Name: intravitreal injections in the ovine eye
Uploaded: 2022-07-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravitreal Injections in the Ovine Eye at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) für seine Unterstützung bei der Erstellung dieses Protokolls und der Durchführung der von Murray et al.15 beschriebenen Injektionen. Die Autoren würdigen auch die Finanzierung durch CureKids New Zealand, die Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc und die Batten Disease Support and Research Association.

Alle experimentellen Protokolle wurden vom Lincoln University Animal Ethics Committee genehmigt und entsprechen den Richtlinien der US National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Tieren in der Forschung und dem New Zealand Animal Welfare Act (1999). Borderdale-Schafe wurden bei der Geburt14 diagnostiziert und auf Forschungsfarmen der Lincoln University gepflegt. Drei 3 Monate alte homozygote (CLN5-/-) Mutterschafe erhielten eine einzige IVT-Injektion in das linke Au...

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	<li>Himawan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+to+retinal+photoreceptors.">Drug delivery to retinal photoreceptors.</a> Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).</li><li>Murray, S. J., Mitchell, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+therapies+for+neuronal+ceroid+lipofuscinoses:+More+than+meets+the+eye.">Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye.</a> Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).</li><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).</li><li>Grzybowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=update+on+intravitreal+injections:+Euretina+expert+consensus+recommendations.">update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations.</a> Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).</li><li>Pavlou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+AAV+capsids+for+intravitreal+gene+therapy+of+photoreceptor+disorders.">Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).</li><li>Kousi, M., Lehesjoki, A. -. E., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+the+mutation+spectrum+and+clinical+correlations+of+over+360+mutations+in+eight+genes+that+underlie+the+neuronal+ceroid+lipofuscinoses.">Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).</li><li>Wibbeler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerliponase+alfa+for+the+treatment+of+atypical+phenotypes+of+CLN2+disease:+A+retrospective+case+series.">Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series.</a> Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+intraventricular+cerliponase+alfa+for+CLN2+disease.">Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).</li><li>Mitchell, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+monitoring+of+the+CNS+demonstrates+the+efficacy+of+gene+therapy+in+a+sheep+model+of+CLN5+Batten+disease.">Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease.</a> Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).</li><li>Murray, S. J., Mitchell, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+retinal+degeneration+in+ovine+models+of+CLN5+and+CLN6+neuronal+ceroid+lipofuscinoses.">Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).</li><li>Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroretinography+data+from+ovine+models+of+CLN5+and+CLN6+neuronal+ceroid+lipofuscinoses.">Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Data in Brief. 37, 107188 (2021).</li><li>Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+determination+and+allometric+prediction+of+vitreous+volume,+and+retina+and+lens+weights+in+G&#246;ttingen+minipigs.">Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in G&#246;ttingen minipigs.</a> Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).</li><li>Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+ganglion+cells+and+photoreceptors+in+the+sheep+retina.">Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).</li><li>Frugier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+large+animal+model+of+CLN5+neuronal+ceroid+lipofuscinosis+in+Borderdale+sheep+is+caused+by+a+nucleotide+substitution+at+a+consensus+splice+site+(c.571+1G&gt;A)+leading+to+excision+of+exon+3.">A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G&gt;A) leading to excision of exon 3.</a> Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).</li><li>Murray, S. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor-targeted+gene+delivery+using+intravitreally+administered+AAV+vectors+in+dogs.">Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs.</a> Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous.">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li><li>Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+visual+performance+with+intravitreal+administration+of+9-cis-retinal+in+Rpe65-mutant+dogs.">Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs.</a> Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).</li><li>Ross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+photoreceptor+transduction+efficacy+of+capsid-modified+adeno-associated+viral+vectors+following+intravitreal+and+subretinal+delivery+in+sheep.">Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep.</a> Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).</li><li>Kotterman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+neutralization+poses+a+barrier+to+intravitreal+adeno-associated+viral+vector+gene+delivery+to+non-human+primates.">Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates.</a> Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).</li><li>Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immune+responses+to+AAV+gene+therapy+in+the+ocular+compartment.">Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment.</a> Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).</li><li>Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -. Y., Kim, S. -. W., Huh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+hemorrhage+after+intravitreal+injection+of+anti-vascular+endothelial+growth+factor.">Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).</li><li>Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+needle+forces+and+acute+pressure+changes+during+intravitreal+injections.">Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).</li><li>Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+pressure+and+injection+forces+during+intravitreal+injection+into+enucleated+porcine+eyes.">Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).</li><li>Ross, M., Ofri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+retinal+gene+therapy:+Evolving+from+subretinal+to+intravitreal+vector+delivery.">The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery.</a> Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).</li><li>Henein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics+of+intravitreal+injections+into+liquid+vitreous+substitutes.">Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes.</a> Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).</li><li>Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+intraocular+pressure+variation+during+automatic+intravitreal+injections:+An+ex-vivo+experimental+study+using+porcine+eyes.">Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes.</a> PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).</li><li>Willekens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreally+injected+fluid+dispersion:+Importance+of+injection+technique.">Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).</li><li>Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+models+to+study+drug+delivery+barriers+in+the+posterior+segment+of+the+eye.">In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).</li><li>Kiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Considerations+for+Ocular+Gene+Therapy.+Adeno-associated+virus+vectors+offer+a+safe+and+effective+tool+for+gene+delivery.">Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery.</a> Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).</li><li>Kleine Holthaus, S. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+targeting+the+inner+retina+rescues+the+retinal+phenotype+in+a+mouse+model+of+CLN3+Batten+disease.">Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease.</a> Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).</li><li>Kleine Holthaus, S. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+brain-directed+gene+therapy+rescues+a+mouse+model+of+neurodegenerative+CLN6+Batten+disease.">Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease.</a> Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).</li></ol>

