Name: hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis
Uploaded: 2022-06-02T13:20:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hippocampal Neuronal Cultures to Detect and Study New Pathogenic Antibodies Involved in Autoimmune Encephalitis at JoVE.com

Мы благодарим Мерче Риваса, Марию Марсаль, Густаво Кастро, Жорди Кортеса, Алину Хиршманн и Анхеля Сандовала (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) и Мерседес Альбу, Марию Радошевич, Давида Сото, Ксавье Гасулла, Мара Гуаспа и Лидию Сабатер (IDIBAPS, Hospital Clínic, Университет Барселоны) за их техническую поддержку и предоставление реагентов, а также Хосепа Далмау и Мирны Р. Розенфельд (IDIBAPS, Hospital Clínic, University of Barcelona) за критический обзор рукописи и наставничество. Это исследование финансировалось Институтом спасения Карлоса III (ISCIII) и совместно финансировалось Европейским союзом, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - Программа Северо Очоа для центров передового опыта в области исследований и разработок (CEX2019-000910-S, P.L-A.); Программа CERCA и Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Министерство науки и инноваций (MCIN/AEI/10.13039/501100011033,.Л-А.); и Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

<ol>
	<li>Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+synaptic+receptors+and+neuronal+cell+surface+proteins+in+autoimmune+diseases+of+the+central+nervous+system.">Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).</li><li>Dalmau, J., Graus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-mediated+encephalitis.">Antibody-mediated encephalitis.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (9), 840-851 (2018).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraneoplastic+anti-+N+-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma.">Paraneoplastic anti- N -methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Annals of Neurology. 61 (1), 25-36 (2007).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurology. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location.">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Annals of Neurology. 65, 424-434 (2009).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+the+GABAB+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures:+case+series+and+characterisation+of+the+antigen.">Antibodies to the GABAB receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurology. 9 (1), 67-76 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels:+a+case+series.">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurology. 9 (8), 776-785 (2010).</li><li>Sabater, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+NREM+and+REM+parasomnia+with+sleep+breathing+disorder+associated+with+antibodies+against+IgLON5:+a+case+series,+pathological+features,+and+characterization+of+the+antigen.">A novel NREM and REM parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies against IgLON5: a case series, pathological features, and characterization of the antigen.</a> Lancet Neurology. 13 (6), 575-586 (2014).</li><li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis.">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (17), 5866-5875 (2010).</li><li>Moscato, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+mechanisms+underlying+antibody+effects+in+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis.">Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis.</a> Annals of Neurology. 76 (1), 108-119 (2014).</li><li>Planagum&#224;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+N-methyl+D-aspartate+receptor+antibodies+alter+memory+and+behaviour+in+mice.">Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice.</a> Brain. 138 (1), 94-109 (2015).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Benson, D. L., Watkins, F. H., Steward, O., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+GABAergic+neurons+in+hippocampal+cell+cultures.">Characterization of GABAergic neurons in hippocampal cell cultures.</a> Journal of Neurocytology. 23 (5), 279-295 (1994).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats.">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), e895 (2008).</li><li>Brewer, G. J., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+cultured+neurons+in+ambient+carbon+dioxide+and+hibernation+storage+for+a+month.">Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month.</a> Neuroreport. 7 (9), 1509-1512 (1996).</li><li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture.">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).</li><li>Ricken, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+methods+for+autoantibodies+in+suspected+autoimmune+encephalitis.">Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis.</a> Frontiers in Neurology. 9, 841 (2018).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов.

Растущее поле аутоиммунитета, опосредованного антителами, открыло окно возможностей для идентификации нейронных аутоантител, которые могут быть использованы для улучшения диагностики и лечения пациентов. Культуры нейронов гиппокампа являются важным инструментом для идентификации антител; поэтому важно выполнить стандартизированный протокол для получения надежных и воспроизводимых результатов. Наиболее важные шаги для рассмотрения, ограничения и устранение неполадок обсуждаются здесь.
Критические шаги этого протокола могут быть сгруппированы в три категории в зависимости от того, влияют ли они на чистоту, однородность или жизнеспособность нейронов гиппокампа.
Чистота - Чтобы получить оптимальные первичные клеточные культуры, исследователь должен быть уверенным, обученным и способным работать быстро, особенно для минимизации времени рассечения. Даже если пирамидальные нейроны являются основным типом клеток, гиппокамп содержит множество интернейронов14. Чтобы генерировать культуры с минимальным количеством глиальных клеток, гиппокамп должен быть извлечен с минимальной окружающей тканью. Использование черного фона во время рассечения помогает выявить границы гиппокампа под стереомикроскопом. Кроме того, следует учитывать, что более низкая плотность клеток приводит к меньшей паракринной поддержке и затрудняет поддержание культуры13. Поэтому важно помнить об этом балансе. Это важно в исследованиях визуализации, в которых используется небольшое количество клеток (50 000 нейронов на чашку 3,5 см). Чтобы иметь возможность иметь дополнительное время для экстракции гиппокампа, следует использовать гибернационные среды, которые сохраняют ткань17. Работа с адекватными хирургическими инструментами также имеет важное значение. Высокоточные инструменты деликатны, поэтому воспроизводимость техники должна быть обеспечена путем их тщательной защиты.
