Name: isogenic kidney glomerulus chip engineered from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2022-11-04T13:15:00
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この研究は、デューク大学のプラット工学部、デューク医学部の腎臓科、生物医学研究におけるホワイトヘッド奨学金、およびS.ムサのジェネンテック研究賞によってサポートされました。Y.ロイは、デューク大学-アルフレッドP.スローン財団奨学金とデューク大学の生物医学工学科のウィリアムM.「モンティ」ライカート大学院フェローシップの受領者です。DU11(デューク大学のクローン#11)iPS細胞株は、デューク大学のiPSコア施設で生成され、デューク大学のBursac Labから提供されました。著者らは、N. Abutaleb、J. Holmes、R. Bhattacharya、Y. Zhouの技術支援と有益な議論に感謝する。著者はまた、原稿に関する有益なコメントをしてくれたMusahラボのメンバーに感謝したいと思います。著者らは、Acuri C6フローサイトメーターを贈ってくれたSeguraラボに感謝しています。

1. 基底膜マトリックス溶液とコーティング基板の調製
<ol><li>基底膜マトリックス1を氷上で4°Cで一晩解凍する。 希釈比に関するメーカーの提案に従ってアリコートします。50 mLのコニカルチューブとピペットを使用して、適量の基底膜マトリックス1を25 mLのコールドDMEM/F12に完全に解凍して溶解するまで十分に混合します。<ol><li>凍結アリコートを溶解するには、25 mLのコールドD...

<ol>
	<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disease+model+of+diabetic+nephropathy+in+a+glomerulus-on-a-chip+microdevice.">A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice.</a> Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).</li><li>Petrosyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glomerulus-on-a-chip+to+recapitulate+the+human+glomerular+filtration+barrier.">A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier.</a> Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).</li><li>Hass, R., Kasper, C., B&#246;hm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC):+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC.">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).</li><li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+when+do+differences+make+a+difference.">Cellular heterogeneity: when do differences make a difference.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Da Sacco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+cultured+podocytes.">A novel source of cultured podocytes.</a> PloS One. 8 (12), 81812 (2013).</li><li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+applications+in+regenerative+medicine,+disease+modeling,+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).</li><li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. 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(161), e61299 (2020).</li><li>Roye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+personalized+glomerulus+chip+engineered+from+stem+cell-derived+epithelium+and+vascular+endothelium.">A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium.</a> Micromachines. 12 (8), 967 (2021).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin+localizes+in+the+kidney+to+the+slit+diaphragm+area.">Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area.</a> The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).</li><li>Ruotsalainen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+is+specifically+located+at+the+slit+diaphragm+of+glomerular+podocytes.">Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).</li><li>Privratsky, J. R., Newman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PECAM-1:+regulator+of+endothelial+junctional+integrity.">PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).</li><li>Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+components+and+crosstalk.">The glomerular filtration barrier: components and crosstalk.</a> International Journal of Nephrology. 2012, 749010 (2012).</li><li>Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+human+iPSC-derived+vascular+endothelial+cells+under+physiological+shear+stress.">Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100394 (2021).</li><li>Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+productivity+crisis+in+pharmaceutical+R&amp;D.">The productivity crisis in pharmaceutical R&amp;D.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).</li><li>Atchison, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+endothelial+cells+affect+vascular+function+in+a+tissue-engineered+blood+vessel+model+of+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome.">iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).</li></ol>

本報告では、同質遺伝子ヒトiPS細胞株から血管内皮および糸球体上皮(ポドサイト)を誘導するためのプロトコルと、これらの細胞を使用して、腎臓糸球体の構造、組織-組織界面、および分子ろ過機能を模倣する3D臓器チップシステムを設計する方法について概説します。この糸球体チップには内皮と糸球体上皮が装備されており、これらが一緒になって分子を選択的にろ過するためのバリア?...

