Name: hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis
Uploaded: 2022-06-02T13:20:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hippocampal Neuronal Cultures to Detect and Study New Pathogenic Antibodies Involved in Autoimmune Encephalitis at JoVE.com

אנו מודים למרצ'ה ריבאס, מריה מרסל, גוסטבו קסטרו, ג'ורדי קורטס, אלינה הירשמן ואנחל סנדובל (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) ומרסדס אלבה, מריה רדוסביץ', דויד סוטו, חאווייר גאסול, מאר גואספ ולידיה סבאטר (IDIBAPS, בית החולים קליניק, אוניברסיטת ברצלונה) על התמיכה הטכנית שלהם ועל מתן ריאגנטים, וג'וזפ דלמאו ומירנה ר. רוזנפלד (IDIBAPS, Hospital Clínic, אוניברסיטת ברצלונה) על הסקירה הביקורתית שלהם על כתב היד וההדרכה. מחקר זה מומן על ידי מכון סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) ומומן במשותף על ידי האיחוד האירופי, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - תוכנית Severo Ochoa למרכזי מצוינות במו"פ (CEX2019-000910-S, P.L-A.); תוכנית CERCA ולייזרלאב-אירופה (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); ופונדו סושיאל יורופו (PRE2020-095721, M.C.).

<ol>
	<li>Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+synaptic+receptors+and+neuronal+cell+surface+proteins+in+autoimmune+diseases+of+the+central+nervous+system.">Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).</li><li>Dalmau, J., Graus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-mediated+encephalitis.">Antibody-mediated encephalitis.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (9), 840-851 (2018).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraneoplastic+anti-+N+-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma.">Paraneoplastic anti- N -methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Annals of Neurology. 61 (1), 25-36 (2007).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurology. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location.">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Annals of Neurology. 65, 424-434 (2009).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+the+GABAB+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures:+case+series+and+characterisation+of+the+antigen.">Antibodies to the GABAB receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurology. 9 (1), 67-76 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels:+a+case+series.">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurology. 9 (8), 776-785 (2010).</li><li>Sabater, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+NREM+and+REM+parasomnia+with+sleep+breathing+disorder+associated+with+antibodies+against+IgLON5:+a+case+series,+pathological+features,+and+characterization+of+the+antigen.">A novel NREM and REM parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies against IgLON5: a case series, pathological features, and characterization of the antigen.</a> Lancet Neurology. 13 (6), 575-586 (2014).</li><li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis.">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (17), 5866-5875 (2010).</li><li>Moscato, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+mechanisms+underlying+antibody+effects+in+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis.">Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis.</a> Annals of Neurology. 76 (1), 108-119 (2014).</li><li>Planagum&#224;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+N-methyl+D-aspartate+receptor+antibodies+alter+memory+and+behaviour+in+mice.">Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice.</a> Brain. 138 (1), 94-109 (2015).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Benson, D. L., Watkins, F. H., Steward, O., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+GABAergic+neurons+in+hippocampal+cell+cultures.">Characterization of GABAergic neurons in hippocampal cell cultures.</a> Journal of Neurocytology. 23 (5), 279-295 (1994).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats.">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), e895 (2008).</li><li>Brewer, G. J., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+cultured+neurons+in+ambient+carbon+dioxide+and+hibernation+storage+for+a+month.">Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month.</a> Neuroreport. 7 (9), 1509-1512 (1996).</li><li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture.">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).</li><li>Ricken, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+methods+for+autoantibodies+in+suspected+autoimmune+encephalitis.">Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis.</a> Frontiers in Neurology. 9, 841 (2018).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

התחום ההולך וגדל של אוטואימוניות בתיווך נוגדנים פתח חלון הזדמנויות לזיהוי נוגדנים עצמיים עצביים שניתן להשתמש בהם כדי לשפר את האבחון והטיפול בחולים. תרבויות של נוירונים בהיפוקמפוס הן כלי חיוני לזיהוי נוגדנים; לכן, חשוב לבצע פרוטוקול סטנדרטי כדי לקבל תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. השלבים החשובים ביותר שיש לקחת בחשבון, מגבלות ופתרון בעיות, נדונים כאן.
ניתן לקבץ את השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה לשלוש קטגוריות, תלוי אם הם משפיעים על הטוהר, על ההומוגניות או על הכדאיות של הנוירונים בהיפוקמפוס.
טוהר - כדי להשיג תרביות תאים ראשוניות אופטימליות, על החוקר להיות בטוח בעצמו, מאומן ומסוגל לעבוד במהירות, במיוחד כדי למזער את זמן הנתיחה. גם אם תאי עצב פירמידליים הם סוג התא העיקרי, ההיפוקמפוס מכיל מגוון של אינטרנורונים14. כדי ליצור תרביות עם תאי גליה מינימליים, יש לחלץ את ההיפוקמפוס עם הרקמה המינימלית שמסביב. השימוש ברקע שחור במהלך הדיסקציה מסייע לזהות את גבולות ההיפוקמפוס תחת הסטריאומיקרוסקופ. בנוסף, יש לקחת בחשבון כי צפיפות תאים נמוכה יותר לגרום פחות תמיכה paracrine ולעשות את זה יותר קשה לשמור על התרבית13. לכן, חשוב לזכור את האיזון הזה. זה חשוב במחקרי הדמיה המשתמשים במספר נמוך של תאים (50,000 נוירונים לכל צלחת של 3.5 ס"מ). כדי להיות מסוגל לקבל זמן נוסף עבור מיצוי ההיפוקמפוס, מדיה Hibernate המשמר את הרקמהיש להשתמש 17. עבודה עם כלי ניתוח נאותים היא גם חיונית. כלים ברמת דיוק גבוהה הם עדינים, ולכן יש להבטיח את יכולת השחזור של הטכניקה על ידי הגנה קפדנית עליהם.
