Name: electroporation-mediated delivery of cas9 ribonucleoproteins and mrna into freshly isolated primary mouse hepatocytes
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes at JoVE.com

RNC erhielt Mittel vom South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilot Grant, unterstützt vom National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) der National Institutes of Health, der American Association for the Study of Liver Diseases Foundation und der American Society of Gene & Cell Therapy unter den Fördernummern P30 GM131959, 2021000920, bzw. 2022000099. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht notwendigerweise die offiziellen Ansichten der American Society of Gene & Cell Therapy oder der American Association for the Study of Liver Diseases Foundation dar. Der Schaltplan für Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Die Tierversuche wurden alle in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee und den genehmigten Protokollen der Clemson University durchgeführt. Chirurgische Eingriffe wurden bei anästhesierten Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen im Alter zwischen 8 und 10 Wochen durchgeführt.
1. Tierchirurgie
<ol><li>Vorbereitung von Lösungen und Instrumenten HINWEIS: Perfusionslösungen und Anästhesie-Cocktail-Rezepte sind in der Materialtabell...

<ol>
	<li>Pampols, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+metabolic+rare+disease.">Inherited metabolic rare disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).</li><li>Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approach+to+treatable+inborn+metabolic+diseases:+an+introduction.">Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).</li><li>Arnon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation+in+children+with+metabolic+diseases:+the+studies+of+pediatric+liver+transplantation+experience.">Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience.</a> Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).</li><li>Maiorana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preemptive+liver+transplantation+in+a+child+with+familial+hypercholesterolemia.">Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia.</a> Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).</li><li>. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver Available from: <a target="_blank" href="https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx">https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx</a> (2019)</li><li>Fabris, L., Strazzabosco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+and+undiagnosed+liver+diseases:+challenges+and+opportunities.">Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities.</a> Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).</li><li>Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+translational+models+for+rare+liver+diseases.">In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+notch+ligand+Jagged1.">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li><li>Lima, A., Maddalo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEMMs:+Somatically+engineered+mouse+models.+a+new+tool+for+in+vivo+disease+modeling+for+basic+and+translational+research.">SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+modification+of+wild-type+induced+pluripotent+stem+cells+to+the+natural+CCR5Delta32+mutation+confers+resistance+to+HIV+infection.">Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).</li><li>Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+knock-down+in+post-mitotic+neurons.">CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons.</a> PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).</li><li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+correction+of+the+sickle+mutation+in+human+CD34++cells.">CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells.</a> Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).</li><li>Rathbone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-mediated+delivery+of+Cas9+ribonucleoproteins+results+in+high+levels+of+gene+editing+in+primary+hepatocytes.">Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes.</a> The CRISPR Journal. , (2022).</li><li>. Benchling [Biology Software] Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2022)</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).</li><li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes:+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development.">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease.">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+printing+of+mouse+primary+hepatocytes+to+generate+3D+hepatic+structure.">Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure.</a> Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Lattanzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CRISPR/Cas9+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+for+therapeutic+genomic+rearrangements.">Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements.</a> Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).</li><li>Dever, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells.">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).</li><li>Grompe, M., Tanguay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).</li></ol>

Die im Protokoll für die Hepatozytenisolierung beschriebenen Schritte sind eine Herausforderung und erfordern Übung für die Kenntnisse. Es gibt mehrere wichtige Schritte für die erfolgreiche Hepatozytenisolierung aus der Leber. Erstens ist die richtige Kanülierung der unteren Hohlvene für eine vollständige Leberdurchblutung unerlässlich. Das Fehlen einer Blanchierung in der Leber nach der Perfusion deutet auf eine Verschiebung des Katheters hin (Tabelle 1). Die Vena cava inferior (retrograde Perf...