Intravitreale Injektionen sind eines der häufigsten chirurgischen Verfahren in der menschlichen Ophthalmologie und haben sich bei der Verabreichung von AAV-vermittelten Gentherapien an die Netzhaut von Schafen als wirksam erwiesen. Wir hatten zuvor die Wirksamkeit von AAV9 nachgewiesen. Die CLN5-Gentherapie führte intravitreal zur Abschwächung von Netzhautdysfunktion und Degeneration bei Schafen mit CLN5 NCL15. Es ist zu hoffen, dass sich auch die Übertragung dieses Verabreichungsweges an mens...

Mehrere Methoden können verwendet werden, um Therapeutika an die Netzhaut abzugeben, einschließlich intravitrealer (IVT), subretinaler, suprachoroidaler, periokularer oder topischer Verabreichung. Jeder Verabreichungsweg beinhaltet die Überwindung von Barrieren wie der Blut-Netzhaut-Schranke oder den inneren und äußeren Begrenzungsmembranen und hat je nach verabreichtem Arzneimittel und spezifischem Netzhautzielunterschiedliche Wirksamkeitsraten 1,2.
IVT Medikamentenabgabe beinhaltet eine Injektion in den Glaskörper des Auges, eine gallertartige Substanz, die die hintere Augenkammer besetzt. Die Hauptfunktion des Glaskörpers besteht darin, die Form der Augenkugel zu erhalten und Augengewebe wie Linse und Netzhaut an Ort und Stelle zu halten. Der Glaskörper besteht größtenteils aus Wasser, mit geringen Mengen an Kollagen, Hyaluronsäure und anderen nicht-kollagenen Proteinen3. Die IVT-Injektion ist ein einfaches und gebräuchliches Verfahren, das routinemäßig zur Behandlung einer Vielzahl von Augenerkrankungen angewendet wird, einschließlich altersbedingter Makuladegeneration, diabetischer Makulaödeme, diabetischer Retinopathie, Netzhautvenenverschluss und mehrerer erblicher Netzhautdystrophien 4,5.
Neuronale Ceroid-Lipofuszinosen (NCL; Batten-Krankheit) sind eine Gruppe von tödlichen lysosomalen Speicherkrankheiten, die eine schwere Degeneration des Gehirns und der Netzhaut verursachen. Derzeit sind 13 Varianten von NCL bekannt, die aus Mutationen in verschiedenen Genen (CLN1-8, CLN10-14) resultieren, die überwiegend Kinder betreffen, aber unterschiedliches Erkrankungsalter und Krankheitsschweregrad6 aufweisen. Die NCLs teilen gemeinsame progressive Symptome, einschließlich kognitivem und motorischem Verfall, Krampfanfällen und Sehverlust. Es gibt keine Heilung für NCL; Die gehirngesteuerte Enzymersatztherapie befindet sich jedoch derzeit in klinischen Studien für die CLN2-Krankheit7,8, und die AAV-vermittelte Gentherapie hat sich in präklinischen Studien als vielversprechend erwiesen, wobei eine klinische Studie für die CLN5-Gentherapie voraussichtlich 2022 beginnen wird 9,10.
Viele andere Arten entwickeln natürlich vorkommende Formen von NCL, einschließlich Katzen, Hunde, Schafe und Kühe. Zwei NCL-Schafmodelle werden derzeit in Neuseeland aktiv untersucht: ein CLN5-Krankheitsmodell bei Borderdale-Schafen und ein CLN6-Krankheitsmodell bei Schafen in South Hampshire. Betroffene Schafe weisen viele der klinischen und pathologischen Merkmale der menschlichen Krankheit auf, einschließlich Netzhautatrophie und Sehverlust10,11. Obwohl die gehirngesteuerte CLN5-Gentherapie bei Schafen mit CLN5-Krankheit Hirnatrophie und klinischen Verfall verhindern oder stoppen kann, verlieren die behandelten Schafe immer noch ihrSehvermögen 9. Dies unterstrich die Notwendigkeit, die Netzhaut zu behandeln, um das Sehvermögen zu erhalten und eine bessere Lebensqualität zu erhalten, was zur Erstellung eines Protokolls für die Augengentherapie bei Schafen führte.
Das Schafauge stellt aufgrund seiner Ähnlichkeit in den Augenkugelabmessungen, dem Glaskörper und der Netzhautstruktur10,12,13 ein gutes Modell des menschlichen Auges dar. Dieser Artikel beschreibt das chirurgische Protokoll für die IVT-Abgabe eines kleinen Volumens (≤100 μL) therapeutischen viralen Vektors an das Schafauge.

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		<tr>
			<td>1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle</td>
			<td>Fisher Scientific, Auckland, New Zealand</td>
			<td>05-561-28</td>
			<td>Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4323</td>
			<td>Autoclave tubes to sterilise prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine with gas bench and monitor&#160;</td>