הומוגניות - כדי לפתח תרבית ללא אגרגטים של תאים, הדיסוציאציה המכנית של התא שודרגה על ידי שילוב של פיפטות זכוכית משוכות מראש עם פיפטה סטנדרטית של 1,000 μL.
כדאיות - בפרוטוקול זה לא נוספו אנטיביוטיקה מכיוון שהם משפיעים על ההתרגשות העצבית ומשנים את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של הנוירונים בתרבית18. לכן, זיהום סביר מאוד אם הסטנדרטים הגבוהים ביותר של סטריליות אינם נשמרים. הטמפרטורה היא גם גורם מפתח. שמירה על הרקמה קרה במהלך בידוד ההיפוקמפוס מאטה את חילוף החומרים ומפחיתה את השפלת התאים. הרקמה הוחזקה, אם כן, על קרח עד לתהליך הדיסוציאציה של התא. יתר על כן, חיוני למצוא את האיזון הנכון במהלך דיסוציאציה אנזימטית של תאים המפרקים את התאים ללא תזה של תאים מסומנים. בפרוטוקול זה, תזמוני הדגירה עם טריפסין ושלבי הכביסה הבאים עברו אופטימיזציה כדי להשיג תאים בודדים עם מספיק מקום כדי לאפשר יצירת רשת עצבית מתאימה.
צעדים קריטיים נמצאים גם ברישומי פעילות חיסונית חיה פלואורסצנטית ובפעילות סידן מתרביות הנוירונים. כדי לבצע בדיקות חיסוניות חיות מוצלחות לקביעת נוכחות נוגדנים לחלבונים על פני התא בדגימות של מטופלים, יש להימנע מחדירה של התאים שתאפשר לנוגדנים גישה לחלבונים תוך-תאיים. בנוסף, בהתבסס על titer של הנוגדנים, זמן הדגירה ודילול הדגימה צריכים להיות מותאמים בהתאם (למשל, נוגדני טיטר גבוהים מאוד יכולים לתת כתם רקע שמקשה על פירוש התוצאות). בעת ביצוע הערכת הפתוגניות של הנוגדנים העצמיים עם הדמיית סידן, יש להשתמש במדיה אופטימלית למדידות פעילות תאית (למשל, דיכוי Mg2+ במדיום התרבית חשוב לביצועים טובים). יתר על כן, עבור הדמיה פלואורסצנטית, יש להימנע ממדיה עם מחווני pH כגון פנול אדום מכיוון שהיא מציגה אות רקע לא ספציפי.
ישנן שתי מגבלות עיקריות של השימוש בתרביות נוירונים בהיפוקמפוס. ראשית, בהשוואה לקווי תאים יציבים, תרביות ראשוניות חייבות להיווצר ברציפות, וזה מרמז על שימוש בחיות מעבדה באופן קבוע. קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) יכולים להחליף את הצורך בשימוש במודלים של בעלי חיים, אך פרוטוקולי ההתמיינות עבור iPSC עדיין אינם אופטימליים. שנית, נוירונים שמקורם ב- iPSC אינם מבטאים את הספקטרום המלא של חלבוני פני השטח, ולכן, אם נעשה בהם שימוש, היעדר תגובתיות אינו מרמז בהכרח על השליליות של המדגם19.
ישנן שלוש שיטות לסינון נוכחות של נוגדנים עצמיים בסרום או ב-CSF של חולים החשודים כבעלי AE: בדיקה מבוססת רקמה (TBA) באמצעות רקמת מוח של חולדה, בדיקה מבוססת תאים (CBA) באמצעות תאי HEK שעברו טרנספקציה כדי לבטא חלבונים עצביים, והיישום המדווח כאן באמצעות תרביות חיות של נוירונים בהיפוקמפוס19. החשיבות של שיטת נוירוני ההיפוקמפוס בתרבית טמונה ביכולתה להבדיל בין תגובתיות לבין אנטיגנים על פני השטח ואנטיגנים תוך-תאיים שאינם ניתנים להבחנה בקלות על-ידי TBA. חוץ מזה, תרביות נוירונים ראשוניות, בניגוד ל-CBA בתאי HEK שעברו טרנספקציה, אינן מוגבלות על ידי הרפרטואר של חלבונים שעברו טרנספקציה. בנוסף, ניתן להשתמש בנוירונים מתורבתים בהיפוקמפוס כדי לזהות נוגדנים חדשים ואת אנטיגני המטרה שלהם בשילוב עם מיצוי חיסוני וספקטרומטריית מסה, ולכן להרחיב את הספקטרום של נוגדנים הניתנים לזיהוי. לבסוף, הוא מאפשר להעריך את ההשפעות הפתוגניות של הנוגדנים העצמיים על ידי שיטות הדמיה חיות שיכולות לעקוב אחר שינויים בפעילות התאית. לסיכום, זיהוי נוגדנים עצמיים חדשים מאפשר בסופו של דבר ייזום של אימונותרפיות ספציפיות לשיפור תוצאות המטופלים.

