Name: electroporation-mediated delivery of cas9 ribonucleoproteins and mrna into freshly isolated primary mouse hepatocytes
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes at JoVE.com

RNC recibió fondos del Centro de Bioingeniería de Carolina del Sur de Regeneración y Formación de Tejidos Subvención Piloto apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) de los Institutos Nacionales de Salud, la Asociación Americana para el Estudio de Enfermedades Hepáticas y la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular bajo los números de subvención P30 GM131959, 2021000920, y 2022000099, respectivamente. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular o la Fundación de la Asociación Americana para el Estudio de Enfermedades Hepáticas. El esquema de la Figura 1 se creó con BioRender.com.

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y los protocolos aprobados en la Universidad de Clemson. Los procedimientos quirúrgicos se realizaron en ratones C57BL/6J de tipo salvaje anestesiados entre 8 y 10 semanas de edad.
1. Cirugía animal
<ol><li>Preparación de soluciones e instrumentos NOTA: Las soluciones de perfusión y las recetas de cócteles de anestesia se muestra...

<ol>
	<li>Pampols, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+metabolic+rare+disease.">Inherited metabolic rare disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).</li><li>Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approach+to+treatable+inborn+metabolic+diseases:+an+introduction.">Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).</li><li>Arnon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation+in+children+with+metabolic+diseases:+the+studies+of+pediatric+liver+transplantation+experience.">Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience.</a> Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).</li><li>Maiorana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preemptive+liver+transplantation+in+a+child+with+familial+hypercholesterolemia.">Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia.</a> Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).</li><li>. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+correction+of+the+sickle+mutation+in+human+CD34++cells.">CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells.</a> Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).</li><li>Rathbone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-mediated+delivery+of+Cas9+ribonucleoproteins+results+in+high+levels+of+gene+editing+in+primary+hepatocytes.">Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes.</a> The CRISPR Journal. , (2022).</li><li>. Benchling [Biology Software] Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2022)</li><li>Brinkman, E. 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(132), e56993 (2018).</li><li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).</li><li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes:+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development.">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells.">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).</li><li>Grompe, M., Tanguay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).</li></ol>

Los pasos descritos en el protocolo para el aislamiento de hepatocitos son desafiantes y requieren práctica para la competencia. Hay varios pasos clave para el aislamiento exitoso de hepatocitos del hígado. En primer lugar, la canulación adecuada de la vena cava inferior es esencial para la perfusión hepática completa. La ausencia de blanqueamiento en el hígado después de la perfusión indica desplazamiento del catéter (Tabla 1). La vena cava inferior (perfusión retrógrada) fue canulada en el p...

