Name: electroporation-mediated delivery of cas9 ribonucleoproteins and mrna into freshly isolated primary mouse hepatocytes
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes at JoVE.com

RNC fick finansiering från South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilotbidrag med stöd av National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) vid National Institutes of Health, American Association for the Study of Liver Diseases Foundation och American Society of Gene &Cell Therapy under bidragsnummer P30 GM131959, 2021000920, respektive 2022000099. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från American Society of Gene &Cell Therapy eller American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Schemat för bild 1 skapades med BioRender.com.

Djurförsöken utfördes alla i enlighet med riktlinjerna från institutional animal care and use committee och godkända protokoll vid Clemson University. Kirurgiska ingrepp utfördes på bedövade vildtyp C57BL / 6J möss mellan 8 och 10 veckor gamla.
1. Djurkirurgi
<ol><li>Förberedelse av lösningar och instrument OBS: Perfusionslösningar och recept för anestesicocktail visas i materialtabellen.<ol><li>Förbered perfusionslösning 1 (HEPES, EGTA och...

<ol>
	<li>Pampols, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+metabolic+rare+disease.">Inherited metabolic rare disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).</li><li>Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approach+to+treatable+inborn+metabolic+diseases:+an+introduction.">Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).</li><li>Arnon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation+in+children+with+metabolic+diseases:+the+studies+of+pediatric+liver+transplantation+experience.">Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience.</a> Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).</li><li>Maiorana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preemptive+liver+transplantation+in+a+child+with+familial+hypercholesterolemia.">Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia.</a> Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).</li><li>. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver Available from: <a target="_blank" href="https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx">https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx</a> (2019)</li><li>Fabris, L., Strazzabosco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+and+undiagnosed+liver+diseases:+challenges+and+opportunities.">Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities.</a> Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).</li><li>Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+translational+models+for+rare+liver+diseases.">In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+notch+ligand+Jagged1.">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li><li>Lima, A., Maddalo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEMMs:+Somatically+engineered+mouse+models.+a+new+tool+for+in+vivo+disease+modeling+for+basic+and+translational+research.">SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+modification+of+wild-type+induced+pluripotent+stem+cells+to+the+natural+CCR5Delta32+mutation+confers+resistance+to+HIV+infection.">Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).</li><li>Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+knock-down+in+post-mitotic+neurons.">CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons.</a> PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).</li><li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+correction+of+the+sickle+mutation+in+human+CD34++cells.">CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells.</a> Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).</li><li>Rathbone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-mediated+delivery+of+Cas9+ribonucleoproteins+results+in+high+levels+of+gene+editing+in+primary+hepatocytes.">Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes.</a> The CRISPR Journal. , (2022).</li><li>. Benchling [Biology Software] Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2022)</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion.">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).</li><li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes:+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development.">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease.">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+printing+of+mouse+primary+hepatocytes+to+generate+3D+hepatic+structure.">Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure.</a> Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Lattanzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CRISPR/Cas9+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+for+therapeutic+genomic+rearrangements.">Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements.</a> Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).</li><li>Dever, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells.">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).</li><li>Grompe, M., Tanguay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).</li></ol>

Stegen som beskrivs i protokollet för hepatocytisolering är utmanande och kräver övning för färdighet. Det finns flera viktiga steg för framgångsrik hepatocytisolering från levern. För det första är korrekt kannulering av den underlägsna vena cava avgörande för fullständig leverperfusion. Frånvaron av blanchering i levern efter perfusion indikerar förskjutning av katetern (tabell 1). Den underlägsna vena cava (retrograd perfusion) kannulerades i proceduren eftersom den är enklare och ...

