für Nephrologie am Duke Department of Medicine, einem Whitehead-Stipendium für biomedizinische Forschung und einem Genentech Research Award für S. Musah unterstützt. Y. Roye ist Empfänger des Duke University-Alfred P. Sloan Foundation Scholarship und des William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship des Department of Biomedical Engineering der Duke University. Die iPS-Zelllinie DU11 (Duke University clone #11) wurde in der Duke iPSC Core Facility generiert und uns vom Bursac Lab der Duke University zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya und Y. Zhou für technische Unterstützung und hilfreiche Diskussionen. Die Autoren danken auch den Mitgliedern des Musah Lab für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Die Autoren danken dem Segura Lab für das Geschenk eines Acuri C6 Durchflusszytometers.

1. Herstellung von Basalmembranmatrixlösungen und beschichteten Substraten
<ol><li>Basalmembranmatrix 1 über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Aliquot nach dem Vorschlag des Herstellers für das Verdünnungsverhältnis. Mischen Sie mit einem 50-ml-Konikröhrchen und einer Pipette gründlich eine geeignete Menge der Basalmembranmatrix 1 in 25 ml kaltes DMEM/F12, bis sie vollständig aufgetaut und aufgelöst ist.<ol><li>Um ein gefrorenes Aliquot aufzulösen, nehmen Sie ~ 200 μL aus den 25 mL kaltem D...

<ol>
	<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disease+model+of+diabetic+nephropathy+in+a+glomerulus-on-a-chip+microdevice.">A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice.</a> Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).</li><li>Petrosyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glomerulus-on-a-chip+to+recapitulate+the+human+glomerular+filtration+barrier.">A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier.</a> Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).</li><li>Hass, R., Kasper, C., B&#246;hm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC):+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC.">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).</li><li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+when+do+differences+make+a+difference.">Cellular heterogeneity: when do differences make a difference.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Da Sacco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+cultured+podocytes.">A novel source of cultured podocytes.</a> PloS One. 8 (12), 81812 (2013).</li><li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+applications+in+regenerative+medicine,+disease+modeling,+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. 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(161), e61299 (2020).</li><li>Roye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+personalized+glomerulus+chip+engineered+from+stem+cell-derived+epithelium+and+vascular+endothelium.">A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium.</a> Micromachines. 12 (8), 967 (2021).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin+localizes+in+the+kidney+to+the+slit+diaphragm+area.">Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area.</a> The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).</li><li>Ruotsalainen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+is+specifically+located+at+the+slit+diaphragm+of+glomerular+podocytes.">Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).</li><li>Privratsky, J. R., Newman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PECAM-1:+regulator+of+endothelial+junctional+integrity.">PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).</li><li>Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+components+and+crosstalk.">The glomerular filtration barrier: components and crosstalk.</a> International Journal of Nephrology. 2012, 749010 (2012).</li><li>Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+human+iPSC-derived+vascular+endothelial+cells+under+physiological+shear+stress.">Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100394 (2021).</li><li>Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+productivity+crisis+in+pharmaceutical+R&amp;D.">The productivity crisis in pharmaceutical R&amp;D.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).</li><li>Atchison, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+endothelial+cells+affect+vascular+function+in+a+tissue-engineered+blood+vessel+model+of+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome.">iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).</li></ol>

In diesem Bericht skizzieren wir ein Protokoll zur Ableitung von vaskulärem Endothel und glomerulärem Epithel (Podozyten) aus einer isogenen menschlichen iPS-Zelllinie und der Verwendung dieser Zellen zur Entwicklung eines 3D-Organ-on-a-Chip-Systems, das die Struktur, die Gewebe-Gewebe-Schnittstelle und die molekulare Filtrationsfunktion des Nierenglomerulus nachahmt. Dieser Glomerulus-Chip ist mit Endothel und glomerulärem Epithel ausgestattet, die zusammen eine Barriere für selektive Filtermoleküle darstellen. </p...