Los IMD del hígado son trastornos genéticos caracterizados por la deficiencia de una enzima hepática crucial involucrada en el metabolismo que conduce a la acumulación de metabolitos tóxicos. Sin tratamiento, las IMD del hígado resultan en insuficiencia orgánica o muerte prematura 1,2. La única opción curativa para los pacientes con IMD del hígado es el trasplante hepático ortotópico, que es limitado debido a la baja disponibilidad de órganos de donantes y las complicaciones de la terapia inmunosupresora después del procedimiento 3,4. Según datos recientes recopilados por la Red de Procuración y Trasplante de Órganos, solo el 40%-46% de los pacientes adultos en la lista de espera de trasplante hepático reciben un órgano, mientras que el 12,3% de estos pacientes mueren mientras están en la lista de espera5. Además, solo el 5% de todas las enfermedades hepáticas raras tienen un tratamiento aprobado por la FDA6. Está claro que existe una necesidad crítica de nuevos tratamientos para los IMD del hígado. Sin embargo, se requieren modelos de enfermedad apropiados para desarrollar nuevas opciones terapéuticas.
El modelado de enfermedades humanas utilizando sistemas in vitro e in vivo sigue siendo un obstáculo para desarrollar terapias efectivas y estudiar la patología de los IMD del hígado. Los hepatocitos de pacientes con enfermedades hepáticas raras son difíciles de obtener7. Los modelos animales son cruciales para desarrollar una comprensión de la patología de la enfermedad y para probar estrategias terapéuticas. Sin embargo, un obstáculo es la generación de modelos a partir de embriones portadores de mutaciones letales. Por ejemplo, los intentos de crear modelos de ratón del síndrome de Alagille (ALGS) con embriones que contienen deleciones homocigotas de una secuencia de 5 kb cerca del extremo 5′ del gen Jag1 resultaron en la muerte prematura de los embriones8. Además, la generación de modelos de ratón mediante edición de genes en células madre embrionarias puede requerir mucho tiempo y recursos9. Por último, aparecerán mutaciones fuera del tejido diana, dando lugar a variables de confusión que pueden impedir el estudio de la enfermedad9. La edición de genes somáticos permitiría una edición más fácil en el tejido hepático y evitaría los desafíos asociados con la generación de modelos utilizando células madre embrionarias.
La electroporación permite la entrega de CRISPR-Cas9 directamente en el núcleo mediante la aplicación de corrientes de alto voltaje para permeabilizar la membrana celular y es compatible con muchos tipos de células, incluidas aquellas que son intransigentes a las técnicas de transfección, como las células madre embrionarias humanas, las células madre pluripotentes y las neuronas 10,11,12 . Sin embargo, la baja viabilidad es un inconveniente potencial de la electroporación; la optimización del procedimiento puede producir altos niveles de administración al tiempo que limita la toxicidad13. Un estudio reciente demuestra la viabilidad de electroporar componentes CRISPR-Cas9 en hepatocitos primarios de ratón y humanos como un enfoque altamente eficiente14. La electroporación ex vivo en hepatocitos tiene el potencial de ser aplicada para generar nuevos modelos de ratón para IMD humanos del hígado.
Este protocolo proporciona un procedimiento detallado paso a paso para aislar hepatocitos de ratón del hígado y, posteriormente, electroporar CRISPR-Cas9 como complejos RNP, que consisten en proteína Cas9 y ARN sintético de guía única (sgRNA), o ARNm Cas9 combinado con sgRNA para obtener altos niveles de edición de genes en el objetivo. Además, el protocolo proporciona métodos para cuantificar la eficiencia, viabilidad y funcionalidad de la edición de genes después de la electroporación de CRISPR-Cas9 en hepatocitos de ratón recién aislados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Collagen Plates</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescent Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ART Wide BORE filtered tips 1,000 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079GPK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Wax Dissection Tray</td>
			<td>Braintree Scientific Inc.</td>
			<td>DTW1</td>
			<td>9&#34; x 6.5&#34; x 1/2&#34;+F21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper/lifter</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>UX-04396-53</td>
			<td>Non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>62131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>100mm,sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>35mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>250082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell strainer (70 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>61864</td>
			<td>Euro-Med Adson Tissue Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheters&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td>24 G x 0.75 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV infusion set</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2C6401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge 12 Mini Centrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>1220P38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-20</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>&#160;HV-77120-42</td>
			<td>10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision pump tubing</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-14</td>
			<td>25 ft, silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Culture Plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353846</td>
			<td>Nitrogen-containing tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets (25 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-567-604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329464</td>
			<td>1 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ALT</td>
			<td>27577</td>
			<td>Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnologies</td>
			<td>L-7606-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap&#160;EGFP mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnologies</td>
			<td>L-7201-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885076</td>
			<td>Low glucose, pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71001-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Maintenance Medium (MM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>MM250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Plating Medium (PM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>MP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0010653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPL-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq HotStart DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0481L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>No calcium or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (PVP solution)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-500790A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7875-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen Corporation</td>
			<td>QE05090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s fuchsin-sulfite reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant MTT Cell Viability Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V13154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14155063</td>
			<td>Complete to 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (0.5 M)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>40520008-1</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (pH 7.3, 1 M)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td>2 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H20 (1.8 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>360 &#181;L of 1 M stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-155-063</td>
			<td>Complete to 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td>2 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H20 (0.8 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30391-25G</td>
			<td>160 &#181;L of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Solution 3&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared fresh prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>0.094 Wunsch units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anesthetic Cocktail&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromzine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25 mg/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mg/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5 mg/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling</td>
			<td>https://www.benchling.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIDE: Tracking of Indels by Decomposition</td>
			<td>https://tide.nki.nl/</td>
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electroporation-mediated delivery of cas9 ribonucleoproteins and mrna into freshly isolated primary mouse hepatocytes