			<td>Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic eye drops&#160;</td>
			<td>Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand</td>
			<td></td>
			<td>Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrightMount plus anti-fade mounting medium</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab103748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242; ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazepam sedative</td>
			<td>Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotracheal tubes</td>
			<td>Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom</td>
			<td></td>
			<td>Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye speculum</td>
			<td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>KP151/14</td>
			<td>Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenestrated surgical drape</td>
			<td>Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand</td>
			<td>DI583</td>
			<td>Or similar&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tips</td>
			<td>Interlab, Auckland, New Zealand</td>
			<td></td>
			<td>10, 200, and 1,000 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (37%)</td>
			<td>Fisher Scientific, Auckland, New Zealand</td>
			<td>AJA809-2.5PL</td>
			<td>Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>&#160;A-11012</td>
			<td>Use at a dilution of 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthetic</td>
			<td>Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl anesthetic/analgesic</td>
			<td>PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand</td>
			<td></td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laryngoscope (veterinary)</td>
			<td>KaWe Medical, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>Miller C blade, size 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles&#160;</td>
			<td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>302025</td>
			<td>BD Hypodermic Needles, or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-steroidal anti-inflammatory</td>
			<td>Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand</td>
			<td>49402/008</td>
			<td>Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toothed forceps</td>
			<td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>AB864/16</td>
			<td>Or similar&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toothed hemostat</td>
			<td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>AA150/12</td>
			<td>Or similar&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand</td>
			<td>16210072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen (medical)</td>
			<td>BOC Gas, Christchurch, New Zealand</td>
			<td></td>
			<td>D2 cylinder, gas code 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Sterile, filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine solution</td>
			<td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>005835</td>
			<td>Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP)</td>
			<td>Dako, Glostrup, Denmark</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>Use at a dilution of 1:2,500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5</td>
			<td>University of North Carolina Vector Core, NC, USA.</td>
			<td>scAAV9/CBh-oCLN5opt</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride 0.9% IV Solution</td>
			<td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>AHB1322</td>
			<td>Commercial name: Saline solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcutaneous antibiotics</td>
			<td>Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand</td>
			<td></td>
			<td>Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sharp blunt curved scissors&#160;</td>
			<td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>SSSHBLC130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe Luer Lock</td>
			<td>Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand</td>
			<td>SH159/SH160</td>
			<td>Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon Disinfectant Powder</td>
			<td>EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ</td>
			<td>28461115</td>
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intravitreal injections in the ovine eye

