Name: isogenic kidney glomerulus chip engineered from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2022-11-04T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Escola Pratt de Engenharia da Duke University, pela Divisão de Nefrologia do Departamento de Medicina de Duke, por uma Bolsa de Estudos Whitehead em Pesquisa Biomédica e por um Prêmio de Pesquisa Genentech para S. Musah. Y. Roye recebeu a Duke University-Alfred P. Sloan Foundation Scholarship e William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship do Departamento de Engenharia Biomédica da Duke University. A linhagem celular iPS DU11 (Duke University clone #11) foi gerada no Duke iPSC Core Facility e fornecida a nós pelo Bursac Lab da Duke University. Os autores agradecem a N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya e Y. Zhou pela assistência técnica e discussões úteis. Os autores também gostariam de agradecer aos membros do Musah Lab por comentários úteis sobre o manuscrito. Os autores agradecem ao Laboratório Segura pela doação de um citômetro de fluxo Acuri C6.

1. Preparar soluções de matriz de membrana basal e substratos revestidos
<ol><li>Descongelar a matriz da membrana basal 1 durante a noite sobre gelo a 4 °C. Alíquota de acordo com a sugestão do fabricante para a razão de diluição. Usando um tubo cônico de 50 mL e pipeta, misture cuidadosamente uma quantidade apropriada de matriz de membrana basal 1 em 25 mL de DMEM/F12 frio até descongelar completamente e dissolver.<ol><li>Para dissolver uma alíquota congelada, tome ~200 μL dos 25 mL de DM...

<ol>
	<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disease+model+of+diabetic+nephropathy+in+a+glomerulus-on-a-chip+microdevice.">A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice.</a> Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).</li><li>Petrosyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glomerulus-on-a-chip+to+recapitulate+the+human+glomerular+filtration+barrier.">A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier.</a> Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).</li><li>Hass, R., Kasper, C., B&#246;hm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC):+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC.">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).</li><li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+when+do+differences+make+a+difference.">Cellular heterogeneity: when do differences make a difference.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Da Sacco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+cultured+podocytes.">A novel source of cultured podocytes.</a> PloS One. 8 (12), 81812 (2013).</li><li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+applications+in+regenerative+medicine,+disease+modeling,+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).</li><li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. 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(161), e61299 (2020).</li><li>Roye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+personalized+glomerulus+chip+engineered+from+stem+cell-derived+epithelium+and+vascular+endothelium.">A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium.</a> Micromachines. 12 (8), 967 (2021).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin+localizes+in+the+kidney+to+the+slit+diaphragm+area.">Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area.</a> The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).</li><li>Ruotsalainen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+is+specifically+located+at+the+slit+diaphragm+of+glomerular+podocytes.">Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).</li><li>Privratsky, J. 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Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).</li><li>Atchison, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+endothelial+cells+affect+vascular+function+in+a+tissue-engineered+blood+vessel+model+of+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome.">iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).</li></ol>

Neste relatório, delineamos um protocolo para derivar o endotélio vascular e o epitélio glomerular (podócitos) de uma linhagem celular iPS humana isogênica e o uso dessas células para projetar um sistema de órgão em um chip 3D que imita a estrutura, a interface tecido-tecido e a função de filtração molecular do glomérulo renal. Este chip de glomérulo é equipado com endotélio e epitélio glomerular que, juntos, fornecem uma barreira para filtrar seletivamente as moléculas. 
Os ...