דלקת מוח אוטואימונית (AE) היא קטגוריה שהתגלתה לאחרונה של מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המתווכת על ידי נוגדנים המכוונים לפני השטח העצביים או חלבונים סינפטיים 1,2. המאפיינים הקליניים משתנים בהתאם לנוגדן, אך בדרך כלל כוללים פגיעה בזיכרון ובקוגניציה, שינוי בהתנהגות ובתסמינים פסיכיאטריים, תנועות לא תקינות, הפרעות בתפקוד השינה, ירידה ברמת ההכרה והתקפים. הפרעות אלה יכולות להשפיע על אנשים בכל הגילאים, עם סוגים מסוימים של AE המשפיעים בעיקר על ילדים ומבוגרים צעירים2.
במהלך 15 השנים האחרונות תוארו 17 תסמונות AE עם נוגדנים כנגד חלבונים ספציפיים על פני השטח העצביים/סינפטיים (טבלה 1). כמה דוגמאות למטרות העצביות כוללות את הקולטנים המעוררים הסינפטיים NMDAR3,4 ו- AMPAR5, הקולטן המעכב הסינפטי GABAbR6, החלבון המופרש העצבי LGI17, ומולקולת הידבקות התאים IgLON58. עבור רוב אלה AE, מחקרים הראו כי נוגדנים משבשים את המבנה או התפקוד של אנטיגן המטרה שלהם, תומך מאוד בתפקיד פתוגני. לדוגמה, בדלקת מוח אנטי-NMDAR, הנוגדנים מגיבים עם תחום N-terminal של תת-היחידה GluN1 של NMDAR, ומייצרים הפנמה סלקטיבית והפיכה של קולטנים אלה שמביאה לשינויים נוירופסיכיאטריים בולטים 4,9,10,11. לפיכך, זיהוי של כל אחד 17 נוגדנים ידועים בסרום או CSF של המטופל יכול לשמש גם כמבחן אבחון הקובע את האבחנה של AE מסוים.
אחת הטכניקות הנפוצות יותר לזיהוי ואפיון של נוגדנים אלה כוללת שימוש בתרביות של נוירונים היפוקמפליים מנותקים, עובריים, מכרסמים. תרביות אלה שימושיות מכמה סיבות: המוח העוברי קל לניתוק ומכיל רמה נמוכה של תאי גליה, המקור העיקרי לזיהום בתרביות נוירונים12; אוכלוסיית התאים בהיפוקמפוס הומוגנית יחסית בהשוואה לרוב האזורים האחרים של מערכת העצבים המרכזית, כאשר תאים פירמידליים מייצגים את הרוב המכריעשל 13,14; תרביות מוכנות מעוברים בשלב מאוחר כאשר הדור של נוירונים פירמידליים הושלם אך תאי גרגיר עדיין לא התפתחו, מה שמוסיף עוד יותר להומוגניות של התרבית; כאשר נוירונים פירמידליים מתורבתים, מבטאים את רוב התכונות הפנוטיפיות העיקריות שלהם, מסוגלים ליצור דנדריטים מפותחים היטב, ולהקים רשתות מחוברות סינפטיות שיכולות לשמש לחקירות מבניות ואלקטרופיזיולוגיות12,13; מכיוון שנוגדנים אינם יכולים לחדור לנוירונים חיים, השימוש בתרביות חיות מאפשר זיהוי של מטרות אנטיגניות השוכנות על פני התא; ומיצוי חיסוני של קומפלקס הנוגדן-אנטיגן מתרביות נוירונים מאפשר זיהוי של אנטיגן המטרה5.
הצלחת המחקרים המשתמשים בתרביות נוירונים תלויה מאוד באיכות התרביות ובפרוטוקולים המשמשים להערכת הפעילות החיסונית של סרום או נוזל המוח והשדרה של המטופל (CSF). משתנים שיכולים להשפיע על התרביות כוללים את ההליכים לבידוד ההיפוקמפוס לפני התפתחות התרבית, הדיסוציאציה של הרקמה, צפיפות הציפוי, משטח הצמיחה המשמש והרכב המדיה13,15,16. מאמר זה מספק פרוטוקול אופטימלי לתרבית תאים ראשוניים של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות עובריות בשילוב עם חיזוק חיסוני פלואורסצנטי שניתן להשתמש בו כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים נגד אנטיגנים ידועים של AE ומטרות פוטנציאליות חדשות על פני השטח. הוא גם מספק דוגמה כיצד לבחון את ההשפעות הפתוגניות של נוגדני NMDAR על ידי טכניקות הדמיה של תאים חיים באמצעות נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית המבטאים מחוון סידן מקודד גנטית (GECI) ממשפחת GCaMP, GCaMP5G.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>חלבון מטרה</td>
			<td>תפקוד חלבונים</td>
			<td>תא תא</td>
			<td>תסמונת ראשית</td>
		</tr><tr><td>NMDAR</td>
			<td>יון שאנל</td>
			<td>חלבון סינפטי</td>
			<td>דלקת המוח נגד NMDAR</td>
		</tr><tr><td>אמפאר</td>
			<td>יון שאנל</td>
			<td>חלבון סינפטי</td>
			<td>דלקת המוח הלימבית</td>
		</tr><tr><td>גלוק2</td>
			<td>יון שאנל</td>
			<td>חלבון סינפטי</td>
			<td>דלקת המוח</td>
		</tr><tr><td>GABAaR</td>
			<td>יון שאנל</td>
			<td>חלבון סינפטי</td>
			<td>דלקת המוח</td>
		</tr><tr><td>GABAbR</td>
			<td>קולטן מטאבוטרופי</td>
			<td>חלבון סינפטי</td>
			<td>דלקת המוח הלימבית</td>
		</tr><tr><td>mGluR1</td>
			<td>קולטן מטאבוטרופי</td>
			<td>חלבון סינפטי</td>
			<td>דלקת המוח</td>
		</tr><tr><td>mGluR2</td>
			<td>קולטן מטאבוטרופי</td>
			<td>חלבון סינפטי</td>
			<td>דלקת המוח</td>
		</tr><tr><td>mGluR5</td>
			<td>קולטן מטאבוטרופי</td>
			<td>חלבון סינפטי</td>
			<td>דלקת המוח</td>
		</tr><tr><td>D2R</td>
			<td>קולטן מטאבוטרופי</td>
			<td>חלבון סינפטי</td>
			<td>דלקת המוח של הגרעינים הבסיסיים</td>
		</tr><tr><td>LGI1</td>
			<td>מולקולת הידבקות</td>
			<td>חלבון פני התא</td>
			<td>דלקת המוח הלימבית</td>
		</tr><tr><td>CASPR2</td>
			<td>מולקולת הידבקות</td>
			<td>חלבון פני התא</td>
			<td>דלקת המוח הלימבית</td>
		</tr><tr><td>איגלון5</td>
			<td>מולקולת הידבקות</td>
			<td>חלבון פני התא</td>
			<td>מחלת אנטי-IgLON5</td>
		</tr><tr><td>נוריקסין-3α</td>