Organ-on-a-Chip-Geräte sind dynamische 3D-In-vitro-Modelle, die molekulare und mechanische Stimulation sowie Vaskularisation verwenden, um Gewebe-Gewebe-Schnittstellen zu bilden, die die Struktur und Funktion bestimmter Organe modellieren. Zuvor etablierte Organ-on-a-Chip-Geräte, die darauf abzielten, den Glomerulus der Niere (Glomerulus-Chips) zu rekapitulieren, bestanden aus tierischen Zelllinien1 oder menschlichen primären und immortalisierten Zelllinien heterogener Quellen 2,3. Die Verwendung genetisch heterogener Zellquellen weist Variationen auf, die die Studien zu patientenspezifischen Reaktionen und Genetik oder Mechanismen der Krankheit signifikant einschränken 4,5. Die Bewältigung dieser Herausforderung hängt von der Verfügbarkeit isogener Zelllinien ab, die von spezifischen Individuen mit erhaltenen molekularen und genetischen Profilen stammen, um eine genauere Mikroumgebung für die Entwicklung von In-vitro-Modellen bereitzustellen 2,3,6. Isogene Zelllinien menschlichen Ursprungs können nun aufgrund der Fortschritte in der humanen iPS-Zellkultur leicht erzeugt werden. Da humane iPS-Zellen typischerweise nicht-invasiv gewonnen werden, sich unbegrenzt selbst erneuern und sich in fast jeden Zelltyp differenzieren können, dienen sie als attraktive Zellquelle für die Etablierung von In-vitro-Modellen wie dem Glomerulus-Chip 7,8. Die glomeruläre Filtrationsbarriere ist die primäre Stelle für die Blutfiltration. Blut wird zuerst durch vaskuläres Endothel, die glomeruläre Basalmembran, und schließlich durch spezialisiertes Epithel gefiltert, das Podozyten genannt wird. Alle drei Komponenten der Filtrationsbarriere tragen zur selektiven Filtration von Molekülen bei. Hier wird ein Protokoll zur Etablierung eines Organ-on-a-Chip-Geräts vorgestellt, das mit vaskulärem Endothel und glomerulärem Epithel aus einer einzigen menschlichen iPS-Zellquelle verbunden ist. Während dieses Protokoll besonders nützlich ist, um einen isogenen und vaskularisierten Chip zu entwickeln, um die glomeruläre Filtrationsbarriere zu rekapitulieren, bietet es auch eine Blaupause für die Entwicklung anderer Arten von personalisierten Organ-on-Chips und Multi-Organ-Plattformen wie ein isogenes "Body-on-a-Chip" -System.
Das hierin beschriebene Protokoll beginnt mit der divergenten Differenzierung menschlicher iPS-Zellen in zwei getrennte Linien - laterale Mesoderm- und Mesodermzellen, die anschließend in vaskuläres Endothel bzw. glomeruläres Epithel differenziert werden. Um laterale Mesodermzellen zu erzeugen, wurden menschliche iPS-Zellen auf Basalmembranmatrix 1-beschichteten Platten ausgesät und für 3 Tage (ohne Medienaustausch) in N2B27-Medium kultiviert, ergänzt mit dem Wnt-Aktivator CHIR 99021 und dem potenten Mesoderm-Induktor, bone-morphogenetic 4 (BMP4). Die resultierenden lateralen Mesodermzellen waren zuvor durch die Expression von Brachyury (T), Mix-Paired-like Homöobox (MIXL) und Eomesodermin (EOMES)9 charakterisiert. Anschließend wurden die lateralen Mesodermzellen für 4 Tage in einem mit VEGF165 und Forskolin ergänzten Medium kultiviert, um vaskuläre Endothelzellen zu induzieren, die basierend auf VE-Cadherin- und/oder PECAM-1-Expression mittels magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MACS) aussortiert wurden. Die resultierenden vaskulären Endothelzellen (viEC) wurden expandiert, indem sie auf Basalmembranmatrix 3-beschichteten Kolben kultiviert wurden, bis sie bereit waren, in der mikrofluidischen Vorrichtung zu säen.