Organ-on-a-chipデバイスは、分子刺激と機械的刺激、血管新生を使用して、特定の臓器の構造と機能をモデル化する組織-組織界面を形成する動的な3Din vitroモデルです。腎臓糸球体(糸球体チップ)を再現することを目的とした以前に確立された臓器チップデバイスは、動物細胞株1または不均一な供給源のヒト初代および不死化細胞株で構成されていました2,3。遺伝的に不均一な細胞源の使用は、患者特異的反応および疾患の遺伝学またはメカニズムの研究を著しく制限する変動を提示する4,5。この課題に対処するには、in vitroモデル2,3,6を設計するためのより正確な微小環境を提供するために、保存された分子および遺伝的プロファイルを持つ特定の個人に由来する同質遺伝子細胞株の利用可能性にかかっています。ヒトiPS細胞培養の進歩により、ヒト由来の同質遺伝子細胞株を容易に作製できるようになりました。ヒトiPS細胞は通常、非侵襲的に供給され、無期限に自己複製でき、ほぼすべての細胞型に分化できるため、糸球体チップ7,8などのin vitroモデルを確立するための魅力的な細胞源として機能します。糸球体濾過バリアは、血液濾過の主要な部位である。血液は、最初に血管内皮、糸球体基底膜、そして最後にポドサイトと呼ばれる特殊な上皮を通してろ過されます。ろ過バリアの3つのコンポーネントすべてが、分子の選択的ろ過に貢献します。ここでは、単一のヒトiPS細胞源から血管内皮および糸球体上皮とインターフェースする臓器チップデバイスを確立するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、糸球体濾過バリアを再現するために同質遺伝子および血管化チップを設計するのに特に役立ちますが、同質遺伝子の「ボディオンチップ」システムなどの他のタイプのパーソナライズされた臓器オンチップおよび多臓器プラットフォームを開発するための青写真も提供します。
本明細書に記載されるプロトコルは、ヒトiPS細胞を2つの別々の系統(外側中胚葉細胞および中胚葉細胞)に分岐させることから始まり、その後、それぞれ血管内皮および糸球体上皮に分化する。側方中胚葉細胞を作製するために、ヒトiPS細胞を基底膜マトリックス1コートプレートに播種し、WntアクチベーターCHIR 99021および強力な中胚葉誘導剤である骨形成4(BMP4)を添加したN2B27培地中で3日間(培地交換なしで)培養した。得られた外側中胚葉細胞は、ブラキュリー(T)、ミックスペア様ホメオボックス(MIXL)、およびエオメソデルミン(EOMES)9の発現によって以前に特徴付けられました。続いて、VEGF165およびフォルスコリンを添加した培地で外側中胚葉細胞を4日間培養し、磁気活性化細胞選別(MACS)を用いてVE-カドヘリンおよび/またはPECAM-1発現に基づいて選別された血管内皮細胞を誘導した。得られた血管内皮細胞(viEC)を、マイクロ流体デバイスに播種する準備ができるまで基底膜マトリックス3コートフラスコ上で培養して増殖させた。
中胚葉細胞を作製するために、基底膜マトリックス2コートプレート上にヒトiPS細胞を播種し、アクチビンAおよびCHIR99021を含む培地で2日間培養した。得られた中胚葉細胞は、先に述べたようにHAND1、グースコイド、および腕管(T)の発現によって特徴付けられた2、10、11。中間中胚葉(IM)細胞分化を誘導するために、中胚葉細胞をBMP-7およびCHIR99021を添加した培地中で14日間培養した。得られたIM細胞は、ウィルム腫瘍1(WT1)、ペアボックス遺伝子2(PAX2)、および奇数スキップ関連タンパク質1(OSR-1)2,10,11を発現する。
2チャンネルポリジメチルシロキサン(PDMS)ベースのマイクロ流体チップは、糸球体濾過バリアの構造をin vitroで再現するために設計されました。尿路は1,000 μm x 1,000 μm(幅 x 高さ)で、毛細血管チャネルの寸法は1,000 μm x 200 μm(幅 x 高さ)です。周期的な延伸および緩和サイクルは、流体チャネルの両側に存在する中空チャンバーによって促進された。細胞は、尿路と毛細血管チャネルを分離する柔軟なPDMS膜(厚さ50μm)に播種されました。メンブレンは、細胞間シグナル伝達を促進するために六角形の細孔(直径7 μm、間隔40 μm)を備えています(図1A)2,12。IM誘導が完了する2日前に、マイクロ流体チップを基底膜マトリックス2でコーティングした。IM誘導が完了する1日前に、内皮維持培地を用いてマイクロ流体チップのキャピラリーチャネルにviECを播種し、チップを逆さまにして、ECMコーティングPDMS膜の基底側に細胞接着を可能にしました。IM誘導が完了した日に、BMP7、アクチビンA、CHIR99021、VEGF165、およびすべてのトランスレチノイン酸を添加した培地を使用して、細胞をマイクロ流体チップの尿路に播種し、チップ内でポドサイト分化を誘導しました。翌日、培地リザーバーにポドサイト誘導培地と内皮維持培地を充填し、0.4Hzで10%の機械的ひずみと流体の流れ(60 μL/h)をチップに加えました。
細胞化マイクロ流体チップを、ポドサイト誘導培地(尿路内)および内皮維持培地(血管チャネル内)を用いてさらに5日間培養した。得られた腎糸球体チップを、足細胞および内皮細胞の両方について維持培地中でさらに最大7日間培養した。分化したポドサイトは、ポドシンおよびネフリンを含む系統特異的タンパク質を正に発現し13,14、一方、viECは、糸球体濾過バリアの完全性を維持するために必須の分子である系統識別タンパク質PECAM-1およびVE-Cadherinを陽性発現した15,16。.ポドサイトとviECはどちらも、最も豊富な糸球体基底膜タンパク質であるコラーゲンIVを分泌することがわかり、これは組織の成熟と機能にも重要です。
糸球体チップの濾過バリアの3成分系(内皮、基底膜、上皮)は、分子を選択的に濾過し、化学療法、腎毒性薬物治療に反応することがわかりました。薬物治療の結果は、糸球体チップが腎毒性試験および疾患モデリングに使用できることを示した。このプロトコルは、同質遺伝子iPS細胞誘導体から機能的なマイクロ流体腎臓糸球体チップを設計するための一般的なガイドラインを提供します。設計されたチップの下流分析は、研究者が望むように実行できます。薬物誘発性糸球体損傷をモデル化するための糸球体チップの使用の詳細については、以前の出版物2,12を参照してください。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>14-9871-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP-N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podocin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Fibronectin, Human</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>Basement membrane (3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td>
			<td>Iwai North America</td>
			<td>N8922012</td>
			<td>Basement membrane matrix (2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU11 human iPS cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium growth factors and media supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A23017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x) without Vitamin A</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete medium kit with CultureBoost-R</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-500-R</td>
			<td>Podocyte maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10565042</td>
			<td>DMEM/F12 with glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin (Adenylyl cyclase activator)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP4</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>120-05ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP7</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin-FITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05850</td>
			<td>Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Lateral mesoderm basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin, liquid (100x)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y27632)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10639011</td>
			<td>Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 &#176;C or -20 &#176;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-Beta inhibitor (SB431542)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes and other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Suloxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97065-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 0.05%</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Orb) Hub module</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>ORB-HM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15 mm round petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB087579B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 x 120 mm square cell culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipettes, individually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29442-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating Unit</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F19917-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B99516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M7000</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td>Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>51030403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera</td>
			<td>Carl Zeiss Micrscopy</td>
			<td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>40101-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leoca SP8 Upright Confocal Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir (POD Portable Module)</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>POD-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ-chip</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>S-1 Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ-chip holder</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>AK-CCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 precision barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Asher</td>
			<td>Quorum tech</td>
			<td>K1050X RF</td>
			<td>This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University&#39;s Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip, 0.22 &#181;m, PES</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1138W14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75cm2 cell culture flask with vent cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated 12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated 6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module)</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>ZOE-CM1</td>
			<td>Organ Chip Bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-126-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-beveled cell lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBead Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isogenic kidney glomerulus chip engineered from human induced pluripotent stem cells