IMDs der Leber sind genetische Störungen, die durch den Mangel an einem entscheidenden Leberenzym gekennzeichnet sind, das am Stoffwechsel beteiligt ist und zur Ansammlung toxischer Metaboliten führt. Ohne Behandlung führen IMDs der Leber zu Organversagen oder vorzeitigem Tod 1,2. Die einzige kurative Option für Patienten mit IMDs der Leber ist die orthotope Lebertransplantation, die aufgrund der geringen Verfügbarkeit von Spenderorganen und Komplikationen durch die immunsuppressive Therapie nach dem Verfahrenbegrenzt ist 3,4. Nach jüngsten Daten, die vom Organbeschaffungs- und Transplantationsnetzwerk gesammelt wurden, erhalten nur 40% -46% der erwachsenen Patienten auf der Warteliste für Lebertransplantationen ein Organ, während 12,3% dieser Patienten sterben, während sie auf der Wartelistestehen 5. Darüber hinaus haben nur 5% aller seltenen Lebererkrankungen eine von der FDA zugelassene Behandlung6. Es ist klar, dass es einen kritischen Bedarf an neuartigen Behandlungen für IMDs der Leber gibt. Es bedarf jedoch geeigneter Krankheitsmodelle, um neue Therapieoptionen zu entwickeln.
Die Modellierung menschlicher Krankheiten mit In-vitro- und In-vivo-Systemen bleibt ein Hindernis für die Entwicklung wirksamer Therapien und die Untersuchung der Pathologie von IMDs der Leber. Hepatozyten von Patienten mit seltenen Lebererkrankungen sind schwierig zu erhalten7. Tiermodelle sind entscheidend für die Entwicklung eines Verständnisses der Krankheitspathologie und für die Erprobung therapeutischer Strategien. Ein Hindernis ist jedoch die Generierung von Modellen aus Embryonen, die tödliche Mutationen tragen. Zum Beispiel führten Versuche, Mausmodelle des Alagille-Syndroms (ALGS) mit Embryonen zu erstellen, die homozygote Deletionen einer 5-kb-Sequenz in der Nähe des 5'-Endes des Jag1-Gens enthielten, zum frühen Tod der Embryonen8. Darüber hinaus kann die Generierung von Mausmodellen durch Gen-Editing in embryonalen Stammzellen zeit- und ressourcenintensiv sein9. Schließlich treten Mutationen außerhalb des Zielgewebes auf, was zu Störvariablen führt, die die Untersuchung der Krankheit behindern können9. Die somatische Genbearbeitung würde eine einfachere Bearbeitung im Lebergewebe ermöglichen und die Herausforderungen umgehen, die mit der Generierung von Modellen unter Verwendung embryonaler Stammzellen verbunden sind.
Die Elektroporation ermöglicht die Abgabe von CRISPR-Cas9 direkt in den Kern durch Anlegen von Hochspannungsströmen zur Permeabilisierung der Zellmembran und ist mit vielen Zelltypen kompatibel, einschließlich solcher, die für Transfektionstechniken unnachgiebig sind, wie menschliche embryonale Stammzellen, pluripotente Stammzellen und Neuronen10,11,12 . Eine geringe Lebensfähigkeit ist jedoch ein potenzieller Nachteil der Elektroporation. Die Optimierung des Verfahrens kann zu hohen Abgabemengen führen und gleichzeitig die Toxizität begrenzen13. Eine aktuelle Studie zeigt die Machbarkeit der Elektroporation von CRISPR-Cas9-Komponenten in primäre Maus- und humane Hepatozyten als hocheffizienten Ansatz14. Die Ex-vivo-Elektroporation in Hepatozyten hat das Potenzial, angewendet zu werden, um neue Mausmodelle für menschliche IMDs der Leber zu generieren.
Dieses Protokoll bietet ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Isolierung von Maushepatozyten aus der Leber und zur anschließenden Elektroporatierung von CRISPR-Cas9 als RLP-Komplexe, bestehend aus Cas9-Protein und synthetischer Single-Guide-RNA (sgRNA) oder Cas9-mRNA in Kombination mit sgRNA, um ein hohes Maß an On-Target-Gen-Editierung zu erhalten. Darüber hinaus bietet das Protokoll Methoden zur Quantifizierung der Gen-Editing-Effizienz, Lebensfähigkeit und Funktionalität nach der Elektroporation von CRISPR-Cas9 in frisch isolierte Maushepatozyten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Collagen Plates</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescent Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ART Wide BORE filtered tips 1,000 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079GPK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Wax Dissection Tray</td>
			<td>Braintree Scientific Inc.</td>
			<td>DTW1</td>
			<td>9&#34; x 6.5&#34; x 1/2&#34;+F21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper/lifter</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>UX-04396-53</td>
			<td>Non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>62131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>100mm,sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>35mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>250082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell strainer (70 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>61864</td>
			<td>Euro-Med Adson Tissue Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheters&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td>24 G x 0.75 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV infusion set</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2C6401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge 12 Mini Centrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>1220P38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-20</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>&#160;HV-77120-42</td>
			<td>10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision pump tubing</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-14</td>
			<td>25 ft, silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Culture Plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353846</td>
			<td>Nitrogen-containing tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets (25 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-567-604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329464</td>
			<td>1 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ALT</td>
			<td>27577</td>
			<td>Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnologies</td>
			<td>L-7606-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap&#160;EGFP mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnologies</td>
			<td>L-7201-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885076</td>
			<td>Low glucose, pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71001-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Maintenance Medium (MM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>MM250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Plating Medium (PM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>MP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0010653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPL-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq HotStart DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0481L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>No calcium or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (PVP solution)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-500790A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7875-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen Corporation</td>
			<td>QE05090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s fuchsin-sulfite reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant MTT Cell Viability Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V13154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14155063</td>
			<td>Complete to 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (0.5 M)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>40520008-1</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (pH 7.3, 1 M)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td>2 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H20 (1.8 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>360 &#181;L of 1 M stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-155-063</td>
			<td>Complete to 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td>2 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H20 (0.8 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30391-25G</td>
			<td>160 &#181;L of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Solution 3&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared fresh prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>0.094 Wunsch units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anesthetic Cocktail&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromzine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25 mg/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mg/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5 mg/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling</td>
			<td>https://www.benchling.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
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			<td>TIDE: Tracking of Indels by Decomposition</td>
			<td>https://tide.nki.nl/</td>
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electroporation-mediated delivery of cas9 ribonucleoproteins and mrna into freshly isolated primary mouse hepatocytes