Um Mesodermzellen zu erzeugen, wurden humane iPS-Zellen auf Basalmembranmatrix 2-beschichteten Platten ausgesät und 2 Tage lang in einem Medium kultiviert, das Activin A und CHIR99021 enthielt. Die resultierenden Mesodermzellen wurden durch die Expression von HAND1, Goosecoid und Brachurie (T) charakterisiert, wie zuvorbeschrieben 2,10,11. Um eine intermediäre Mesodermzelldifferenzierung (IM) zu induzieren, wurden die Mesodermzellen 14 Tage lang in einem mit BMP-7 und CHIR99021 ergänzten Medium kultiviert. Die resultierenden IM-Zellen exprimieren Wilm-Tumor 1 (WT1), gepaartes Box-Gen 2 (PAX2) und odd-skipped verwandtes Protein 1 (OSR-1)2,10,11.
Ein zweikanaliger Mikrofluidik-Chip auf Basis von Polydimethylsiloxan (PDMS) wurde entwickelt, um die Struktur der glomerulären Filtrationsbarriere in vitro zu rekapitulieren. Der Harnkanal beträgt 1.000 μm x 1.000 μm (b x h) und die Kapillarkanalabmessung 1.000 μm x 200 μm (b x h). Zyklische Dehnungs- und Entspannungszyklen wurden durch die Hohlkammern auf jeder Seite der Fluidkanäle erleichtert. Die Zellen wurden auf eine flexible, 50 μm dicke PDMS-Membran gesetzt, die den Harn- und Kapillarkanal trennt. Die Membran ist mit hexagonalen Poren (7 μm Durchmesser, 40 μm Abstand) ausgestattet, um die interzelluläre Signalübertragung zu fördern (Abbildung 1A)2,12. Zwei Tage vor Abschluss der IM-Induktion wurden die mikrofluidischen Chips mit der Basalmembranmatrix 2 beschichtet. viECs wurden 1 Tag vor Abschluss der IM-Induktion mit Endothelial Maintenance Medium in den Kapillarkanal des mikrofluidischen Chips ausgesät, und der Chip wurde auf den Kopf gestellt, um die Zelladhäsion auf der basalen Seite der ECM-beschichteten PDMS-Membran zu ermöglichen. An dem Tag, an dem die IM-Induktion abgeschlossen war, wurden die Zellen in den Harnkanal des mikrofluidischen Chips ausgesät, wobei ein Medium verwendet wurde, das mit BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 und allen trans-Retinsäure ergänzt wurde, um eine Podozytendifferenzierung innerhalb des Chips zu induzieren. Am folgenden Tag wurden die Medienreservoirs mit Podozyten-Induktionsmedium und Endothel-Erhaltungsmedium gefüllt, und 10% mechanische Dehnung bei 0,4 Hz und Flüssigkeitsfluss (60 μL/h) wurden auf die Chips angewendet.
Die zellularisierten mikrofluidischen Chips wurden für weitere 5 Tage mit Podozyten-Induktionsmedium (im Harnkanal) und Endothelial-Erhaltungsmedium (im Gefäßkanal) kultiviert. Die resultierenden Nierenglomerulus-Chips wurden für bis zu 7 weitere Tage in Erhaltungsmedien sowohl für die Podozyten- als auch für die Endothelzellen kultiviert. Die differenzierten Podozyten exprimierten positiv lineagespezifische Proteine, einschließlich Podocin und Nephrin 13,14, während viECs die Linienidentifikationsproteine PECAM-1 und VE-Cadherin positiv exprimierten, die alle essentielle Moleküle für die Aufrechterhaltung der Integrität der glomerulären Filtrationsbarriere sind 15,16 . Es wurde festgestellt, dass die Podozyten und viECs beide das am häufigsten vorkommende glomeruläre Basalmembranprotein, Kollagen IV, absondern, das auch für die Gewebereifung und -funktion wichtig ist.