Os dispositivos organ-on-a-chip são modelos dinâmicos 3D in vitro que empregam estimulação molecular e mecânica, bem como vascularização, para formar interfaces tecido-tecido que modelam a estrutura e a função de órgãos específicos. Dispositivos organ-on-a-chip previamente estabelecidos que visavam recapitular o glomérulo do rim (chips de glomérulo) consistiam em linhagens celulares animais1 ou linhagens celulares primárias e imortalizadas humanas de fontes heterogêneas 2,3. O uso de fontes celulares geneticamente heterogêneas apresenta variações que limitam significativamente os estudos de respostas específicas do paciente e genética ou mecanismos da doença 4,5. Enfrentar esse desafio depende da disponibilidade de linhagens celulares isogênicas originárias de indivíduos específicos com perfis moleculares e genéticos preservados para fornecer um microambiente mais preciso para a engenharia de modelos in vitro 2,3,6. Linhagens celulares isogênicas de origem humana agora podem ser facilmente geradas devido aos avanços na cultura de células iPS humanas. Como as células iPS humanas são tipicamente de origem não invasiva, podem se auto-renovar indefinidamente e se diferenciar em quase qualquer tipo de célula, elas servem como uma fonte atraente de células para o estabelecimento de modelos in vitro, como o chip glomérulo 7,8. A barreira de filtração glomerular é o principal local para a filtração do sangue. O sangue é primeiro filtrado através do endotélio vascular, da membrana basal glomerular e, finalmente, através do epitélio especializado chamado podócitos. Todos os três componentes da barreira de filtração contribuem para a filtração seletiva de moléculas. Apresentamos aqui um protocolo para estabelecer um dispositivo organ-on-a-chip em interface com endotélio vascular e epitélio glomerular a partir de uma única fonte de célula iPS humana. Embora este protocolo seja especialmente útil para projetar um chip isogênico e vascularizado para recapitular a barreira de filtração glomerular, ele também fornece um modelo para o desenvolvimento de outros tipos de órgãos personalizados em chips e plataformas multi-órgãos, como um sistema isogênico "corpo-em-um-chip".
O protocolo aqui descrito começa com a diferenciação divergente de células iPS humanas em duas linhagens separadas - mesoderma lateral e mesoderma, que são posteriormente diferenciadas em endotélio vascular e epitélio glomerular, respectivamente. Para gerar células mesodérmicas laterais, as células iPS humanas foram semeadas em placas revestidas de matriz de membrana basal 1 e cultivadas por 3 dias (sem troca de mídia) em meio N2B27 suplementado com o ativador Wnt, CHIR 99021, e o potente indutor mesodérmico, osso-morfogenético 4 (BMP4). As células mesodérmicas laterais resultantes foram previamente caracterizadas pela expressão de braquiúria (T), homeobox pareada mista (MIXL) e eomesodermina (EOMES)9. Posteriormente, as células mesodérmicas laterais foram cultivadas por 4 dias em meio suplementado com VEGF165 e Forskolin para induzir células endoteliais vasculares que foram classificadas com base na expressão de VE-Caderrina e/ou PECAM-1 usando classificação celular ativada por magnetismo (MACS). As células endoteliais vasculares resultantes (viEC) foram expandidas cultivando-as em frascos de matriz de membrana basal de 3 revestimentos até estarem prontas para semear no dispositivo microfluídico.
Para gerar células mesodérmicas, células iPS humanas foram semeadas em placas revestidas de 2 placas revestidas de matriz de membrana basal e cultivadas por 2 dias em meio contendo Activin A e CHIR99021. As células mesodérmicas resultantes foram caracterizadas pela expressão de HAND1, goosecoid e brachury (T), conforme descrito anteriormente 2,10,11. Para induzir a diferenciação celular do mesoderma intermediário (IM), as células mesodérmicas foram cultivadas por 14 dias em meio suplementado com BMP-7 e CHIR99021. As células IM resultantes expressam o Tumor de Wilm 1 (WT1), o gene caixa emparelhada 2 (PAX2) e a proteína relacionada 1 (OSR-1)2,10,11.