Este protocolo describe un método rápido y eficaz para aislar los hepatocitos primarios de ratón seguido de la administración mediada por electroporación de CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas (RNPs) y ARNm. Los hepatocitos primarios de ratón se aislaron utilizando un método de perfusión retrógrada de tres pasos, lo que resultó en altos rendimientos de hasta 50 × 106 células por hígado y una viabilidad celular de >85%. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas para el recubrimiento, tinción y cultivo de hepatocitos. Los resultados indican que la electroporación proporciona una alta eficiencia de transfección del 89%, medida por el porcentaje de células positivas para proteína fluorescente verde (GFP) y una viabilidad celular modesta de >35% en hepatocitos de ratón.
Para demostrar la utilidad de este enfoque, CRISPR-Cas9 dirigido al gen hidroxifenilpiruvato dioxigenasa se electroporó en hepatocitos primarios de ratón como prueba de principio de edición de genes para interrumpir un gen terapéutico relacionado con una enfermedad metabólica hereditaria (IMD) del hígado. Se observó una mayor edición en el objetivo del 78% para los RNP en comparación con la eficiencia de edición del 47% con ARNm. La funcionalidad de los hepatocitos se evaluó in vitro mediante un ensayo de albúmina que indicó que la administración de CRISPR-Cas9 como RNPs y ARNm da como resultado una viabilidad celular comparable en hepatocitos primarios de ratón. Una aplicación prometedora para este protocolo es la generación de modelos de ratón para enfermedades genéticas humanas que afectan al hígado.

Aislamiento de hepatocitos primarios plateables del hígado El proceso general de perfusión hepática y aislamiento de hepatocitos se ilustra en la Figura 1. En este experimento, se utilizaron ratones C57BL6 / 6J de tipo salvaje de 8 a 10 semanas de edad. Se espera que el procedimiento produzca 20-50 × 106 células por ratón con una viabilidad entre el 85% y el 95%. Si la viabilidad es <70%, se debe seguir el tratamiento con percoll para eliminar las célula...

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Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

Este protocolo describe técnicas para aislar hepatocitos primarios de ratón del hígado y electroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas y ARNm para interrumpir un gen diana terapéutico asociado con una enfermedad metabólica hereditaria del hígado. Los métodos descritos dan como resultado una alta viabilidad y altos niveles de modificación genética después de la electroporación.

Entrega mediada por electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm en hepatocitos primarios de ratón recién aislados