			<td>מולקולת הידבקות</td>
			<td>חלבון פני התא</td>
			<td>דלקת המוח</td>
		</tr><tr><td>DNER (Tr)</td>
			<td>חלבון טרנסממברנה</td>
			<td>חלבון פני התא</td>
			<td>דלקת המוח</td>
		</tr><tr><td>SEZ6L</td>
			<td>חלבון טרנסממברנה</td>
			<td>חלבון פני התא</td>
			<td>דלקת המוח</td>
		</tr><tr><td>אמפיפיסין</td>
			<td>מולקולה מבנית</td>
			<td>חלבון פני התא</td>
			<td>דלקת המוח הלימבית</td>
		</tr><tr><td>DPPX</td>
			<td>פפטידאז</td>
			<td>חלבון פני התא</td>
			<td>דלקת המוח</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: נוגדנים לפני השטח של התא העצבי ולחלבונים סינפטיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Cell culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12-565-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9708845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x NA 0.75 S Fluor air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Super Fluor 20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12-565-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Cell culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12-565-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 100 mL</td>
			<td>Pirex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>DMEM-HXRXA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Wistar rat (18-days pregnant)</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-angled forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-curved forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11272-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Standard Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Human AF488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>HBSS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-E medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12476-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum (HS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-NMDAR antibody (CSF)</td>
			<td>Patient Sample</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-NMDAR antibody (Serum)</td>
			<td>Patient Sample</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td>v1.50i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>X0550-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cell chamber</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2-CAG-GCaMP5G</td>
			<td>VectorBiolabs</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J199943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine (PLL)</td>
			<td>Peptide international</td>
			<td>OKK-35056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene ice tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>re-used cap of a polysterene box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision spring-scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14068-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0642-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile endotoxine free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis

במהלך 15 השנים האחרונות, קטגוריה חדשה של מחלות בתיווך נוגדנים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) אופיינה ומוגדרת כיום כ"דלקת מוח אוטואימונית" (AE). ישנן כיום 17 תסמונות AE ידועות, וכולן קשורות לנוגדנים כנגד פני התא העצבי או חלבונים סינפטיים. התסמונות הקליניות מורכבות ומשתנות בהתאם לסוג הנוגדן הקשור. הידועה ביותר מבין מחלות אלה היא אנטי-N-מתיל D-אספרטט קולטן (NMDAR) דלקת המוח, שהיא הפרעה נוירופסיכיאטרית בולטת הקשורה לליקויים חמורים בזיכרון ובהתנהגות. הנוגדנים הקשורים מגיבים עם תת-היחידה GluN1 של NMDAR בתחום N-terminal. הגישה הנפוצה ביותר לגילוי ואפיון של נוגדני AE כוללת את התרבות של נוירונים היפוקמפליים מנותקים, עובריים, מכרסמים. בתהליך אפיון הנוגדנים, נוירונים חיים בתרבית נחשפים לסרום או ל-CSF של המטופלים, וזיהוי תגובתיות מצביע על כך שדגימות הסרום או ה-CSF של המטופל מכילות נוגדנים נגד אנטיגנים של פני השטח העצביים. תרביות היפוקמפוס יכולות לשמש גם כדי לקבוע אם הנוגדנים בחולים הם פתוגניים פוטנציאליים על ידי בדיקה אם הם גורמים לשינויים מבניים או תפקודיים של הנוירונים. רמת ההצלחה של מחקרים אלה תלויה באיכות התרביות ובפרוטוקולים המשמשים להשגת וזיהוי תגובתיות דגימות המטופלים. מאמר זה מספק פרוטוקול אופטימלי לתרבית תאים ראשונית של נוירונים היפוקמפליים של חולדות עובריות בשילוב עם אימונוסטינינג כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים בסרום או CSF של חולים. דוגמה לאופן שבו ניתן לבחון את ההשפעות הפתוגניות הפוטנציאליות של נוגדני NMDAR באמצעות נוירונים בתרבית והדמיית סידן מוצגת גם כן.