Das Dreikomponentensystem der Filtrationsbarriere - Endothel, Basalmembran und Epithel - in den Glomerulus-Chips filterte selektiv Moleküle und reagierte auf eine chemotherapeutische, nephrotoxische medikamentöse Behandlung. Die Ergebnisse der medikamentösen Behandlung zeigten, dass der Glomerulus-Chip für Nephrotoxizitätsstudien und zur Krankheitsmodellierung verwendet werden kann. Dieses Protokoll liefert die allgemeine Richtlinie für die Entwicklung eines funktionellen mikrofluidischen Nierenglomerulus-Chips aus isogenen iPS-Zellderivaten. Nachgeschaltete Analysen des konstruierten Chips können nach Wunsch des Forschers durchgeführt werden. Weitere Informationen zur Verwendung des Glomerulus-Chips zur Modellierung medikamenteninduzierter glomerulärer Schädigungen finden Sie in früheren Publikationen 2,12.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>14-9871-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP-N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podocin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Fibronectin, Human</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>Basement membrane (3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td>
			<td>Iwai North America</td>
			<td>N8922012</td>
			<td>Basement membrane matrix (2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU11 human iPS cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium growth factors and media supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A23017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x) without Vitamin A</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete medium kit with CultureBoost-R</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-500-R</td>
			<td>Podocyte maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10565042</td>
			<td>DMEM/F12 with glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin (Adenylyl cyclase activator)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP4</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>120-05ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP7</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin-FITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05850</td>
			<td>Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Lateral mesoderm basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin, liquid (100x)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y27632)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10639011</td>
			<td>Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 &#176;C or -20 &#176;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-Beta inhibitor (SB431542)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes and other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Suloxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97065-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 0.05%</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Orb) Hub module</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>ORB-HM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15 mm round petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB087579B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 x 120 mm square cell culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipettes, individually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29442-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating Unit</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F19917-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B99516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M7000</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td>Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>51030403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera</td>
			<td>Carl Zeiss Micrscopy</td>
			<td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>40101-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leoca SP8 Upright Confocal Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir (POD Portable Module)</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>POD-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ-chip</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>S-1 Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ-chip holder</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>AK-CCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 precision barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Asher</td>
			<td>Quorum tech</td>
			<td>K1050X RF</td>
			<td>This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University&#39;s Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip, 0.22 &#181;m, PES</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1138W14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75cm2 cell culture flask with vent cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated 12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated 6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module)</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>ZOE-CM1</td>
			<td>Organ Chip Bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-126-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-beveled cell lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBead Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isogenic kidney glomerulus chip engineered from human induced pluripotent stem cells

Chronische Nierenerkrankungen (CKD) betreffen 15% der erwachsenen US-Bevölkerung, aber die Etablierung gezielter Therapien wurde durch den Mangel an Funktionsmodellen eingeschränkt, die menschliche biologische Reaktionen und Nephrotoxizität genau vorhersagen können. Fortschritte in der Nierenpräzisionsmedizin könnten helfen, diese Einschränkungen zu überwinden. Zuvor etablierte In-vitro-Modelle des menschlichen Nierenglomerulus - der primäre Ort für die Blutfiltration und ein Hauptziel vieler Krankheiten und Arzneimitteltoxizitäten - verwenden jedoch typischerweise heterogene Zellpopulationen mit begrenzten funktionellen Eigenschaften und unübertroffenen genetischen Hintergründen. Diese Eigenschaften schränken ihre Anwendung für die patientenspezifische Krankheitsmodellierung und therapeutische Entdeckung erheblich ein. 
Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das humanes induziertes pluripotentes Stamm (iPS) Zell-abgeleitetes glomeruläres Epithel (Podozyten) und vaskuläres Endothel von einem einzigen Patienten integriert, um einen isogenen und vaskularisierten mikrofluidischen Nierenglomerulus-Chip zu entwickeln. Der resultierende Glomerulus-Chip besteht aus Stammzell-abgeleiteten Endothel- und Epithelzellschichten, die linienspezifische Marker exprimieren, Basalmembranproteine produzieren und eine Gewebe-Gewebe-Schnittstelle bilden, die der glomerulären Filtrationsbarriere der Niere ähnelt. Der konstruierte Glomerulus-Chip filtert selektiv Moleküle und rekapituliert medikamenteninduzierte Nierenschäden. Die Fähigkeit, die Struktur und Funktion des Nierenglomerulus mithilfe isogener Zelltypen zu rekonstruieren, schafft die Möglichkeit, Nierenerkrankungen mit Patientenspezifität zu modellieren und den Nutzen von Organs-on-Chips für die Nierenpräzisionsmedizin und verwandte Anwendungen voranzutreiben.