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

La principal ventaja de nuestra técnica es que es un enfoque fácil, rápido y reproducible para editar genes en hepatocitos primarios de ratón como una forma de generar modelos de enfermedades in vitro e in vivo. Usando nuestra técnica, puede ser posible derribar un gen objetivo en hepatocitos aislados y luego trasplantarlos nuevamente al paciente, para reemplazar las células enfermas con hepatocitos editados genéticamente. Los investigadores sin experiencia pueden tener dificultades con la canulación y mantener el catéter estable durante toda la perfusión. Se recomienda a los usuarios que lean y practiquen cuidadosamente el procedimiento y los métodos de solución de problemas antes de comenzar.Demostrando la perfusión hepática y el aislamiento de hepatocitos estarán Tina Parker, gerente de instalaciones clínicas, e Ilayda Ates, asistente de investigación graduada. El procedimiento de electroporación será demostrado por Callie Stuart, una asistente de investigación graduada de mi laboratorio. Bajo un plano quirúrgico de anestesia.Comience la perfusión hepática haciendo una incisión lateral en forma de U en la piel del abdomen con tijeras y expanda el orificio a través de los lados. Continúe abriendo la piel a la caja torácica. Con unas tijeras, corte a través del peritoneo para exponer la cavidad abdominal hasta la caja torácica.Tener cuidado de no cortar ningún órgano. Mueva los intestinos hacia el lado derecho usando la parte posterior de los fórceps o la superficie roma de las tijeras. Identificar la vena porta y la vena cava inferior.Encienda la bomba para enjuagar la solución de perfusión precalentada a través del catéter. Detenga la bomba y retire el catéter. Luego inserte la punta de la aguja conectada al catéter en la vena cava inferior en un ángulo de 10 a 20 grados con respecto a la vena, retire la aguja del catéter.Luego, empuje suavemente el catéter dentro de la vena en un movimiento paralelo a la vena. Conecte el tubo al catéter sin mover el catéter más adentro de la vena. Arranque la bomba con un caudal de dos mililitros por minuto.Busque que el hígado se ponga pálido inmediatamente como una señal de que la perfusión es exitosa. Corte la vena porta con unas tijeras. Aumente gradualmente el caudal a cinco mililitros por minuto.Una vez que la solución de perfusión tres está fluyendo a través de cuidadosamente controlar la elasticidad del hígado. Para determinar si el hígado se ha ablandado, presione suavemente el hígado con un hisopo de algodón o fórceps y verifique si se forman hendiduras en el hígado. Tenga cuidado de no sobrefundir para evitar la pérdida de viabilidad celular.Una vez que el hígado se ablanda después de 30 a 50 mililitros de solución de perfusión, tres han fluido, detenga la bomba, retire el catéter y la vesícula biliar. Tenga cuidado de no derramar su contenido. Luego disecciona cuidadosamente el hígado.Coloque el hígado en una placa de Petri de 100 milímetros que contenga DME M helado con 10% de medio FBS. Agite la placa de Petri suavemente para eliminar posibles coágulos de sangre. Transfiera el hígado a una nueva placa de Petri que contenga DME M helado y 10% de FBS medio.Para liberar células de la cápsula hepática, coloque la placa de Petri en hielo y luego use dos pares de pinzas estériles, separe suavemente la cápsula hepática en todos los lóbulos. Agite suavemente el hígado alrededor del medio usando un elevador celular para liberar los hepatocitos. Continúe este movimiento hasta que el hígado se vuelva muy pequeño y la suspensión se vuelva marrón y opaca.Retire los restos de tejido hepático de la placa y, utilizando una pipeta serológica de 25 mililitros ajustada a baja velocidad, transfiera cuidadosamente la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros preenfriado en hielo y equipado con un filtro celular de 100 micrómetros. Agregue DMEM fresco helado y 10% de medio FBS a la placa de Petri para lavar y recoger las células restantes de la superficie. Luego, transfiera al tubo cónico de 50 mililitros.Repita este paso hasta que se recopilen todas las celdas. Para lavar y purificar los hepatocitos de las células no parenquimatosas, centrifugar las células recogidas en el tubo cónico de 50 mililitros a 50 RCF a cuatro grados centígrados durante cinco minutos a baja desaceleración o sin interrupciones. Deseche el super-natón que contiene desechos y células no parenquimatosas.Luego vuelva a suspender el pellet en el super-naton sobrante girando suavemente el tubo. Después de la resuspensión de pellets, agregue 30 mililitros de DMEM fresco helado y 10% FBS medio. Comience a preparar los sustratos CRISPR CAS 9, los medios, las células y el instrumento de electroporación encendiendo el botón de encendido del dispositivo de electroporación.A continuación, configure el programa de electroporación pulsando el botón X y, a continuación, el botón de flecha hacia abajo hasta que aparezca el programa T 0 28 en la pantalla. Se prepararon los pozos