הקמת תרביות עצביות היפוקמפוס מנותקות, עובריות, מכרסמים הפרוטוקול המוצג כאן מבוסס על המחקרים המשפיעים על גידול תאי עצב שבוצעו על ידי בנקר וגוסלין15. הפרוטוקול שוכלל כדי להשיג תרביות נוירונים עם מורפולוגיה, צפיפות וטוהר אופטימליים לביצוע מחקרי זיהוי נוגדנים על פני השטח של תאי עצב. פרוטוקול הדיסקציה והזריעה מחולק לשלושה חלקים (איור 1A). החלק הראשון, בידוד ההיפוקמפוס, מורכב ממיצוי כירורגי של הרקמה החיה (איור 1A, פאנל שמאלי). כפי שעולה מהאיור, חולדות Wistar הרות עם עוברי E18 הן חומר המוצא העיקרי לתרבות מצליחה. ברגע שהמוח מופק מעוברי E18, המיקרו-כירורגיה מתבצעת תחת סטריאומיקרוסקופ. בעזרת כלים מתאימים (איור 1B) וטיפול מדויק, ניתן להפריד את ההיפוקמפוס משאר רקמת העצב. הנטייה של רקמות במדיה הספציפית מתוארת באיור 1C. החלק השני של הפרוטוקול מורכב מהדיסוציאציה של תאי ההיפוקמפוס. הוא מחולק לשני שלבים (איור 1A, פאנל אמצעי): דיסוציאציה אנזימטית ודיסוציאציה מכנית של ההיפוקמפוס, וכתוצאה מכך תאים בודדים, מנותקים. באמצעות מתודולוגיה זו ניתן להשיג תרביות תאים ללא אגרגטים של תאים, כפי שמיוצג באיור 2A-D. החלק השלישי של הפרוטוקול מורכב מזריעת התאים (איור 1A, פאנל ימני). חלק זה של הפרוטוקול הוא חיוני על מנת להתאים את הצפיפות וההומוגניות של התרבות העצבית בצלחת. ספירת התאים וזריעת 50,000 תאי עצב באזור של צלחת בגודל 3.5 ס"מ מספקת צפיפות אופטימלית לביצוע לא רק ניסויים כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים לחלבונים על פני השטח של התא העצבי (איור 3), אלא גם לנתח את הפתוגנטיות של נוגדנים אלה באמצעות הדמיית סידן (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig01.jpg" style="opacity: 0.9;"> איור 1: פרוטוקול חזותי לתרביות ראשוניות של נוירונים בהיפוקמפוס. (A) תרשים זרימה המציג את שלושת חלקי הפרוטוקול להכנת תרביות תאים מנותקים של נוירונים בהיפוקמפוס מחולדות עובריות ב-E18. הפרוטוקול מחולק ל -1. בידוד בהיפוקמפוס, 2. דיסוציאציה של תאים, ו-3. זריעת תאים. (B) בחירת כלים מומלצים לבידוד בהיפוקמפוס המקובצים לשלוש קטגוריות: (1- מלקחיים, 2- מלקחיים מעוקלים, 3- מספריים) לאיסוף עוברים, (4- מלקחיים מעוקלים עדינים, 5- מלקחיים ישרים-עדינים, 6- מספריים כירורגיים) לחילוץ המוח, ו-(7- מלקחיים בזווית עדינה, 8- מספריים קפיציים מדויקים) לבידוד בהיפוקמפוס. (C) ייצוג סכמטי של מגש קרח 1 עם צלחות ומדיה הדרושים לבידוד ההיפוקמפוס. עוברים וראשים ממוקמים ב-HBSS, ואילו מוחות ממוקמים במצב שינה בינוני + B27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
תרביות של נוירונים בהיפוקמפוס בגיל 18 div הן בוגרות, מחוברות זו לזו ומבטאות חלבונים מבניים ותפקודיים בגדילה ובהתבגרות של תרביות עצביות, ניתן להעריך שני שלבים מובחנים: שלב הקיטוב של תא העצב (איור 2A,B) ושלב ההתפתחות והבנייה הדנדריטית של הרשת הסינפטית (איור 2C,D). תאים על צלילה אחת מתחלקים באופן שווה ונדבקו לצלחת, ומפתחים למלה סביב גוף התא עם נויריטים קלים שמתחילים להתרחב (איור 2A). לאחר כמה ימים בתרבית, הנוירוריטים משתרעים למרחק קצר. התאים מראים קיטוב משמעותי, אך יש צמיחה נטו קטנה (איור 2B). לאחר שלב זה, סינפטוגנזה בולטת, והנוירונים מתחילים להתחבר. הרשת העצבית ממשיכה לגדול ונעשית מורכבת יותר (איור 2C). בגיל 18, תאי העצב בוגרים ומחוברים זה לזה; הרשת העצבית בנויה (איור 2D). ברגע שעמודי השדרה הסינפטיים נוצרים ומחוברים, תאי העצב מקוטבים לחלוטין ומבטאים את כל החלבונים הפונקציונליים והמבניים. מבין החלבונים הרבים המתבטאים על-ידי תאי עצב בוגרים בתרבית, הקולטן העצבי NMDA (איור 2E) והחלבון הסינפטי PSD95 (איור 2F) נבחרו כאן כסמנים מייצגים. יתר על כן, אפשר לדמיין אקסונים באופן סלקטיבי על-ידי תיוג נוירופילמנט (NF) (איור 2G) והדמיה של דנדריטים על-ידי התמקדות בחלבון MAP2 (איור 2H).