IMD i levern är genetiska störningar som kännetecknas av bristen på ett avgörande leverenzym som är involverat i ämnesomsättningen som leder till ackumulering av toxiska metaboliter. Utan behandling leder IMD i levern till organsvikt eller för tidig död 1,2. Det enda botande alternativet för patienter med IMD i levern är ortotopisk levertransplantation, som är begränsad på grund av den låga tillgängligheten av donatororgan och komplikationer från immunsuppressiv behandling efter proceduren 3,4. Enligt de senaste uppgifterna som samlats in av Organ Procurement and Transplantation Network får endast 40%-46% av vuxna patienter på väntelistan för levertransplantation ett organ, medan 12,3% av dessa patienter dör medan de är på väntelistan5. Dessutom har endast 5% av alla sällsynta leversjukdomar en FDA-godkänd behandling6. Det är uppenbart att det finns ett kritiskt behov av nya behandlingar för IMD i levern. Lämpliga sjukdomsmodeller krävs dock för att utveckla nya terapeutiska alternativ.
Modellering av mänskliga sjukdomar med hjälp av in vitro- och in vivo-system är fortfarande ett hinder för att utveckla effektiva terapier och studera patologin för IMD i levern. Hepatocyter från patienter med sällsynta leversjukdomar är utmanande att få7. Djurmodeller är avgörande för att utveckla en förståelse för sjukdomspatologi och för att testa terapeutiska strategier. Ett hinder är dock att generera modeller från embryon som bär på dödliga mutationer. Till exempel resulterade försök att skapa musmodeller av Alagilles syndrom (ALGS) med embryon som innehåller homozygota deletioner av en 5 kb-sekvens nära 5′-änden av Jag1-genen i den tidiga döden avembryona 8. Dessutom kan det vara tids- och resurskrävande att generera musmodeller genom genredigering i embryonala stamceller9. Slutligen kommer mutationer att visas utanför den riktade vävnaden, vilket leder till förvirrande variabler som kan hindra studier av sjukdomen9. Somatisk genredigering skulle möjliggöra enklare redigering i levervävnad och kringgå utmaningarna med att generera modeller med embryonala stamceller.
Elektroporering möjliggör leverans av CRISPR-Cas9 direkt in i kärnan genom att applicera högspänningsströmmar för att permeabilisera cellmembranet och är kompatibel med många celltyper, inklusive de som är oförsonliga för transfektionstekniker, såsom mänskliga embryonala stamceller, pluripotenta stamceller och neuroner 10,11,12 . Emellertid är låg livskraft en potentiell nackdel med elektroporering; optimering av proceduren kan ge höga leveransnivåer samtidigt som toxicitetenbegränsas 13. En nyligen genomförd studie visar möjligheten att elektroporera CRISPR-Cas9-komponenter i primära mus- och humana hepatocyter som ett mycket effektivt tillvägagångssätt14. Ex vivo elektroporering i hepatocyter har potential att tillämpas för att generera nya musmodeller för humana IMD i levern.
Detta protokoll tillhandahåller en detaljerad steg-för-steg-procedur för att isolera mushepatocyter från levern och därefter elektroporera CRISPR-Cas9 som RNP-komplex, bestående av Cas9-protein och syntetiskt enledar-RNA (sgRNA), eller Cas9 mRNA kombinerat med sgRNA för att erhålla höga nivåer av genredigering på målet. Dessutom tillhandahåller protokollet metoder för att kvantifiera genredigeringseffektivitet, viabilitet och funktionalitet efter elektroporering av CRISPR-Cas9 till nyligen isolerade mushepatocyter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Collagen Plates</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescent Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ART Wide BORE filtered tips 1,000 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079GPK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Wax Dissection Tray</td>
			<td>Braintree Scientific Inc.</td>
			<td>DTW1</td>
			<td>9&#34; x 6.5&#34; x 1/2&#34;+F21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper/lifter</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>UX-04396-53</td>
			<td>Non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>62131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>100mm,sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>35mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>250082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell strainer (70 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>61864</td>
			<td>Euro-Med Adson Tissue Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheters&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td>24 G x 0.75 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV infusion set</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2C6401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge 12 Mini Centrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>1220P38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-561-20</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>&#160;HV-77120-42</td>
			<td>10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision pump tubing</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-14</td>
			<td>25 ft, silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Culture Plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353846</td>
			<td>Nitrogen-containing tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets (25 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-567-604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329464</td>
			<td>1 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ALT</td>
			<td>27577</td>
			<td>Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnologies</td>
			<td>L-7606-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap&#160;EGFP mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnologies</td>
			<td>L-7201-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885076</td>
			<td>Low glucose, pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71001-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Maintenance Medium (MM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>MM250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Plating Medium (PM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>MP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0010653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPL-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq HotStart DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0481L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>No calcium or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (PVP solution)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-500790A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7875-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen Corporation</td>
			<td>QE05090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s fuchsin-sulfite reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant MTT Cell Viability Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V13154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14155063</td>
			<td>Complete to 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (0.5 M)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>40520008-1</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (pH 7.3, 1 M)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td>2 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H20 (1.8 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>360 &#181;L of 1 M stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-155-063</td>
			<td>Complete to 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td>2 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H20 (0.8 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30391-25G</td>
			<td>160 &#181;L of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Solution 3&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared fresh prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>0.094 Wunsch units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anesthetic Cocktail&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromzine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25 mg/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mg/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5 mg/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling</td>
			<td>https://www.benchling.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIDE: Tracking of Indels by Decomposition</td>
			<td>https://tide.nki.nl/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-mediated delivery of cas9 ribonucleoproteins and mrna into freshly isolated primary mouse hepatocytes