de destino para los hepatocitos electroporados agregando 1,5 mililitros de PM a seis placas de colágeno bien recubiertas. Incubar las placas en una incubadora de 37 grados centígrados hasta que estén listas para usar.En tubos de tira dividida por PCR, prepare los complejos CAS 9 RMP y mRNA como se describe en el manuscrito de texto. Guarde la mezcla de ARN sg de ARN mN EN HIELO hasta la electroporación. Por separado, prepare un tubo que contenga un microgramo de ARNm de E G F P para verificar la electroporación exitosa utilizando microscopía de fluorescencia.Centrifugar la reacción de electroporación a 100 RCF durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenado del pellet celular y agregue 100 microlitros de solución de nucleoffección por reacción a lo largo del lado de la pared del tubo. Vuelva a suspender los hepatocitos en la solución de electroporación balanceando el tubo suavemente con la mano.Una vez que los hepatocitos estén dispersos uniformemente en la solución de electroporación, transfiera 100 microlitros de la suspensión de hepatocitos a los tubos de tira que contienen los nueve complejos CAS. Transfiera el contenido del pozo de la tira a un recipiente de electroporación. Coloque el vaso nucleo-veterinario en la ranura del dispositivo de electroporación.Electroporar los hepatocitos pulsando el botón X. Después de la electroporación, espere a que aparezca una pantalla en el dispositivo que diga: Está bien. Presione el botón X nuevamente y retire el recipiente.Incubar el recipiente electroporado en hielo durante 15 minutos. Agregue 500 microlitros de PM armado previamente al recipiente de electroporación. Transfiera 300 microlitros de la reacción de electroporación a cada pozo de destino en la placa precalentada.Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Agregue la matriz de membrana al medio de mantenimiento de hepatocitos helado y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Retire el medio de los pocillos designados para el análisis de edición de genes 24 horas después de colocar las células.Pipetea la mezcla de recubrimiento lentamente sobre las celdas y vuelve a colocar la placa a 37 grados centígrados. A las 24 horas después del recubrimiento, transfiera el medio acondicionado del pocillo designado para los ensayos de MTT y albúmina y guárdelo en un tubo de microfuga hasta que esté listo para realizar el ensayo de albúmina. Proceda con el análisis de la actividad CAS nueve objetivo extrayendo el ADN genómico y configurando la PCR como se describe en el manuscrito de texto.Dentro de las 3 a 12 horas posteriores al recubrimiento, los hepatocitos se adhirieron a la placa y la morfología celular asumió una apariencia poligonal o hexagonal típica dentro de las 24 horas. La pureza de las células aisladas se verificó mediante tinción de glucógeno utilizando el reactivo de cambio ácido periódico a las 24 horas después del recubrimiento. El citoplasma de los hepatocitos teñidos parecía magenta. Los hepatocitos fueron fotografiados 24 horas después de la electroporación y, en promedio, el 89,8% de los hepatocitos fueron GFP positivos.A los tres días después de la electroporación se analizaron nueve inducidos en el locus HPD y los resultados mostraron en el objetivo indeles de 47,4% en hepatocitos electroporados con CRISPR Cas nueve ARNm y 78,4% indels para el CAS nueve RNP. El ensayo MTT mostró una viabilidad del 35,4 y 45,9% en hepatocitos tratados con CRISPR Cas nueve ARNm y R N P.De acuerdo con los resultados de MTT, los niveles normalizados de albúmina fueron del 31,8% en los hepatocitos tratados con ARN de nueve CAS y del 34,5% para CAS nueve rp. Lo más importante a recordar es que la canulación adecuada afecta todos los pasos posteriores y el éxito del procedimiento.Después de este procedimiento, los hepatocitos pueden ser trasplantados y ratones para investigar sus injertos. Además, el ADN genómico de los hepatocitos plateados se puede extraer para analizar la eficiencia y la especificidad de la edición de CAS nueve.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Investigación

Bioingeniería

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Silicio Poroso micropartículas para la entrega de siRNA Terapéutica

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

La entrega de proteínas, péptidos o impermeable a las células pequeñas moléculas en células vivas por incubación con el reactivo endosomolítico dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Fabricación y entrega de medicamentos Aplicaciones de seda nanopartículas

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Producción de hámsters sirios dorados genéticamente por inyección Pronuclear del complejo CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Manejo y evaluación de la cultura humana organoide de próstata primario

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Tecnología celular encapsulada para la entrega de productos biológicos al ojo del ratón

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...