慢性腎臓病(CKD)は米国の成人人口の15%に影響を及ぼしますが、ヒトの生物学的反応と腎毒性を正確に予測できる機能モデルがないため、標的療法の確立は制限されてきました。腎臓精密医療の進歩は、これらの制限を克服するのに役立つ可能性があります。しかし、以前に確立されたヒト腎臓糸球体の in vitro モデル(血液濾過の主要な部位であり、多くの疾患や薬物毒性の主要な標的)は、通常、限られた機能的特徴と比類のない遺伝的背景を持つ不均一な細胞集団を採用しています。これらの特性は、患者固有の疾患モデリングおよび治療法の発見への適用を大幅に制限します。 
この論文では、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞由来糸球体上皮(足細胞)と単一の患者の血管内皮を統合して、同質遺伝子および血管化マイクロ流体腎臓糸球体チップを設計するプロトコルを提示します。得られた糸球体チップは、幹細胞由来の内皮細胞層と上皮細胞層で構成されており、系統特異的マーカーを発現し、基底膜タンパク質を産生し、腎臓の糸球体濾過バリアに似た組織-組織界面を形成します。操作された糸球体チップは、分子を選択的にろ過し、薬物誘発性腎障害を再現します。同質遺伝子細胞型を使用して腎臓糸球体の構造と機能を再構成する能力は、患者の特異性で腎臓病をモデル化し、腎臓精密医療および関連アプリケーションのための臓器オンチップの有用性を促進する機会を生み出します。

ここでは、糸球体の機能的な3Din vitroモデルが、ヒトiPS細胞の同質遺伝子源から血管新生および上皮化できることを示しています。具体的には、ヒトiPS細胞技術、特に特殊な細胞型への分化能力を適用して、マイクロ流体デバイスと統合して患者固有のレベルでヒト腎臓の構造と機能をモデル化できる腎糸球体上皮(ポドサイト)と血管内皮(viEC)を生成する方法に関する指示を提供します?...