Однородность - Для разработки культуры без клеточных агрегатов механическая диссоциация клеток была модернизирована путем сочетания использования предварительно вытянутых стеклянных пипеток со стандартной пипеткой 1000 мкл.
Жизнеспособность - В этот протокол не были добавлены антибиотики, поскольку они влияют на возбудимость нейронов и изменяют электрофизиологические свойства культивируемых нейронов18. Поэтому загрязнение очень вероятно, если не соблюдаются самые высокие стандарты стерильности. Температура также является ключевым фактором. Поддержание ткани холодным во время изоляции гиппокампа замедляет метаболизм и уменьшает деградацию клеток. Таким образом, ткань держали на льду до процесса диссоциации клеток. Кроме того, крайне важно найти правильный баланс во время ферментативной диссоциации клеток, который дезагрегирует клетки без выраженного лизиса клеток. В этом протоколе сроки инкубации с трипсином и последующие этапы промывки были оптимизированы для получения отдельных клеток с достаточным пространством, позволяющим создать соответствующую нейронную сеть.
Критические шаги также обнаружены в флуоресцентных живых иммуноокрашивающих и кальциевых записях активности из нейронных культур. Чтобы выполнить успешное живое иммуноокрашивание для определения наличия антител к белкам клеточной поверхности в образцах пациентов, необходимо избегать пермеабилизации клеток, которая позволила бы антителам получить доступ к внутриклеточным белкам. Кроме того, основываясь на титре антител, время инкубации и разбавление образца должны быть соответствующим образом скорректированы (например, очень высокие титрные антитела могут давать фоновое окрашивание, что затрудняет интерпретацию результатов). При проведении оценки патогенности аутоантител с помощью кальциевой визуализации необходимо использовать среду, оптимальную для измерения клеточной активности (например, подавление Mg2+ в культуральной среде важно для хорошей производительности). Кроме того, для флуоресцентной визуализации следует избегать сред с индикаторами pH, такими как фенол красный, поскольку он вводит неспецифический фоновый сигнал.
Существует два основных ограничения использования культур нейронов гиппокампа. Во-первых, по сравнению со стабильными клеточными линиями, первичные культуры должны генерироваться непрерывно, а это подразумевает регулярное использование лабораторных животных. Индуцированные линии плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) могут заменить необходимость использования животных моделей, но протоколы дифференцировки для iPSC все еще не являются оптимальными. Во-вторых, нейроны, полученные из iPSC, не экспрессируют полные спектры поверхностных белков и, следовательно, при использовании отсутствие реактивности не обязательно подразумевает негативность образца19.
Существует три метода скрининга наличия аутоантител в сыворотке или ликворе пациентов с подозрением на наличие АЭ: тканевой анализ (TBA) с использованием ткани мозга крысы, клеточный анализ (CBA) с использованием HEK-клеток, трансфектированных для экспрессии нейронных белков, и приложение, о котором сообщается здесь с использованием живых культур нейронов гиппокампа19. Важность метода культивируемых нейронов гиппокампа заключается в его способности дифференцировать реактивность с поверхностными и внутриклеточными антигенами, которые не могут быть легко различимы по TBA. Кроме того, первичные нейрональные культуры, в отличие от ЦБА в heK трансфектированных клетках, не ограничены репертуаром трансфектированных белков. Кроме того, культивируемые нейроны гиппокампа могут быть использованы для идентификации новых антител и их целевых антигенов в сочетании с иммунопреципитацией и масс-спектрометрией и, следовательно, для расширения спектра идентифицируемых антител. Наконец, он позволяет оценить патогенные эффекты аутоантител с помощью методов визуализации в реальном времени, которые могут контролировать изменения в клеточной активности. В заключение, идентификация новых аутоантител в конечном итоге позволяет инициировать специфическую иммунотерапию для улучшения результатов лечения пациентов.

Аутоиммунный энцефалит (АЭ) является недавно обнаруженной категорией заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), опосредованных антителами, которые нацелены на поверхность нейронов или синаптические белки 1,2. Клинические признаки варьируются в зависимости от антитела, но обычно включают нарушение памяти и познания, измененное поведение и психиатрические симптомы, аномальные движения, дисфункцию сна, снижение уровня сознания и судороги. Эти расстройства могут поражать людей всех возрастов, причем некоторые типы AE преимущественно поражают детей и молодых людей2.
За последние 15 лет было описано 17 синдромов АЭ с антителами против специфических нейрональных поверхностных/синаптических белков (таблица 1). Несколько примеров нейрональных мишеней включают синаптические возбуждающие рецепторы NMDAR 3,4 и AMPAR5, синаптический ингибирующий рецептор GABAbR6, нейронально секретируемый белок LGI17 и молекулу клеточной адгезии IgLON58. Для большинства из этих АЭ исследования показали, что антитела нарушают структуру или функцию их целевого антигена, сильно поддерживая патогенную роль. Например, при анти-NMDAR энцефалите антитела реагируют с N-концевым доменом субъединицы GluN1 NMDAR, производя селективную и обратимую интернализацию этих рецепторов, что приводит к заметным нервно-психическим изменениям 4,9,10,11. Таким образом, идентификация любого из 17 известных антител в сыворотке или ликворе пациента также может быть использована в качестве диагностического теста, который устанавливает диагноз конкретной АЭ.