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und effektive Methode zur Isolierung primärer Maushepatozyten, gefolgt von einer elektroporationsvermittelten Abgabe von CRISPR-Cas9 als Ribonukleoproteine (RNPs) und mRNA. Primäre Maushepatozyten wurden mit einer dreistufigen retrograden Perfusionsmethode isoliert, was zu hohen Ausbeuten von bis zu 50 × 106 Zellen pro Leber und einer Zelllebensfähigkeit von >85% führte. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zum Plattieren, Färben und Kultivieren von Hepatozyten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Elektroporation eine hohe Transfektionseffizienz von 89% bietet, gemessen am Prozentsatz an grün fluoreszierenden Proteinen (GFP)-positiven Zellen und einer bescheidenen Zelllebensfähigkeit von >35% in Maushepatozyten.
Um den Nutzen dieses Ansatzes zu demonstrieren, wurde CRISPR-Cas9, das auf das Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase-Gen abzielte, in primäre Maushepatozyten als Proof-of-Principle-Gen-Editing elektropoliert, um ein therapeutisches Gen zu stören, das mit einer vererbten Stoffwechselerkrankung (IMD) der Leber zusammenhängt. Eine höhere On-Target-Editierung von 78% wurde für RNPs beobachtet, verglichen mit 47% Editiereffizienz mit mRNA. Die Funktionalität von Hepatozyten wurde in vitro unter Verwendung eines Albumin-Assays bewertet, der darauf hindeutete, dass die Abgabe von CRISPR-Cas9 als RNPs und mRNA zu einer vergleichbaren Zelllebensfähigkeit in primären Maus-Hepatozyten führt. Eine vielversprechende Anwendung für dieses Protokoll ist die Erstellung von Mausmodellen für menschliche genetische Erkrankungen, die die Leber betreffen.