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Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞から分化した遺伝的に一致する上皮細胞と血管内皮細胞を統合することにより、腎臓糸球体濾過バリアの構造と機能を要約するパーソナライズされた臓器チップシステムを設計するためのプロトコルを紹介します。このバイオエンジニアリングシステムは、腎臓精密医療および関連アプリケーションを進歩させることができます。

ヒト人工多能性幹細胞から改変された同質遺伝子腎臓糸球体チップ

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

同質遺伝子糸球体チップは、患者固有の疾患モデリング、腎毒性試験、および高度な精密医療アプリケーションを可能にします。糸球体上皮および内皮は、ヒト誘導多能性幹細胞(IPSC)の単一集団に由来する。IPSCは無制限の自己複製を持ち、ほぼすべての細胞型に分化することができます。この技術は、病理学的細胞表現型および疾患を評価するために使用することができる。患者固有の臓器チップは、薬物スクリーニングおよび機構研究のプラットフォームとしても機能します。このモデルは、特定の患者にパーソナライズされたボディオンチップシステムの開発に適用できます。このシステムは、臨床試験の前に患者固有の反応を予測する可能性があります。まず、25マイクロリットルの基底膜マトリックス2溶液を尿路に、20マイクロリットルをチップの毛細管チャネルに穏やかに加えます。2つの滅菌15ミリリットルコニカルチューブキャップを取り、500マイクロリットルの滅菌蒸留水で満たします。乾燥を防ぐためにキャップをペトリ皿に入れ、皿に蓋をします。摂氏37度で一晩インキュベートします。進行し、血管内皮細胞の培養物を90%コンフルエントで15日間収容したT75フラスコから培地を吸引する。5ミリリットルの細胞剥離バッファーを加え、摂氏37度で5〜7分間インキュベートします。次に、細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、5ミリリットルのDMEM / F-12を追加します。200倍Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を300マイクロリットルの内皮維持培地に再懸濁します。血球計算盤で細胞を数え、約200万個の細胞を取得します。P200バリアチップを使用して、マイクロ流体チップの上部チャネルと下部チャネルの両方を200マイクロリットルのDMEM / F-12でフラッシュし、同時に出口の周囲から吸引します。P200バリアチップをアスピレーターに取り付けて、下部チャネルの出口から離してチップをしっかりと保持します。20マイクロリットルの血管内皮細胞懸濁液をチップの毛細血管チャネルにしっかりと注入し、出口の周囲から培地を注意深く吸引します。顕微鏡で気泡や不均一な播種密度がないか確認してください。細胞が柔軟なPDMS膜の基底側に接着できるように、チップを静かに反転させます。チップをホルダーカートリッジに入れ、メンブレンが乾燥しないように3ミリリットルのPBSをカートリッジに追加します。チップを摂氏37度で3時間インキュベートします。顕微鏡下でボトムチャネルをチェックして、柔軟なPDMSメンブレンに付着した細胞のコンフルエント層を確認します。キャピラリーチャネル出口の周囲から吸引しながら、底部チャネルの入口に200マイクロリットルの内皮維持培地を添加して、付着していない細胞を洗浄する。チップをホルダーカートリッジに戻し、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、キャピラリーチャネルを200マイクロリットルの内皮維持培地で静かに洗い流します。尿路を200マイクロリットルのDMEM / F-12で洗い流し、50マイクロリットルのDMEM / F-12を入口ポートと出口ポートに落とします。中間中胚葉細胞を進め、12ウェルプレートの各ウェルからの中間中胚葉誘導培地を1ミリリットルのトリプシンEDTAで交換し、摂氏37度で5分間インキュベートする。セルリフターを使用して細胞を穏やかにこすり、ピペッティングを使用して細胞を解離します。各ウェルに2ミリリットルのトリプシン中和溶液を加え、細胞を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。細胞懸濁液の容量をDMEM/F-12で50ミリリットルに構成し、200倍Gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、500マイクロリットルの中間中胚葉誘導培地に細胞を再懸濁して、約300万個の細胞を得ます。血球計算盤で細胞を数えます。