Hier zeigen wir, dass ein funktionelles 3D-In-vitro-Modell des Glomerulus aus einer isogenen Quelle menschlicher iPS-Zellen vaskularisiert und epithelialisiert werden kann. Insbesondere enthält dieses Protokoll Anweisungen zur Anwendung der humanen iPS-Zelltechnologie, insbesondere ihrer Fähigkeit, sich in spezialisierte Zelltypen zu differenzieren, um ein glomeruläres Nierenepithel (Podozyte) und vaskuläres Endothel (viECs) zu erzeugen, das in mikrofluidische Geräte integriert werden kann, um die Struktur ...

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Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Hier wird ein Protokoll zur Entwicklung eines personalisierten Organ-on-a-Chip-Systems vorgestellt, das die Struktur und Funktion der nierenglomerulären Filtrationsbarriere rekapituliert, indem genetisch angepasste Epithel- und vaskuläre Endothelzellen integriert werden, die sich von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen unterscheiden. Dieses biotechnologisch hergestellte System kann die Nierenpräzisionsmedizin und verwandte Anwendungen voranbringen.

Isogener Nieren-Glomerulus-Chip aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Der isogene Glomerulus-Chip wird patientenspezifische Krankheitsmodellierung und Nephrotoxizitätstests sowie fortschrittliche Anwendungen in der Präzisionsmedizin ermöglichen. Glomeruläres Epithel und Endothel stammen aus einer einzigen Population von human-induzierten pluripotenten Stammzellen oder IPSCs. IPSCs besitzen unbegrenzte Selbsterneuerung und können sich in fast jeden Zelltyp differenzieren.Diese Technik kann verwendet werden, um pathologische zelluläre Phänotypen und Krankheiten zu beurteilen. Der patientenspezifische Organchip kann auch als Plattform für Medikamentenscreenings und mechanistische Studien dienen. Dieses Modell kann auf die Entwicklung eines Körper-auf-Chip-Systems angewendet werden, das auf einen bestimmten Patienten zugeschnitten ist.Dieses System hat das Potenzial, patientenspezifische Reaktionen vor klinischen Tests vorherzusagen. Beginnen Sie mit der vorsichtigen Zugabe von 25 Mikrolitern Basalmembranmatrix 2-Lösung in den Harnkanal und 20 Mikroliter in den Kapillarkanal des Chips. Nehmen Sie zwei sterile 15-Milliliter-konische Schlauchkappen und füllen Sie sie mit 500 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser.Legen Sie die Kappe in die Petrischale, um ein Austrocknen zu verhindern, und setzen Sie den Deckel auf die Schale. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius über Nacht. Anschließend wird das Medium aus T75-Kolben aspiriert, die eine 15-tägige Kultur von vaskulären Endothelzellen bei 90%-Konfluenz enthalten.Fügen Sie fünf Milliliter Zellablösungspuffer hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für fünf bis sieben Minuten. Dann werden die Zellen in ein 15 Milliliter konisches Röhrchen überführt und fünf Milliliter DMEM/F-12 hinzugefügt. Zentrifugieren Sie bei 200 mal G für fünf Minuten.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 300 Mikrolitern endothelialem Erhaltungsmedium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, um etwa 2 Millionen Zellen zu erhalten. Spülen Sie mit einer P200-Barrierespitze sowohl den oberen als auch den unteren Kanal des mikrofluidischen Chips mit 200 Mikrolitern DMEM/F-12 und saugen Sie gleichzeitig von der Peripherie des Auslasses ab.Halten Sie den Chip fest mit der P200-Barrierespitze, die am Aspirator befestigt ist, weg vom Ausgang des unteren Kanals. Injizieren Sie 20 Mikroliter der vaskulären Endothelzellsuspension fest in den Kapillarkanal des Chips und saugen Sie das Medium vorsichtig aus der Peripherie des Auslasses ab. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop auf Blasen oder eine ungleichmäßige Aussaatdichte.Drehen Sie den Chip vorsichtig um, damit die Zellen an der basalen Seite der flexiblen PDMS-Membran haften können. Legen Sie den Chip in die Halterpatrone und geben Sie drei Milliliter PBS in die Kartusche, um ein Austrocknen der Membran zu verhindern. Inkubieren Sie den Chip bei 37 Grad Celsius für drei Stunden.Überprüfen Sie den unteren Kanal unter dem Mikroskop auf eine konfluente Zellschicht, die an der flexiblen PDMS-Membran befestigt ist. Waschen Sie die nicht angeschlossenen Zellen, indem Sie 200 Mikroliter endotheliales Erhaltungsmedium am Eingang des unteren Kanals hinzufügen, während Sie von der Peripherie des Kapillarkanalauslasses absaugen. Setzen Sie den Chip wieder in die Halterpatrone ein und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag spülen Sie den Kapillarkanal vorsichtig mit 200 Mikrolitern endothelialem Erhaltungsmedium. Spülen Sie den Harnkanal mit 200 Mikrolitern DMEM/F-12 und lassen Sie 50 Mikroliter DMEM/F-12 auf die Ein- und Auslassöffnungen fallen. Ersetzen Sie das intermediäre Mesoderm-Induktionsmedium aus jeder Vertiefung der 12-Well-Platte durch einen Milliliter Trypsin EDTA und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.Kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zelllifter ab und dissoziieren Sie die Zellen durch Pipettieren. Fügen Sie zwei Milliliter Trypsin-Neutralisationslösung in jede Vertiefung und überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen. Das Volumen der Zellsuspension mit DMEM/F-12 auf 50 Milliliter auffüllen und bei 200 mal G fünf Minuten zentrifugieren.Asspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern intermediärem Mesoderm-Induktionsmedium, um etwa 3 Millionen Zellen zu erhalten. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Halten Sie den Chip und injizieren Sie 25 Mikroliter Zellsuspension fest in den Harnkanal des Chips, während Sie das Medium vorsichtig von der Peripherie des Auslasses ansaugen.Überprüfen Sie auf Blasen oder ungleichmäßige Zellaussaatdichte. Drei Milliliter PBS in die Chiphalterkartusche geben und drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation spülen Sie beide Kanäle mit 200 Mikrolitern ihres jeweiligen Zellkulturmediums.Befestigen Sie leere P200-Barrierespitzen in beiden Ausgängen des Harn- und Kapillarkanals. Pipettieren Sie 200 Mikroliter endotheliales Erhaltungsmedium und injizieren Sie die Hälfte davon in den Kapillarkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass so los, dass sowohl der Einlass als auch der Auslass des Kanals an mit Medium gefüllten Pipettenspitzen befestigt sind.Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Harnkanaleinlass mit 200 Mikrolitern intermediärem Mesoderm-Erhaltungsmedium. Inkubieren Sie die Chips mit Spitzen, die bei 37 Grad Celsius eingebettet sind, über Nacht. Um die Chips mit dem Organchip-Bioreaktor zu verbinden, entfernen Sie zunächst die P200-Spitzen aus den Kanälen.Fügen Sie Tröpfchen entsprechender Medien in den Ein- und Auslass der Harn- und Kapillarkanäle ein, um ein Austrocknen zu verhindern. Fügen Sie drei Milliliter warmes Podozyten-Induktionsmedium in das Urineinlassreservoir und drei Milliliter warmes endotheliales Erhaltungsmedium in das kapillare Einlassreservoir hinzu. Geben Sie 300 Mikroliter des jeweiligen Mediums direkt über dem Auslassanschluss in die Auslassbehälter.Schieben Sie die Pods auf das Tablett und in den Bioreaktor des Organchips. Verwenden Sie den Drehregler, um den Prime-Zyklus auszuwählen und für zwei Minuten zu starten. Untersuchen Sie die Unterseite des