Isolierung von plateablen primären Hepatozyten aus der Leber Der Gesamtprozess der Leberperfusion und Hepatozytenisolierung ist in Abbildung 1 dargestellt. In diesem Experiment wurden Wildtyp-, 8-10 Wochen alte C57BL6/6J-Mäuse verwendet. Es wird erwartet, dass das Verfahren 20-50 × 10 6 Zellen pro Maus mit einer Lebensfähigkeit zwischen 85% und 95% liefert. Wenn die Lebensfähigkeit <70% beträgt, sollte die Percoll-Behandlung befolgt werden, um abgestorben...

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Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Isolierung primärer Maushepatozyten aus der Leber und zur Elektropolatierung von CRISPR-Cas9 als Ribonukleoproteine und mRNA, um ein therapeutisches Zielgen zu stören, das mit einer erblichen Stoffwechselerkrankung der Leber assoziiert ist. Die beschriebenen Methoden führen zu einer hohen Lebensfähigkeit und einem hohen Grad an Genmodifikation nach der Elektroporation.

Elektroporationsvermittelte Abgabe von Cas9-Ribonukleoproteinen und mRNA in frisch isolierte primäre Maus-Hepatozyten

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass es sich um einen einfachen, schnellen und reproduzierbaren Ansatz zur Bearbeitung von Genen in primären Maushepatozyten handelt, um in vitro und in vivo Krankheitsmodelle zu generieren. Mit unserer Technik könnte es möglich sein, ein Zielgen in isolierten Hepatozyten niederzuschlagen und sie dann wieder in den Patienten zu transplantieren, um kranke Zellen durch geneditierte Hepatozyten zu ersetzen Unerfahrene Forscher könnten mit der Kanülierung und der Aufrechterhaltung des Katheters während der gesamten Perfusion zu kämpfen haben. Den Benutzern wird empfohlen, das Verfahren und die Methoden zur Fehlerbehebung sorgfältig zu lesen und zu üben, bevor sie beginnen.Die Leberperfusion und Hepatozytenisolierung demonstrieren Tina Parker, eine klinische Facility Managerin, und Ilayda Ates, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin. Das Elektroporationsverfahren wird von Callie Stuart, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert. Unter einer chirurgischen Anästhesieebene.Beginnen Sie die Leberperfusion, indem Sie mit einer Schere einen U-förmigen seitlichen Schnitt in die Bauchhaut machen und das Loch durch die Seiten erweitern. Öffnen Sie die Haut weiter zum Brustkorb. Schneiden Sie mit einer Schere durch das Peritoneum, um die Bauchhöhle bis zum Brustkorb freizulegen.Achten Sie darauf, keine Organe zu schneiden. Bewegen Sie den Darm mit der Rückseite der Pinzette oder der stumpfen Oberfläche der Schere auf die rechte Seite. Identifizieren Sie die Pfortader und die Vena cava inferior.Starten Sie die Pumpe, um die vorgewärmte Perfusionslösung durch den Katheter zu spülen. Stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie den Katheter. Führen Sie dann die Spitze der Nadel, die mit dem Katheter verbunden ist, in einem Winkel von 10 bis 20 Grad zur Vene in die untere Hohlvene ein und entfernen Sie die Nadel aus dem Katheter.Drücken Sie dann den Katheter vorsichtig in einer Bewegung parallel zur Vene in die Vene. Verbinden Sie den Schlauch mit dem Katheter, ohne den Katheter weiter in die Vene zu bewegen. Starten Sie die Pumpe mit einer Fördermenge von zwei Milliliter pro Minute.Suchen Sie nach der Leber, die sofort blass wird, als Zeichen dafür, dass die Durchblutung erfolgreich ist. Schneiden Sie die Portalvene mit einer Schere ab. Erhöhen Sie die Durchflussrate schrittweise auf fünf Milliliter pro Minute.Sobald die Perfusionslösung drei durchfließt, überwachen Sie sorgfältig die Elastizität der Leber. Um festzustellen, ob die Leber weich geworden ist, drücken