<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig02.jpg"> איור 2: מהלך הזמן של ההבשלה של תרביות תאים מנותקים של נוירונים בהיפוקמפוס. (A-D) תמונות ניגודיות פאזה של נוירונים בהיפוקמפוס במהלך 18 הימים הראשונים של התרבית. (A) תאי עצב ב-1 צוללים עם ההצמדה למצע המצופה PLL. (B) הופעתם של נויריטים קטנים בתאי עצב ב-5 div. (C) נוירונים ב-11 div פיתחו נויריטים ארוכים שמתארכים ורוכשים מאפיינים אקסונאליים. (D) תאי עצב ב-18 div הם בוגרים ויצרו רשת עצבית. סרגל קנה מידה (A-D) = 40 מיקרומטר. (E-H) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות שצולמו על ידי מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית באמצעות סמנים סלקטיביים כדי להראות נוירונים בוגרים ב-18 div. תרביות נוירונים היו קבועות ומוכתמות בנוגדנים שמכתימים באופן סלקטיבי את הקולטן העצבי (E) (NMDAR), (F) סמן סינפטי (PSD95), (G) סמן אקסונאלי (נוירופילמנט, NF) ו-(H) סמן דנדריטי (MAP2). סרגל קנה מידה (E-H) = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
נוגדנים בדגימות מטופלים מגיבים עם אנטיגנים על פני השטח של התאים העצביים הדגימות (סרום ו- CSF) המתקבלות מחולים הסובלים מדלקת המוח נגד NMDAR מכילות נוגדנים עצמיים המזהים את ה- NMDAR הקיים על פני השטח של נוירונים. הדגירה של התרביות עם דגימות המטופלים מייצרת אות פלואורסצנטי אינטנסיבי על פני התא ועל הדנדריטים (איור 3A,C). לעומת זאת, דגימות בקרה אינן מייצרות אות פלואורסצנטי כאשר הן ניתנות לתרביות העצביות (איור 3B,D). ממצאים אלה מראים כיצד ניתן להשתמש בתרביות כדי לסנן דגימות של מטופלים אחר נוגדנים, ויכולים להוביל לזיהוי נוגדנים חדשים המכוונים לפני השטח של התא העצבי. 
דגימת CSF מהחולה מפחיתה את ריכוז הסידן התוך-תאי בתרביות המושרות על-ידי NMDA של נוירונים בהיפוקמפוס כדי להעריך את השפעת הנוגדנים של המטופלים על הפעילות העצבית (לאחר טיפול של 24 שעות), נטרו באופן אופטי מעברי סידן תוך תאיים מהנוירונים בתרבית בזמן אמת על גירוי בתיווך NMDA. היישום של NMDA יוצר עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה, כפי שמעיד שינוי בפלואורסצנציה הירוקה התוך-תאית (איור 4A ווידאו משלים 1). תאי עצב שטופלו בדגימת CSF של הבקרה הראו הבדל גבוה יותר בעוצמת הפלואורסצנטיות (56%) כאשר הגירוי הופעל בהשוואה לתאים שטופלו בדגימת CSF של המטופל. ההבדלים בעוצמת הפלואורסצנציה נמדדו, ועקומות הגירוי בתיווך NMDA מהנתונים שחולצו מהסומא של התאים הושוו (איור 4B,C). עקומות הגירוי מראות כי היה זרם תוך-תאי של סידן בשני התרחישים, אך התרביות שטופלו ב-CSF (קו אפור) של המטופלים הראו תגובה נמוכה יותר מאשר התרביות שטופלו בביקורת (קו שחור). תוצאות אלה מראות כי הנוגדנים הנמצאים ב-CSF של המטופלים מפחיתים את הפעילות התאית עקב האינטראקציה של הנוגדנים עם ה-NMDAR, ובכך גורמים להשפעה פתוגנית.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig03.jpg"> איור 3: נוגדנים של מטופלים מגיבים עם פני השטח של תרביות עצביות . (A,E) סרום ו-CSF מחולים עם דלקת המוח נגד NMDAR מגיבים עם פני התא של נוירונים חיים בהיפוקמפוס של חולדה, (B,F) ואילו הסרום וה-CSF של נבדקי הביקורת לא מראים תגובתיות. סרגל קנה מידה (A,B,E,F) = 20 μm. תמונת הגדלה גבוהה יותר של דנדריט (63x) המציגה את תבנית פני השטח האופיינית של תגובתיות עבור (C,G) הסרום של המטופל ו-CSF ו-(D,H) שלילית עבור בקרות. התמונות צולמו על ידי מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig04.jpg"> איור 4: נוגדנים של מטופלים מפחיתים את זרם הסידן בתאי עצב של חולדות המבטאים GCaMP5G. (A) מתן תמיסת גירוי (NMDA [100 μM] + גליצין [1 μM]) בתרביות של נוירונים עורר זרם סידן, כפי שצוין על ידי הגדלת פלואורסצנטיות ירוקה תוך תאית (שיא הגירוי), בהשוואה לתמונה שצולמה לפני הגירוי (טרום גירוי). לאחר 120 שניות, עוצמת הפלואורסצנציה יורדת ומתייצבת (לאחר הגירוי). תרביות שטופלו ב-CSF של המטופלים הראו ירידה משמעותית (56%) בעלייה בסידן בתיווך NMDA בהשוואה ל-CSF של הביקורת. התמונות צולמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) תרשים של אחד משלושת הניסויים הבלתי תלויים המייצגים את עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן (180 שניות) עבור התרביות שטופלו ב-CSF (קו שחור) של הבקרה ו-CSF (קו אפור) של המטופלים על גירוי NMDA (חץ כחול). n(CSF של בקרות) = 20 תאים; n (CSF של המטופלים) = 28 תאים. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM. (C) חלקות תיבה מציגות את האחוזון החציוני, ה-25 וה-75. שפם מציין את ערכי המינימום והמקסימום. הערכת המשמעות בוצעה על ידי ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA; p < 0.0001) ומבחני Mann-Whitney U (p < 0.0001). ערך של p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