Um chip microfluídico à base de polidimetilsiloxano (PDMS) de dois canais foi projetado para recapitular a estrutura da barreira de filtração glomerular in vitro. O canal urinário é de 1.000 μm x 1.000 μm (a x h) e a dimensão do canal capilar é de 1.000 μm x 200 μm (a x h). Os ciclos cíclicos de alongamento e relaxamento foram facilitados pelas câmaras ocas presentes em cada lado dos canais fluídicos. As células foram semeadas em uma membrana PDMS flexível (50 μm de espessura) que separa os canais urinário e capilar. A membrana é equipada com poros hexagonais (7 μm de diâmetro, 40 μm de distância) para ajudar a promover a sinalização intercelular (Figura 1A)2,12. Dois dias antes da indução do MI ser concluída, os cavacos microfluídicos foram revestidos com matriz de membrana basal 2. viECs foram semeados no canal capilar do chip microfluídico usando meio de Manutenção Endotelial 1 dia antes da indução IM ser concluída, e o chip foi virado de cabeça para baixo para permitir a adesão celular no lado basal da membrana PDMS revestida de ECM. No dia em que a indução do IM foi concluída, as células foram semeadas no canal urinário do chip microfluídico usando um meio suplementado com BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 e todo o ácido retinóico trans para induzir a diferenciação de podócitos dentro do chip. No dia seguinte, os reservatórios do meio foram preenchidos com meio de Indução de Podócito e meio de Manutenção Endotelial, e 10% de deformação mecânica a 0,4 Hz e fluxo de fluido (60 μL/h) foram aplicados aos chips.
Os chips microfluídicos celularizados foram cultivados por mais 5 dias utilizando meio de Indução de Podócito (no canal urinário) e meio de Manutenção Endotelial (no canal vascular). Os chips de glomérulo renal resultantes foram cultivados por até 7 dias adicionais em meios de manutenção para as células podócitas e endoteliais. Os podócitos diferenciados expressaram positivamente proteínas específicas da linhagem, incluindo podocina e nefrina 13,14, enquanto os viECs expressaram positivamente as proteínas de identificação de linhagem PECAM-1 e VE-Caderina, todas moléculas essenciais para a manutenção da integridade da barreira de filtração glomerular 15,16 . Verificou-se que os podócitos e os viECs secretam a proteína da membrana basal glomerular mais abundante, o colágeno IV, que também é importante para a maturação e função do tecido.
Descobriu-se que o sistema de três componentes da barreira de filtração - endotélio, membrana basal e epitélio - nos chips de glomérulo filtrava seletivamente as moléculas e respondia a um tratamento medicamentoso nefrotóxico quimioterápico. Os resultados do tratamento medicamentoso indicaram que o chip de glomérulo pode ser usado para estudos de nefrotoxicidade e para modelagem de doenças. Este protocolo fornece a diretriz geral para a engenharia de um chip funcional de glomérulo renal microfluídico a partir de derivados isogênicos de células iPS. Análises a jusante do chip de engenharia podem ser realizadas conforme desejado pelo pesquisador. Para obter mais informações sobre o uso do chip glomérulo para modelar a lesão glomerular induzida por medicamentos, consulte publicações anteriores 2,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>14-9871-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP-N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podocin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Fibronectin, Human</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>Basement membrane (3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td>
			<td>Iwai North America</td>
			<td>N8922012</td>
			<td>Basement membrane matrix (2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU11 human iPS cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium growth factors and media supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A23017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x) without Vitamin A</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete medium kit with CultureBoost-R</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-500-R</td>
			<td>Podocyte maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10565042</td>
			<td>DMEM/F12 with glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin (Adenylyl cyclase activator)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP4</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>120-05ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP7</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin-FITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05850</td>
			<td>Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Lateral mesoderm basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin, liquid (100x)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y27632)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10639011</td>