Sie die Leber vorsichtig mit einem Wattestäbchen oder einer Pinzette und prüfen Sie, ob sich Vertiefungen auf der Leber bilden. Achten Sie darauf, nicht zu perfundiert, um einen Verlust der Zelllebensfähigkeit zu vermeiden.Sobald die Leber erweicht ist, nachdem 30 bis 50 Milliliter Perfusionslösung drei durchgeflossen sind, stoppen Sie die Pumpe, entfernen Sie den Katheter und die Gallenblase. Achten Sie darauf, den Inhalt nicht zu verschütten. Dann sezieren Sie vorsichtig die Leber.Geben Sie die Leber in eine 100 Millimeter Petrischale mit eiskaltem DME M mit 10% FBS-Medium. Schwenken Sie die Petrischale vorsichtig, um mögliche Blutgerinnsel zu entfernen. Übertragen Sie die Leber in eine neue Petrischale, die eiskaltes DME M und 10% FBS-Medium enthält.Um Zellen aus der Leberkapsel freizusetzen, legen Sie die Petrischale auf Eis und reißen Sie die Leberkapsel vorsichtig mit zwei sterilen Pinzettenpaaren an allen Lappen auseinander. Wirbeln Sie die Leber vorsichtig im Medium mit einem Zelllifter herum, um die Hepatozyten freizusetzen. Setzen Sie diese Bewegung fort, bis die Leber sehr klein wird und die Suspension braun und undurchsichtig wird.Entfernen Sie die Lebergewebereste von der Platte und geben Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer auf niedrige Geschwindigkeit eingestellten 25-Milliliter-serologischen Pipette in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen über, das auf Eis vorgekühlt und mit einem 100-Mikrometer-Zellsieb ausgestattet ist. Fügen Sie frisches eiskaltes DMEM und 10% FBS-Medium in die Petrischale hinzu, um die verbleibenden Zellen von der Oberfläche auszuwaschen und zu sammeln. Dann in das 50 Milliliter konische Rohr überführen.Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Zellen gesammelt sind. Um Hepatozyten aus nicht-parenchymalen Zellen zu waschen und zu reinigen, zentrifugieren Sie die im 50-Milliliter-Konikusröhrchen gesammelten Zellen bei 50 RCF bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang bei geringer Verzögerung oder ohne Unterbrechungen. Entsorgen Sie das Super-Naton, das Trümmer und nicht-parenchymale Zellen enthält.Suspendieren Sie dann das Pellet im übrig gebliebenen Super-Naton, indem Sie das Röhrchen vorsichtig schwenken. Nach der Pellet-Resuspension 30 Milliliter frisches eiskaltes DMEM und 10% FBS-Medium hinzufügen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der CRISPR CAS 9-Substrate, Medien, Zellen und des Elektroporationsinstruments, indem Sie den Netzschalter am Elektroporationsgerät einschalten.Stellen Sie dann das Elektroporationsprogramm ein, indem Sie die X-Taste und dann die Pfeiltaste nach unten drücken, bis das Programm T 0 28 auf dem Bildschirm erscheint. Vorbereitung der Zielvertiefungen für die elektropolierten Hepatozyten durch Zugabe von 1,5 Milliliter PM zu sechs gut kollagenbeschichteten Platten. Inkubieren Sie die Platten in einem 37-Grad-Inkubator, bis sie einsatzbereit sind.In PCR-Spaltstreifenröhrchen die CAS 9 RMP- und mRNA-Komplexe wie im Textmanuskript beschrieben hergestellt. Lagern Sie die mRNA SG RNA-Mischung bis zur Elektroporation auf Eis. Bereiten Sie separat ein Röhrchen mit einem Mikrogramm E G F P mRNA vor, um eine erfolgreiche Elektroporation mittels Fluoreszenzmikroskopie zu überprüfen.Zentrifugieren Sie die Elektroporationsreaktion bei 100 RCF für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Supernaton aus dem Zellpellet und fügen Sie 100 Mikroliter Nukleoffektionslösung pro Reaktion entlang der Seite der Röhrchenwand hinzu. Suspendieren Sie die Hepatozyten in der Elektroporationslösung, indem Sie das Rohr vorsichtig von Hand schaukeln.Sobald