סרטון משלים 1: סרטון המציג שני נוירונים בהיפוקמפוס המבטאים GCaMP5G זה לצד זה: נוירון שטופל ב-CSF של Control (משמאל) לעומת נוירון שטופל ב-CSF של המטופלים (מימין). היישום של NMDAR (גירוי) יוצר עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה התוך-תאית בשני המקרים, אך עם רמה גבוהה משמעותית בנוירון המטופל ב- CSF של הבקרה לעומת זה שטופל ב- CSF של המטופלים. התמונות צולמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ונערכו באמצעות ImageJ החלת טבלת בדיקת המידע (LUT) Fire. 1700 מסגרות (170 שניות); מואץ 5 פעמים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hippocampal Neuronal Cultures to Detect and Study New Pathogenic Antibodies Involved in Autoimmune Encephalitis at JoVE.com

Hippocampal Neuronal Cultures to Detect and Study New Pathogenic Antibodies Involved in Autoimmune Encephalitis

דלקת המוח האוטואימונית היא קטגוריה חדשה של מחלות בתיווך נוגדנים של מערכת העצבים המרכזית. ניתן להשתמש בנוירונים בהיפוקמפוס כדי לגלות ולאפיין נוגדנים אלה. מאמר זה מספק פרוטוקול לתרבית תאים ראשונית ואימונוסטינינג כדי לקבוע נוגדנים עצמיים בסרום ובנוזל המוח והשדרה של חולים.

תרביות נוירונים בהיפוקמפוס כדי לזהות ולחקור נוגדנים פתוגניים חדשים המעורבים בדלקת המוח אוטואימונית

Over the last 15 years, a new category of antibody-mediated diseases of the central nervous system (CNS) has been characterized and is now defined as ...

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא איפשר לנו לזהות אם דגימת מטופל הכילה נוגדנים פתוגניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו טמון ביכולתה להבדיל בין תגובתיות בין פני השטח לבין אנטיגנים תוך תאיים, שלא ניתן להבחין בהם בקלות בשיטות אחרות. תאי העצב התרבותיים בהיפוקמפוס משמשים לזיהוי נוגדנים חדשים.הזיהוי של נוגדנים חדשים אלה מאפשר בסופו של דבר ייזום של מונותרפיה ספציפית כדי לשפר את תוצאות המטופלים. טכניקה זו חשובה משום שניתן להרחיב אותה לכל תחום המחלות הקשורות לנוגדנים פתוגניים המופנים לחלבוני פני השטח העצביים. מחזיק את ראש העובר עם מלקחיים מעוקלים עדינים, לחדור את המסלולים עם זוג מלקחיים ישרים עדינים בזווית של 45 מעלות.לאחר מכן שחררו את המלקחיים המעוקלים העדינים. בעזרת מספריים ניתוח, לנתח את העור ואת הגולגולת החל מן העצם העורפית אל העצם הקדמית. לאחר מכן הסר את המוח עם זוג מלקחיים מעוקלים עדינים ואסוף אותו בצלחת שישה סנטימטרים עם תרדמה פלוס B27.לאחר שהמוחות מכל העוברים מתאוששים, השתמשו במלקחיים הישרים העדינים כדי להפריד את הטלנצפלונים. לאחר מכן, הכינו צלחת באורך 10 ס"מ על ידי הנחת טיפות של תרדמה פלוס B27 במרחקים של סנטימטר אחד במעגל, והניחו טלנספלון אחד לכל טיפה כדי לדמיין דרך היקף החיתוך בהגדלה של 1.25 X. תוך כדי עבודה מתחת למיקרוסקופ, הסר בזהירות את התלמוס, וקלף את קרומי המוח כדי לדמיין טוב יותר את ההיפוקמפוס.לאחר מכן לנתח את ההיפוקמפוס עם מספריים קפיץ מדויק. והניחו אותו בצלחת של 3.5 ס"מ עם תרדמה פלוס B27 ואיסטראט שניים. חזור על ההליך כדי לאסוף את כל ההיפוקמפי.עבור דיסוציאציה אנזימטית של ההיפוקמפוס, להוסיף מיליליטר אחד של 2.5% טריפסין בצינור 50 מיליליטר המכיל את ההיפוקמפי. לאחר הבאת נפח הצינור לחמישה מיליליטר עם HBSS, לדגור את הצינור במשך 15 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לדלל עוד יותר את הטריפסין, להוסיף 10 מיליליטר של HBSS שחומם מראש, ולהניח את הצינור בחזרה באמבט המים, להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.