Pods visuell auf kleine Tröpfchen an allen vier fluidischen Anschlüssen.Um einen Flüssigkeitskontakt zwischen der Pod-Unterseite und den mikrofluidischen Chipports zu erreichen, schieben Sie den Chipträger vorsichtig in den Pod. Drücken Sie die Chipträgerlasche vorsichtig hinein und nach oben. Saugen Sie überschüssiges Medium von der Chipoberfläche ab.Stellen Sie die Durchflussrate des Organchip-Bioreaktors auf 60 Mikroliter pro Stunde ein. Stellen Sie die zyklische Belastung auf 10% bei 0,4 Hertz ein. Verwenden Sie den Drehregler am Organchip-Bioreaktor, um den Regelzyklus auszuwählen und zwei Stunden lang zu laufen.Prüfen Sie die Auslassbehälter visuell auf eine Erhöhung des Mediumsspiegels. Verwenden Sie den Drehregler am Organchip-Bioreaktor, um den Regelzyklus auszuwählen. Nach Tag 17 der Kultur saugen Sie das Medium täglich aus den Harnkanalauslassreservoirs diagonal vom Hafen weg ab, aber halten Sie etwas Medium im Reservoir.Füllen Sie das Harnkanaleinlassreservoir fünf Tage lang alle zwei Tage mit bis zu drei Milliliter Podozyten-Induktionsmedium auf. Nach fünf Tagen saugen Sie das Medium aus dem Harnkanal ab, aber halten Sie etwas Medium im Reservoir. Füllen Sie das Harnkanaleinlassreservoir täglich mit drei Milliliter Podozyten-Erhaltungsmedium auf.In ähnlicher Weise saugen Sie das Medium aus dem Kapillarkanalauslass ab und füllen die Einlassbehälter täglich mit endothelialem Wartungsmedium auf. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden humane induzierte pluripotente Stammzellen verwendet, um ein funktionelles in vitro Modell des Glomerulus zu entwickeln, indem vaskuläre Endothelzellen und Podozyten vermehrt wurden. Am Tag 21 nach der Podozyteninduktion und der vaskulären Endothelausbreitung exprimierten die Zellen innerhalb der Chips Linienidentifikationsmarker wie Podocin und Nephrin für Podozyten, VE Cadherin und PECAM-1 für vaskuläre Endothelzellen.Sowohl die Podozyten- als auch die vaskulären Endothelzellschichten exprimierten Kollagen IV, das am häufigsten vorkommende GBM-Protein im Nierenglomerulus. Die Glomerulus-Chips filtern selektiv kleine Moleküle wie Inulin aus der Kapillare in den Harnkanal und verhindern, dass große Proteine wie Albumin den Kapillarkanal verlassen, was eine selektive molekulare Filtrationsfunktion zeigt. Während der endothelialen Induktion an den Tagen vier bis sieben kann eine Zunahme der Zellzahl zu einer sekundären Zellschicht führen, aber eine Übersaat kann zu einer Aggregation führen, die die Differenzierung behindern kann.Ein unerwarteter Flüssigkeitsquerfluss zwischen den Harn- und Kapillarkanälen kann bei unzureichender Verklebung der PDMS-Chipkomponenten, Verstopfung des Flüssigkeitsströmungspfads oder beeinträchtigter Filterbarriere beobachtet werden. Bei der Aussaat von Endothel und Epithel und der Pflege der Späne ab Tag 15 ist es wichtig, bei jedem Schritt visuell auf Luftblasen in den Kanälen zu prüfen. Im isogenen Glomerulus-Chip können klinisch relevante Wirkstoffkandidaten verabreicht werden, um ihr therapeutisches Potenzial oder ihre Toxizität zu testen.Diese Technik eröffnet nun Möglichkeiten, die genetischen Grundlagen menschlicher Nierenerkrankungen zu verstehen und personalisierte Therapeutika zu entwickeln.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Forschung

Biotechnik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalierbare Generierung von reifen Zerebellar-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunostainierung

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Erzeugung menschlicher Blutgefäß-Organoide aus pluripotenten Stammzellen

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...