			<td>Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 &#176;C or -20 &#176;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-Beta inhibitor (SB431542)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes and other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Suloxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97065-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 0.05%</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Orb) Hub module</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>ORB-HM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15 mm round petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB087579B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 x 120 mm square cell culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipettes, individually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29442-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating Unit</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F19917-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B99516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M7000</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td>Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>51030403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera</td>
			<td>Carl Zeiss Micrscopy</td>
			<td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>40101-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leoca SP8 Upright Confocal Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir (POD Portable Module)</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>POD-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ-chip</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>S-1 Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ-chip holder</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>AK-CCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 precision barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Asher</td>
			<td>Quorum tech</td>
			<td>K1050X RF</td>
			<td>This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University&#39;s Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip, 0.22 &#181;m, PES</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1138W14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75cm2 cell culture flask with vent cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated 12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated 6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module)</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>ZOE-CM1</td>
			<td>Organ Chip Bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-126-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-beveled cell lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBead Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isogenic kidney glomerulus chip engineered from human induced pluripotent stem cells

A doença renal crônica (DRC) afeta 15% da população adulta dos EUA, mas o estabelecimento de terapias direcionadas tem sido limitado pela falta de modelos funcionais que possam prever com precisão as respostas biológicas humanas e a nefrotoxicidade. Os avanços na medicina de precisão renal podem ajudar a superar essas limitações. No entanto, modelos in vitro previamente estabelecidos do glomérulo renal humano - o local primário para a filtração do sangue e um alvo-chave de muitas doenças e toxicidades de drogas - normalmente empregam populações celulares heterogêneas com características funcionais limitadas e antecedentes genéticos incomparáveis. Essas características limitam significativamente sua aplicação para modelagem de doenças específicas do paciente e descoberta terapêutica. 
Este trabalho apresenta um protocolo que integra o epitélio glomerular derivado de células-tronco pluripotente induzido por humanos (iPS) (podócitos) e endotélio vascular de um único paciente para projetar um chip de glomérulo renal microfluídico isogênico e vascularizado. O chip glomérulo resultante é composto de camadas de células endoteliais e epiteliais derivadas de células-tronco que expressam marcadores específicos de linhagem, produzem proteínas da membrana basal e formam uma interface tecido-tecido semelhante à barreira de filtração glomerular do rim. O chip de glomérulo modificado filtra seletivamente moléculas e recapitula a lesão renal induzida por drogas. A capacidade de reconstituir a estrutura e a função do glomérulo renal usando tipos de células isogênicas cria a oportunidade de modelar a doença renal com a especificidade do paciente e avançar a utilidade de órgãos em chips para medicina de precisão renal e aplicações relacionadas.

Aqui mostramos que um modelo funcional 3D in vitro do glomérulo pode ser vascularizado e epitelizado a partir de uma fonte isogênica de células iPS humanas. Especificamente, este protocolo fornece instruções sobre como aplicar a tecnologia de células iPS humanas, particularmente sua capacidade de se diferenciar em tipos de células especializadas, para gerar epitélio glomerular renal (podócitos) e endotélio vascular (viECs) que podem ser integrados com dispositivos microfluídicos para modelar a estrutu...

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Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Apresentamos aqui um protocolo para projetar um sistema personalizado de organ-on-a-chip que recapitula a estrutura e a função da barreira de filtração glomerular renal, integrando células endoteliais epiteliais e vasculares geneticamente combinadas diferenciadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Este sistema de bioengenharia pode avançar a medicina de precisão renal e aplicações relacionadas.