Detta protokoll beskriver en snabb och effektiv metod för att isolera primära mushepatocyter följt av elektroporationsmedierad leverans av CRISPR-Cas9 som ribonukleoproteiner (RPP) och mRNA. Primära mushepatocyter isolerades med hjälp av en trestegs retrograd perfusionsmetod som resulterade i höga utbyten på upp till 50 × 106 celler per lever och cellviabilitet på >85%. Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner för plätering, färgning och odling av hepatocyter. Resultaten indikerar att elektroporering ger en hög transfektionseffektivitet på 89%, mätt med andelen gröna fluorescerande protein (GFP) -positiva celler och blygsam cellviabilitet på >35% i mushepatocyter.
För att demonstrera nyttan av detta tillvägagångssätt elektroporerades CRISPR-Cas9 riktad mot hydroxifenylpyruvatdioxygenenen till primära mushepatocyter som proof-of-principle-genredigering för att störa en terapeutisk gen relaterad till en ärftlig metabolisk sjukdom (IMD) i levern. En högre målredigering på 78% observerades för RPP jämfört med 47% redigeringseffektivitet med mRNA. Funktionaliteten hos hepatocyter utvärderades in vitro med hjälp av en albuminanalys som indikerade att leverans av CRISPR-Cas9 som RPP och mRNA resulterar i jämförbar cellviabilitet i primära mushepatocyter. En lovande applikation för detta protokoll är generering av musmodeller för mänskliga genetiska sjukdomar som påverkar levern.

Isolering av pläterbara primära hepatocyter från levern Den övergripande processen för leverperfusion och hepatocytisolering illustreras i figur 1. I detta experiment användes vildtypiga, 8-10 veckor gamla C57BL6 / 6J-möss. Förfarandet förväntas ge 20-50 × 106 celler per mus med en livskraft mellan 85% och 95%. Om livskraften är <70% bör percoll-behandling följas för att avlägsna döda celler. Nyligen isolerade hepatocyter bör pläteras på kol...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

Detta protokoll beskriver tekniker för att isolera primära mushepatocyter från levern och elektroporera CRISPR-Cas9 som ribonukleoproteiner och mRNA för att störa en terapeutisk målgen associerad med en ärftlig metabolisk sjukdom i levern. De beskrivna metoderna resulterar i hög viabilitet och höga nivåer av genmodifiering efter elektroporering.

Elektroporeringsmedierad leverans av Cas9 Ribonukleoproteiner och mRNA i nyligen isolerade primära mushepatocyter