die Hepatozyten gleichmäßig in der Elektroporationslösung verteilt sind, werden 100 Mikroliter der Hepatozytensuspension in die Streifenröhrchen überführt, die die CAS-Neun-Komplexe enthalten. Den Inhalt der Streifenmulde in ein Elektroporationsgefäß überführen. Setzen Sie das Nukleo-Vet-Gefäß in den Schlitz des Elektroporationsgeräts ein.Elektropolieren Sie die Hepatozyten durch Drücken der X-Taste. Warten Sie nach der Elektroporation, bis auf dem Gerät ein Bildschirm mit der Aufschrift Okay angezeigt wird. Drücken Sie erneut die X-Taste und entfernen Sie das Gefäß.Inkubieren Sie das elektropolierte Gefäß 15 Minuten auf Eis. Fügen Sie dem Elektroporationsgefäß 500 Mikroliter eines vorbewaffneten PM hinzu. 300 Mikroliter der Elektroporationsreaktion auf der vorgewärmten Platte in jede Zielmulde überführen.Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie die Membranmatrix zu eiskaltem Hepatozyten-Erhaltungsmedium hinzu und mischen Sie, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Entfernen Sie das Medium 24 Stunden nach der Beschichtung der Zellen aus den Vertiefungen, die für die Gen-Editing-Analyse vorgesehen sind.Pipetten Sie die Overlay-Mischung langsam auf die Zellen und stellen Sie die Platte wieder auf 37 Grad Celsius. 24 Stunden nach der Beschichtung wird das konditionierte Medium aus der für MTT- und Albumintests vorgesehenen Bohrung überführt und in einem Mikrofugenröhrchen gelagert, bis der Albumintest durchgeführt werden kann. Fahren Sie mit der Analyse der CAS nine-Zielaktivität fort, indem Sie die genomische DNA extrahieren und die PCR wie im Textmanuskript beschrieben einrichten.Innerhalb von 3 bis 12 Stunden nach der Beschichtung hafteten die Hepatozyten an der Platte und die Zellmorphologie nahm innerhalb von 24 Stunden ein typisches polygonales oder hexagonales Aussehen an. Die Reinheit der isolierten Zellen wurde durch Glykogenfärbung mit dem periodischen Säureverschiebungsreagenz 24 Stunden nach der Beschichtung überprüft. Das Zytoplasma der gefärbten Hepatozyten erschien magenta. Die Hepatozyten wurden 24 Stunden nach der Elektroporation abgebildet und im Durchschnitt waren 89,8% der Hepatozyten GFP-positiv.Drei Tage nach der Elektroporation wurde CAS nine im HPD-Locus induziert und die Ergebnisse zeigten auf Zielindels von 47,4% in Hepatozyten, die mit CRISPR Cas elektropoliert wurden, neun mRNA und 78,4% Indels für die CAS neun RNP. Der MTT-Assay zeigte 35,4 und 45,9% Lebensfähigkeit in Hepatozyten, die mit CRISPR Cas nine mRNA und RN P behandelt wurden.In Übereinstimmung mit den MTT-Ergebnissen betrugen die normalisierten Albuminspiegel 31,8% in Hepatozyten, die mit CAS nine RNA behandelt wurden, und 34,5% in CAS nine r p. Das Wichtigste, woran man sich erinnern sollte, ist, dass die richtige Kanülierung alle späteren Schritte und den Erfolg des Verfahrens beeinflusst.Nach diesem Verfahren können die Hepatozyten transplantiert werden und Mäuse, um ihre Transplantate zu untersuchen. Darüber hinaus kann die genomische DNA von plattierten Hepatozyten extrahiert werden, um die Effizienz und Spezifität der CAS nine-Bearbeitung zu analysieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Forschung

Biotechnik

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Produktion von gentechnisch syrischen Goldhamster durch man Injektion des Komplexes CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Bearbeitung und Bewertung der menschlichen primäre Prostata organoide Kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Gekapselte Zelltechnologie für die Lieferung von Biologika an das Mausauge

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...