Es gibt mehrere Methoden für die Abgabe von Therapeutika an die Netzhaut, einschließlich intravitrealer (IVT), subretinaler, suprachoroidaler, periokularer oder topischer Verabreichung. IVT Medikamentenabgabe beinhaltet eine Injektion in den Glaskörper des Auges, eine gallertartige Substanz, die die hintere Augenkammer füllt und die Form der Augenkugel beibehält. Obwohl der IVT-Weg weniger spezifisch ausgerichtet ist als die subretinale Abgabe, ist er viel weniger invasiv und wird häufig in klinischen Umgebungen für eine Reihe von Augenerkrankungen eingesetzt. 
Wir haben zuvor die Wirksamkeit der intravitrealen Verabreichung eines Adeno-assoziierten Virus (AAV)-vermittelten Gentherapieprodukts (AAV9) nachgewiesen. CLN5) bei Schafen mit einer natürlich vorkommenden CLN5-Form der neuronalen Ceroid-Lipofuszinose (NCL). Betroffene Schafe erhielten eine IVT-Gentherapie auf einem Auge, wobei das andere unbehandelte Auge als interne Kontrolle diente. Die Netzhautstruktur und -funktion blieb im behandelten Auge bis zu 15 Monate nach der Behandlung erhalten, während das unbehandelte Auge während der postmortalen Untersuchung eine zunehmend abnehmende Funktion und eine schwere Atrophie zeigte. Basierend auf den Schafstudien wurde das Gentherapieprodukt CLN5 im September 2021 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als Kandidat für ein neues Prüfpräparat (IND) zugelassen. Dieser Artikel beschreibt das chirurgische Protokoll für die IVT-Verabreichung eines therapeutischen viralen Vektors an das Schafauge.

Die Wirksamkeit der IVT-Verabreichung eines CLN5-Gentherapievektors bei der Abschwächung von Netzhautdysfunktion und Degeneration bei Schafen mit CLN5 NCL wurde bereits von dieser Forschungsgruppe15 nachgewiesen. Die betroffenen Schafe erhielten eine einmalige 100 μL IVT-Injektion von CLN5, verpackt in einem AAV-Serotyp 9 (AAV9) Vektor (AAV9). CLN5) in ein Auge, wobei das kontralaterale Auge als unbehandelte innere Kontrolle dient. Das Sehvermögen wurde monatlich vom Injektionsalter (3 Monate) ...

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Intravitreal Injections in the Ovine Eye

Intravitreale Injektionen wurden im Schafauge mit dem Ziel durchgeführt, eine viral vermittelte Gentherapie an die Netzhaut zu verabreichen.

Intravitreale Injektionen in das Schafauge

There are several methods for the delivery of therapeutic agents to the retina, including intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, or ...