Chip de glomérulo renal isogênico projetado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

O chip de glomérulo isogênico permitirá a modelagem de doenças específicas do paciente e testes de nefrotoxicidade e aplicações avançadas de medicina de precisão. O epitélio glomerular e o endotélio são derivados de uma única população de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou IPSCs. Os IPSCs possuem auto-renovação ilimitada e podem se diferenciar em quase qualquer tipo de célula.Esta técnica pode ser usada para avaliar fenótipos celulares patológicos e doenças. O chip de órgão específico do paciente também pode servir como uma plataforma para triagem de medicamentos e estudos mecanicistas. Este modelo pode ser aplicado ao desenvolvimento de um corpo em um sistema de chips personalizado para um paciente específico.Este sistema tem o potencial de prever respostas específicas do paciente antes do teste clínico. Comece adicionando suavemente 25 microlitros de matriz de membrana basal 2 solução ao canal urinário e 20 microlitros no canal capilar do chip. Pegue duas tampas de tubo cônicas estéreis de 15 mililitros e encha-as com 500 microlitros de água destilada estéril.Coloque a tampa na placa de Petri para evitar a secagem e coloque a tampa no prato. Incube-o a 37 graus Celsius durante a noite. Procedendo, aspirar o meio de frascos T75 contendo uma cultura de 15 dias de células endoteliais vasculares a 90% de confluência.Adicione cinco mililitros de tampão de descolamento celular e incube a 37 graus Celsius por cinco a sete minutos. Em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de DMEM / F-12. Centrífuga a 200 vezes G durante cinco minutos.Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 300 microlitros de meio de manutenção endotelial. Conte as células com um hemocitômetro para obter aproximadamente 2 milhões de células. Usando uma ponta de barreira P200, lave os canais superior e inferior do chip microfluídico com 200 microlitros de DMEM / F-12 enquanto aspira simultaneamente da periferia da tomada.Segure o chip firmemente com a ponta de barreira P200 presa ao aspirador longe da saída do canal inferior. Injete firmemente 20 microlitros da suspensão de células endoteliais vasculares no canal capilar do chip e aspirar cuidadosamente o meio da periferia da saída. Verifique sob o microscópio se há bolhas ou uma densidade de semeadura desigual.Inverta suavemente o chip para que as células possam aderir ao lado basal da membrana PDMS flexível. Coloque o chip no cartucho do suporte e adicione três mililitros de PBS no cartucho para evitar que a membrana seque. Incube o chip a 37 graus Celsius por três horas.Verifique o canal inferior sob o microscópio para uma camada confluente de células ligadas à membrana PDMS flexível. Lave as células desligadas adicionando 200 microlitros de meio de manutenção endotelial na entrada do canal inferior enquanto aspira da periferia da saída do canal capilar. Coloque o chip de volta no cartucho do suporte e incube a 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, lave suavemente o canal capilar com 200 microlitros de meio de manutenção endotelial. Lave o canal urinário com 200 microlitros de DMEM / F-12 e solte 50 microlitros de DMEM / F-12 nas portas de entrada e saída. Procedendo células mesodérmicas intermediárias, substituir o meio de indução mesoderma intermediário de cada poço da placa de 12 poços por um mililitro de tripsina EDTA e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.Raspe suavemente as células usando um elevador de células e dissociar as células usando pipetagem. Adicione dois mililitros de solução de neutralização de tripsina a cada poço e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros. Completar o volume da suspensão celular para 50 mililitros com DMEM/F-12 e centrifugar a 200 vezes G durante cinco minutos.Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 microlitros de meio intermediário de indução mesodérmica para obter aproximadamente 3 milhões de células. Conte as células com um hemocitômetro. Segure o chip e injete firmemente 25 microlitros de suspensão celular no canal urinário do chip enquanto aspira cuidadosamente o meio da periferia da tomada.Verifique se há bolhas ou densidade de semeadura de células irregulares. Adicione três mililitros de PBS no cartucho do suporte do chip e incube a 37 graus Celsius por três horas. Após a incubação, lavar ambos os canais com 200 microlitros de seu respectivo meio de cultura celular.Fixe as pontas de barreira P200 vazias em ambas as saídas dos canais urinário e capilar. Pipetar 200 microlitros de meio de manutenção endotelial e injetar metade dele na entrada do canal capilar. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada de tal forma que tanto a entrada quanto a saída do canal sejam presas às pontas da pipeta cheias de meio.Repita este procedimento para a entrada do canal urinário com 200 microlitros de meio intermediário de manutenção mesodérmica. Incube os chips com pontas embutidas a 37 graus Celsius durante a noite. Para conectar os chips ao biorreator de chip de órgão, primeiro, remova as pontas P200 dos canais.Adicione gotículas dos respectivos meios à entrada e saída dos canais urinário e capilar para evitar a secagem. Adicione três mililitros de meio de indução de podócitos quentes ao reservatório de entrada urinária e três mililitros de meio de manutenção endotelial quente ao reservatório de entrada capilar. Adicione 300 microlitros dos respectivos meios aos reservatórios de saída diretamente sobre a porta de saída.Deslize as cápsulas para a bandeja e para o biorreator do chip do órgão. Use o mostrador rotativo para selecionar e iniciar o ciclo principal por dois minutos. Inspecione visualmente a parte inferior do pod em busca de pequenas gotículas em todas as quatro portas fluídicas.Para obter contato fluido-fluido entre a parte inferior do pod e as portas do chip microfluídico, deslize suavemente o portador do chip para o pod. Pressione suavemente a aba do portador do chip para dentro e para cima. Aspirar o excesso de meio da superfície do chip.Defina a taxa de fluxo do biorreator do chip do órgão para 60 microlitros por hora. Defina a tensão cíclica para 10% a 0,4 hertz. Use o mostrador rotativo no biorreator do chip do órgão para selecionar o ciclo de regulação e funcionar por duas horas.Inspecione visualmente os reservatórios de saída para um aumento no nível do meio. Use o mostrador rotativo no biorreator do chip do órgão para selecionar o ciclo de regulação. Após o dia 17 de cultura, aspirar diariamente o meio dos reservatórios de saída do canal urinário diagonalmente longe do porto, mas manter algum meio no reservatório.Reabasteça o reservatório de entrada do canal urinário com até três mililitros de meio de indução de podócitos a cada dois dias durante cinco dias. Após cinco dias, aspirar o meio do canal urinário, mas manter algum meio no reservatório. Reabasteça o reservatório de entrada do canal urinário diariamente com três mililitros de meio de manutenção de podócitos.Da mesma forma, aspirar o meio da saída do canal capilar e reabastecer os reservatórios de entrada diariamente com meio de manutenção endotelial. Usando este protocolo, células-tronco pluripotentes induzidas por humanos foram usadas para desenvolver um modelo funcional in vitro do glomérulo propagando células endoteliais vasculares e podócitos. No dia 21, após a indução de podócitos e a propagação do endotélio vascular, as células dentro dos chips expressaram marcadores de identificação de linhagem como Podocin e Nefrina para podócitos, VE Caderina e PECAM-1 para células endoteliais vasculares.Tanto o podócito quanto as camadas de células endoteliais vasculares expressaram o colágeno IV, que é a proteína GBM mais abundante no glomérulo renal. Os chips de glomérulo filtraram seletivamente pequenas moléculas, como a inulina, do capilar para o canal urinário, evitando que grandes proteínas como a albumina deixassem o canal capilar, mostrando uma função de filtração molecular seletiva. Durante a indução endotelial nos dias quatro a sete, um aumento no número de células pode resultar em uma camada secundária de células, mas a semeadura excessiva pode causar agregação que pode impedir a diferenciação.Fluxo cruzado inesperado de fluido entre os canais urinário e capilar pode ser observado em caso de ligação inadequada dos componentes do chip PDMS, bloqueio no caminho do fluxo de fluido ou barreira de filtração comprometida. Ao semear endotélio e epitélio e manter os cavacos a partir dos dias 15, é importante inspecionar visualmente as bolhas de ar nos canais a cada passo. No chip isogênico de glomérulo, candidatos a medicamentos clinicamente relevantes podem ser administrados para testar seu potencial terapêutico ou níveis de toxicidade.Esta técnica agora abre oportunidades para entender a base genética da doença renal humana e desenvolver terapias personalizadas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Bioengenharia

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...