チップを保持し、出口の周囲から培地を注意深く吸引しながら、チップの尿路に25マイクロリットルの細胞懸濁液をしっかりと注入します。気泡や不均一な細胞播種密度を確認します。チップホルダーカートリッジに3ミリリットルのPBSを加え、摂氏37度で3時間インキュベートします。インキュベーション後、両方のチャネルを200マイクロリットルのそれぞれの細胞培養培地で洗い流します。空のP200バリアチップを尿路と毛細血管チャネルの両方の出口に取り付けます。200マイクロリットルの内皮維持培地をピペットし、その半分をキャピラリーチャネル入口に注入する。ピペットチップをインレット内に外して、チャネルの入口と出口の両方が培地で満たされたピペットチップに取り付けられるようにします。200マイクロリットルの中間中胚葉維持培地を含む尿路入口に対してこの手順を繰り返します。チップを埋め込んだチップを摂氏37度で一晩インキュベートします。チップを臓器チップバイオリアクターに接続するには、まず、チャネルからP200チップを取り外します。乾燥を防ぐために、尿路と毛細血管チャネルの入口と出口にそれぞれの媒体の液滴を追加します。3ミリリットルの温かい足細胞誘導培地を尿入口リザーバーに追加し、3ミリリットルの温かい内皮維持培地をキャピラリーインレットリザーバーに追加します。300マイクロリットルのそれぞれの培地を出口ポートの真上の出口リザーバーに追加します。ポッドをトレイにスライドさせ、臓器チップバイオリアクターに入れます。回転式ダイヤルを使用してプライムサイクルを選択し、2分間開始します。ポッドの下側に、4つの流体ポートすべてに小さな液滴がないか目視検査します。ポッドの下側とマイクロ流体チップポートを流体間接触させるには、チップキャリアをポッドにゆっくりとスライドさせます。チップキャリアタブをゆっくりと押し込みます。チップの表面から余分な媒体を吸引します。臓器チップバイオリアクターの流量を毎時60マイクロリットルに設定します。周期ひずみを0.4ヘルツで10%に設定します。臓器チップバイオリアクターの回転ダイヤルを使用して調整サイクルを選択し、2時間実行します。出口リザーバーを目視検査して、媒体のレベルが上昇します。臓器チップバイオリアクターの回転ダイヤルを使用して、調整サイクルを選択します。培養17日目以降、毎日、ポートから斜め離れた尿路出口リザーバーから培地を吸引しますが、一部の培地をリザーバーに保持します。尿路入口リザーバーに、2日ごとに最大3ミリリットルの足細胞誘導培地を5日間補充します。5日後、尿路から培地を吸引しますが、一部の培地をリザーバーに保管します。尿路入口リザーバーに毎日3ミリリットルの足細胞維持培地を補充します。同様に、毛細管チャネル出口から培地を吸引し、内皮維持培地を毎日入口リザーバに補充する。このプロトコールを用いてヒト人工多能性幹細胞、血管内皮細胞および足細胞を増殖させることによる糸球体の機能的in vitroモデルを開発するために使用した。足細胞誘導および血管内皮増殖後21日目に、チップ内の細胞は、ポドサイトについてはポドシンおよびネフリン、血管内皮細胞についてはVEカドヘリンおよびPECAM-1などの系統識別マーカーを発現した。足細胞層と血管内皮細胞層の両方が、腎臓糸球体で最も豊富なGBMタンパク質であるコラーゲンIVを発現しました。糸球体チップは、イヌリンなどの小分子を毛細血管から尿路に選択的にろ過し、アルブミンなどの大きなタンパク質が毛細血管チャネルから出るのを防ぎ、選択的な分子ろ過機能を示しました。4〜7日目の内皮誘導中に、細胞数の増加は細胞の二次層をもたらす可能性がありますが、過剰播種は凝集を引き起こし、分化を妨げる可能性があります。PDMSチップコンポーネントの不十分な結合、流体流路の閉塞、またはろ過バリアの損傷の場合、尿路と毛細血管チャネル間の予期しない流体クロスフローが観察される可能性があります。内皮と上皮を播種し、15日目以降からチップを維持する場合、すべてのステップでチャネル内の気泡を目視検査することが重要です。同質遺伝子糸球体チップでは、臨床的に関連する薬物候補を投与して、それらの治療可能性または毒性レベルを試験することができる。この技術は現在、ヒト腎臓病の遺伝的基盤を理解し、個別化された治療法を開発する機会を開きます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

人間歯槽骨膜から骨膜由来細胞の骨形成促進活性に及ぼすビタミン D の間葉系幹細胞の分離

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

生体内心筋修復用ヒトiPS細胞由来のメッシュ状の設計心臓組織の調製

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

多能性幹細胞からのヒト血管オルガノイドの作製

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...