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

Den största fördelen med vår teknik är att det är ett enkelt, snabbt och reproducerbart tillvägagångssätt för att redigera gener i primära mushepatocyter som ett sätt att generera in vitro- och in vivo-sjukdomsmodeller. Med hjälp av vår teknik kan det vara möjligt att slå ner en målgen i isolerade hepatocyter och sedan transplantera dem tillbaka till patienten, för att ersätta sjuka celler med genredigerade hepatocyter Oerfarna forskare kan kämpa med kannulering och hålla katetern stadig under hela perfusionen. Användarna rekommenderas att noggrant läsa och öva på proceduren och felsökningsmetoderna innan de börjar.Att demonstrera leverperfusion och hepatocytisolering kommer att vara Tina Parker en klinisk anläggningschef och Ilayda Ates, en forskarassistent. Elektroporeringsproceduren kommer att demonstreras av Callie Stuart, en forskarassistent från mitt laboratorium. Under ett kirurgiskt anestesiplan.Börja leverperfusionen genom att göra ett U-format lateralt snitt i bukhuden med sax och expandera hålet genom sidorna. Fortsätt öppna huden mot bröstkorgen. Skär genom bukhinnan med sax för att exponera bukhålan upp till bröstkorgen.Var noga med att inte nicka några organ. Flytta tarmarna till höger sida med baksidan av pincett eller saxens trubbiga yta. Identifiera portalvenen och den underlägsna vena cava.Starta pumpen för att spola förvärmd perfusionslösning genom katetern. Stoppa pumpen och ta bort katetern. För sedan in spetsen på nålen som är ansluten till katetern i den underlägsna vena cava i en 10 till 20 graders vinkel mot venen, ta bort nålen från katetern.Tryck sedan försiktigt katetern i venen i en rörelse parallellt med venen. Anslut slangen till katetern utan att flytta katetern längre in i venen. Starta pumpen med en flödeshastighet på två milliliter per minut.Leta efter levern som omedelbart blir blek som ett tecken på att perfusionen är framgångsrik. Klipp portalvenen med sax. Gradvis öka flödeshastigheten till fem milliliter per minut.När perfusionslösningen tre flyter igenom noggrant övervaka leverns elasticitet. För att avgöra om levern har mjuknat, tryck försiktigt på levern med en bomullspinne eller pincett och kontrollera om indragningar bildas på levern. Var försiktig så att du inte överdriver för mycket för att undvika förlust av cellviabilitet.När levern mjuknar efter att 30 till 50 ml perfusionslösning tre har runnit igenom, stoppa pumpen, ta bort katetern och gallblåsan. Var försiktig så att du inte spiller innehållet. Dissekera sedan försiktigt levern.Placera levern i en 100 millimeter petriskål som innehåller iskall DME M med 10% FBS-medium. Virvla petriskålen försiktigt för att ta bort eventuella blodproppar. Överför levern till en ny petriskål som innehåller iskall DME M och 10% FBS-medium.För att frigöra celler från leverkapseln, placera petriskålen på is och använd sedan två par sterila pincett, riv försiktigt isär leverkapseln på alla lober. Virvla försiktigt runt levern i mediet med hjälp av en celllyftare för att frigöra hepatocyterna. Fortsätt denna rörelse tills levern blir mycket liten och suspensionen blir brun och ogenomskinlig.Ta bort levervävnadsresterna från plattan och använd en 25 ml serologisk pipett inställd på låg hastighet, överför försiktigt cellsuspensionen till ett 50 ml koniskt rör som är förkylt på is och försedd med en 100 mikrometer cellsil. Tillsätt färsk iskall DMEM och 10% FBS-medium till petriskålen för att tvätta ut och samla de återstående cellerna från ytan. Överför sedan till 50 ml koniskt rör.Upprepa detta steg tills alla celler har samlats in. För att tvätta och rena hepatocyter från icke-parenkymala celler, centrifugera cellerna som samlats i 50 ml koniskt rör vid 50 RCF vid fyra grader Celsius i fem minuter vid låg retardation eller utan några pauser. Kassera super-naton som innehåller skräp och icke-parenkymala celler.Häng sedan upp pelleten i den kvarvarande supernatonen genom att försiktigt virvla röret. Efter pelletsåtersuspension tillsätt 30 ml färsk iskall DMEM och 10% FBS-medium. Börja förbereda CRISPR CAS 9-substratets media, celler och elektroporationsinstrumentet genom att slå på strömbrytaren på elektroporeringsanordningen.Ställ sedan in elektroporationsprogrammet genom att trycka på X-knappen och sedan nedåtpilen tills programmet T 0 28 visas på skärmen. Förberedde destinationsbrunnarna för de elektroporerade hepatocyterna genom att tillsätta 1,5 ml PM till sex brunnskollagen en belagd plattor. Inkubera plattorna i en 37 grader Celsius inkubator tills de är färdiga att användas.I PCR-delade remsrör, förbered CAS 9 RMP- och mRNA-komplexen enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Förvara mRNA SG RNA-blandningen på is tills elektroporering. Förbered separat ett rör som innehåller ett mikrogram E G F P mRNA för att verifiera framgångsrik elektroporering med fluorescensmikroskopi.Centrifugera elektroporationsreaktionen vid 100 RCF i två minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatonen från cellpelleten och tillsätt 100 mikroliter nukleoffektionslösning per reaktion längs sidan av rörväggen. Suspendera hepatocyterna i elektroporationslösningen genom att gunga röret försiktigt för hand.När hepatocyterna är jämnt dispergerade i elektroporationslösningen, överför 100 mikroliter av hepatocytsuspensionen till bandrören innehållande CAS-niokomplexen. Överför innehållet i remsan väl till ett elektroporationskärl. Placera nukleo-vetkärlet i spåret på elektroporationsanordningen.Elektropolera hepatocyterna genom att trycka på X-knappen. Efter elektroporering, vänta tills en skärm dyker upp på enheten som säger: Okej. Tryck på X-knappen igen och ta bort kärlet.Inkubera det elektroporerade kärlet på is i 15 minuter. Tillsätt 500 mikroliter en beväpnad PM till elektroporationskärlet. Överför 300 mikroliter av elektroporationsreaktionen till varje destinationsbrunn på den förvärmda plattan.Inkubera plattorna över natten vid 37 grader Celsius. Tillsätt membranmatrisen till iskallt hepatocytunderhållsmedium och blanda genom att pipettera upp och ner 10 gånger. Ta bort mediet från brunnarna som är avsedda för genredigeringsanalys 24 timmar efter plätering av cellerna.Pipettera överläggsblandningen långsamt ovanpå cellerna och placera plattan tillbaka vid 37 grader Celsius. Vid 24 timmar efter plätering, överför det konditionerade mediet från brunnen avsedd för MTT- och albuminanalyser och förvara i ett mikrofugerör tills det är klart att utföra albuminanalysen. Fortsätt med analys av CAS-nioaktivitet i målet genom att extrahera det genomiska DNA:t och ställa in PCR enligt beskrivningen i textmanuskriptet.Inom 3 till 12 timmar efter plätering vidhäftade hepatocyterna till plattan och cellmorfologin antog ett typiskt polygonalt eller sexkantigt utseende inom 24 timmar Renheten hos de isolerade cellerna verifierades via glykogenfärgning med användning av det periodiska syraskiftreagenset vid 24 timmar efter plätering. Cytoplasman hos de färgade hepatocyterna uppträdde magenta. Hepatocyterna avbildades 24 timmar efter elektroporering och i genomsnitt var 89,8% av hepatocyterna GFP-positiva.Vid tre dagar efter elektroporering inducerades CAS nio i HPD-locus analyserades och resultaten visade på målindels på 47,4% i hepatocyter elektroporerade med CRISPR Cas nio mRNA och 78,4% indels för CAS nio RNP. MTT-analysen visade 35,4 och 45,9% viabilitet i hepatocyter behandlade med CRISPR Cas nio mRNA och R N P.I överensstämmelse med MTT-resultaten var de normaliserade albuminnivåerna 31,8% i hepatocyter behandlade med CAS nio RNA och 34,5% för CAS nio r p. Det viktigaste att komma ihåg är att korrekt kannulering påverkar alla senare steg och procedurens framgång.Efter denna procedur kan hepatocyterna transplanteras och möss för att undersöka deras engraftments. Dessutom kan det genomiska DNA av pläterade hepatocyter extraheras för att analysera effektiviteten och specificiteten hos CAS-nio redigering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Självrapporterings Ställningar för 3-dimensionell cellodling

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Porös Silicon Mikropartiklar för leverans av siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Leverans av proteiner, peptider eller cellimpermeabel Små molekyler i levande celler genom inkubation med Endosomolytic Reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Tillverkning och Drug Delivery Tillämpningar av Silk Nanopartiklar

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

En mikroflödessystem Flow avdelningen modell för Platelet Transfusion och Hemostas Åtgärder blodplättbeläggning och fibrinbildning i realtid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv produktion och redigering av Feeder-fri IPSCs från mänsklig bukspottkörtelns celler med hjälp av CRISPR-Cas9-systemet

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Produktion av genmanipulerade gyllene syriska hamstrar genom pronukleär injektion av CRISPR/Cas9 komplexet

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Hantering och bedömning av människans primära prostata Organoid kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Inkapslade cellteknik för leverans av biologiska läkemedel till musöga

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...