Intravitreale Injektionen können verwendet werden, um Therapeutika an die Netzhaut abzugeben. Ein Protokoll für intravitreale Injektionen in das Schafauge, als Modell des menschlichen Auges, wird hier vorgestellt. Intravitreale Injektionen sind viel weniger invasiv als andere Augeninjektionen.Intravitreale Injektionen können erfolgreich verwendet werden, um ein Gentherapieprodukt zu verabreichen und Netzhautdegeneration bei Schafen mit natürlich vorkommenden neuronalen Ceroid-Lipofuszinosen zu behandeln. Sobald das Schaf betäubt ist, beginnen Sie mit der aseptischen Desinfektion des zu injizierenden Auges, indem Sie es mit einer 20-Milliliter-Spritze mit 1 bis 5% Povidon-Jodlösung spülen. Positionieren Sie dann einen sterilen, fenestrierten chirurgischen Vorhang über dem Auge.Befestigen Sie ein Augenspekulum an den Augenlidern, um das Auge offen zu halten. Fassen Sie die bulbäre Bindehaut auf dem dorsalen lateralen Aspekt des Auges mit einer Pinzette und drehen Sie die Augenkugel ventromedial. Führen Sie die Nadel etwa sieben Millimeter hinter der Sklera auf der lateralen Seite des Auges ein und sind Sie nach hinten abgewinkelt, um die Linse zu vermeiden.Verabreichen Sie die einmalige Injektion von 100 Mikrolitern als Bolus, so nah wie möglich an der Netzhaut, ohne die Netzhautoberfläche zu stören. Spülen Sie das Auge mit etwa 10 bis 15 Milliliter 1 bis 5% Povidon-Jodlösung, gefolgt von 10 Milliliter Kochsalzlösung, bevor Sie das Spekulum entfernen und abdecken. Die Elektroretinographie-Analyse zeigte eine erhaltene Netzhautfunktion im behandelten Auge, während das unbehandelte Auge ähnlich wie bei CLN5-betroffenen Tieren abnahm.Die Netzhauthistologie war im behandelten Auge nahezu normalisiert und hatte eine Gesamtnetzhautdicke, die mit der gesunder Kontrolltiere in der zentralen Netzhaut vergleichbar war. Im Gegensatz dazu war die Dicke der unbehandelten Netzhaut vergleichbar mit CLN5-betroffenen Tieren. Die Expression des sauren Gliafibrillenproteins oder GFAP, ein Marker für Netzhautstress und Astroglia, war bei den behandelten Augen niedriger als bei den unbehandelten Augen, was darauf hindeutet, dass die krankheitsassoziierte Entzündung nach der Behandlung abgeschwächt wurde.Mit der Etablierung eines Protokolls für intravitreale Injektionen in das Schafauge konnten nun Schafe verwendet werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit vieler intravitreell verabreichter Therapeutika zu testen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Ein Maus-Modell der Cornea Pocket-Assay für die Angiogenese-Studie

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Forschung

Medizin

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Entwicklung eines Audio-based Virtual Gaming Umwelt mit Navigation Skills in the Blind Assist

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice

Heterotope Mucosal-Transplantationsverfahren für Direkt Drug Delivery zum Gehirn bei Mäusen

Delivery of therapeutics into the brain is impeded by the presence of the blood-brain barrier (BBB) which restricts the passage of polar and high ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Trabecular Meshwork Response to Pressure Elevation in the Living Human Eye

Trabekelnetzwerk Reaktion auf den Druck in der Elevation Wohnzimmer Menschliches Auge

The mechanical characteristics of the trabecular meshwork (TM) are linked to outflow resistance and intraocular pressure (IOP) regulation. The rationale ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Transvaginal Mesh Insertion in the Ovine Model

Transvaginal Mesh Insertion im Schaf-Modell

This protocol describes mesh insertion into the rectovaginal septum in sheep using a single vaginal incision technique, with and without the trocar-guided ...

Ovine Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Model Utilizing a Lateral Retroperitoneal Drill Bit Injury

Schaf-Lendenwirbelsäulen-Degenerationsmodell mit einer lateralen Retroperitoneal-Bohrer-Verletzung

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to the development of back pain and the leading cause of disability worldwide. Numerous ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

Höchste Auflösung Maus optische Kohärenztomographie, intraokulare Injektion in die retinale Gentherapie Forschung unterstützen

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...