לאחר מכן, השתמש במיקרו פיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להעביר את ההיפוקמפי המופיע כמסת ריר לצינור של 50 מיליליטר. ודגרה את הרקמה עם שישה מיליליטר של HBSS שחומם מראש במשך חמש דקות, כפי שהודגם. כדי לנתק את הרקמה באופן מכני, להעביר את מסת ההיפוקמפוס לצינור שני מיליליטר עם תחתית חרוטית.לאחר הוספת מיליליטר אחד של מדיית DMEM שחוממה מראש, הומוגניות הכדור עם מיקרו פיפטה של 1000 מיקרוליטר על ידי שאיפה עדינה למעלה ולמטה. תוך הקפדה שלא ליצור בועות, חזור על שאיפת העלייה והירידה 10 עד 20 פעמים עם פיפטה זכוכית משוכה מראש עם הקצה שלה במגע עם החלק התחתון החרוטי של הצינור עד שהתערובת שקופה. ספרו את התאים לפני שתחלקו אותם באופן שווה על צלחת באורך 3.5 ס"מ עם תנועות טלטול מוצלבות.לאחר שתסיים, מניחים את המנה באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני. עבור חיזוק חיסוני פלואורסצנטי של 14 יום בתאי מבחנה, יש להוסיף את הדגימה המכילה נוגדנים נגד NMDAR לכיסויים ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר שעה, התייחסו לדגימה עם 4% פורמלדהיד ו-PBS כתמיסת קיבוע בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.לאחר מכן לשטוף את דחף הדגימה עם PBS במשך חמש דקות כל אחד, ולאחר מכן תוספת של נוגדנים משניים עז אנטי אדם Alexa Fluor 488 בדילול אחד עד 1000 במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הרכב את תלושי הכיסוי המכילים את הדגימה עם מדיום הרכבה נוזלי ושאף את כל הנוזלים שנותרו. דמיינו את הנוירונים עם הדמיה פלואורסצנטית.להדמיית סידן, יש להשתמש בתאי מבחנה במשך 14 עד 18 ימים שגודלו על גבי תלושי כיסוי. לפני ההדמיה, טפלו בתאים באמצעות קידוד וקטור נגיפי עבור pAAV2 CAG GCaMP 5G ב-2.5 כפול 10 עד עותקי הגנום העשירי למיליליטר במשך חמישה עד שבעה ימים. יום אחד לפני ההדמיה, לדגור את התאים עם דגימת המטופל במשך 24 שעות.ביום ההדמיה, הכינו את ההתקנה והגדירו את תא התא במיקרוסקופ ל-37 מעלות צלזיוס. מלאו את הנתיב במים מזוקקים, החדירו בו 5% פחמן דו חמצני כדי לשמור על התנאים הפיזיולוגיים של התא. לאחר כיסוי התאים בתמיסה פיזיולוגית חוץ-תאית, העבירו אותם לתא התא במיקרוסקופ.הוסיפו 10 מיקרומולרים NBQX כדי לחסום את קולטני AMPA ו-KA, ודמיינו את תגובת הקולטן של NMDA. רכוש את הסרט של ארבע דקות עם המסגרות שנרשמו כל 100 אלפיות השנייה. זמן קצר לאחר תחילת הרכישה, להוסיף פתרון גירוי למנה.לאחר הגירוי, חלצו את האות הפלואורסצנטי לאורך זמן מהתרבית שהוחדרה עם הבקרה ודגימות נוזל השדרה המוחי של המטופל או דגימות CSF באמצעות תוכנת עיבוד כגון Image J.It נצפתה שהתאים ביום אחד במבחנה היו מפוזרים באופן שווה ונדבקו לצלחת עם למלה המתפתחת סביב גוף התא ונויריטים קלים מתחילים להתרחב. לאחר כמה ימים בתרבית, הנוירוריטים התארכו למרחק קצר והתאים הראו קיטוב משמעותי. הרשת העצבית המשיכה לגדול והפכה מורכבת.בגיל 18 יום, תאי העצב היו בוגרים, מחוברים זה לזה ובנו את הרשת העצבית. התמונות הפלואורסצנטיות המייצגות מראות נוירונים בוגרים בגיל 18 יום באמצעות סמנים סלקטיביים. הדגירה של התרביות עם דגימות החולה יצרה אות פלואורסצנטי אינטנסיבי שכן הוא מכיל את הנוגדנים האוטומטיים שזיהו את קולטן NMDA שנמצא על פני השטח של הנוירונים.לעומת זאת, דגימות הבקרה לא הפיקו אות פלואורסצנטי כאשר ניתנו לתרביות העצביות. היישום של NMDA הגביר את עוצמת הפלואורסצנציה כפי שצוין על ידי שינוי בפלואורסצנציה הירוקה התוך-תאית. כאשר הגירוי הופעל, הנוירונים שטופלו בדגימת CSF של הבקרה הראו הבדל גבוה יותר בעוצמת הפלואורסצנציה מאשר התאים שטופלו בדגימת CSF של המטופלים.זיהוי הרכוש ונתיחת ההיפוקמפוס קובעים את טוהר התרבויות. צבירה של תאים היא גורם מפתח, במיוחד כאשר משתמשים בתרביות למטרות הדמיה. בנוסף, ניתן להשתמש בתאי עצב בהיפוקמפוס בתרבית כדי לזהות נוגדנים חדשים ואת אנטיגני המטרה שלהם בשילוב עם מיצוי חיסוני וטכניקות ספקטרומטריית מסה.טכניקה זו אפשרה אפיון של קטגוריה חדשה של מחלות בתיווך נוגדנים. לכן, הוא חיוני בחקר התחום החדש של ננו-אימונולוגיה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

New Methods to Study Gustatory Coding

שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...