Один из методов, наиболее часто используемых для идентификации и характеристики этих антител, включает использование культур диссоциированных, фетальных, грызунов гиппокампальных нейронов. Эти культуры полезны по нескольким причинам: эмбриональный мозг легко диссоциируется и содержит низкий уровень глиальных клеток, основного источника загрязнения в нейронных культурах12; клеточная популяция гиппокампа относительно однородна по сравнению с большинством других областей ЦНС, причем пирамидальные клетки составляют подавляющее большинство13,14; культуры получают из эмбрионов поздней стадии, когда генерация пирамидных нейронов завершена, но гранулярные клетки еще не развились, что еще больше увеличивает однородность культуры; при культивировании пирамидальные нейроны выражают большую часть своих основных фенотипических особенностей, способны образовывать хорошо развитые дендриты и устанавливать синаптически связанные сети, которые могут быть использованы для структурных и электрофизиологических исследований12,13; поскольку антитела не могут проникать в живые нейроны, использование живых культур позволяет идентифицировать антигенные мишени, которые находятся на поверхности клетки; а иммунопреципитация комплекса антитело-антиген из нейрональных культур позволяет идентифицировать антиген-мишень5.
Успех исследований с использованием нейронных культур в значительной степени зависит от качества культур и протоколов, используемых для оценки иммунореактивности сыворотки или спинномозговой жидкости пациента (CSF). Переменные, которые могут влиять на культуры, включают процедуры выделения гиппокампа до развития культуры, диссоциацию ткани, плотность покрытия, используемую поверхность роста и составсреды 13,15,16. В этой статье представлен оптимизированный протокол для первичной клеточной культуры нейронов гиппокампа плодных крыс в сочетании с флуоресцентным иммуноокрашиванием, которое может быть использовано для определения наличия антител против известных антигенов AE и потенциально новых поверхностных мишеней. Он также предоставляет пример того, как исследовать патогенные эффекты антител NMDAR с помощью методов визуализации живых клеток с использованием культивируемых нейронов гиппокампа, экспрессирующих генетически закодированный индикатор кальция (GECI) из семейства GCaMP, GCaMP5G.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Целевой белок</td>
			<td>Функция белка</td>
			<td>Сотовый отсек</td>
			<td>Основной синдром</td>
		</tr><tr><td>НМДАР</td>
			<td>Ион Шанель</td>
			<td>Синаптический белок</td>
			<td>Анти-NMDAR энцефалит</td>
		</tr><tr><td>АМПАР</td>
			<td>Ион Шанель</td>
			<td>Синаптический белок</td>
			<td>Лимбический энцефалит</td>
		</tr><tr><td>Глюк2</td>
			<td>Ион Шанель</td>
			<td>Синаптический белок</td>
			<td>Энцефалит</td>
		</tr><tr><td>ГАБААР</td>
			<td>Ион Шанель</td>
			<td>Синаптический белок</td>
			<td>Энцефалит</td>
		</tr><tr><td>ГАБАбР</td>
			<td>Метаботропный рецептор</td>
			<td>Синаптический белок</td>
			<td>Лимбический энцефалит</td>
		</tr><tr><td>мГлюР1</td>
			<td>Метаботропный рецептор</td>
			<td>Синаптический белок</td>
			<td>Энцефалит</td>
		</tr><tr><td>мГлюР2</td>
			<td>Метаботропный рецептор</td>
			<td>Синаптический белок</td>
			<td>Энцефалит</td>
		</tr><tr><td>мГлуР5</td>
			<td>Метаботропный рецептор</td>
			<td>Синаптический белок</td>
			<td>Энцефалит</td>
		</tr><tr><td>Д2Р</td>
			<td>Метаботропный рецептор</td>
			<td>Синаптический белок</td>
			<td>Базальный ганглиевый энцефалит</td>
		</tr><tr><td>ЛГИ1</td>
			<td>Молекула адгезии</td>
			<td>Белок клеточной поверхности</td>
			<td>Лимбический энцефалит</td>
		</tr><tr><td>КАСПР2</td>
			<td>Молекула адгезии</td>
			<td>Белок клеточной поверхности</td>
			<td>Лимбический энцефалит</td>
		</tr><tr><td>ИгЛОН5</td>
			<td>Молекула адгезии</td>
			<td>Белок клеточной поверхности</td>
			<td>Анти-IgLON5 болезнь</td>
		</tr><tr><td>Нейрексин-3α</td>
			<td>Молекула адгезии</td>
			<td>Белок клеточной поверхности</td>
			<td>Энцефалит</td>
		</tr><tr><td>ДНЕР (Тр)</td>
			<td>Трансмембранный белок</td>
			<td>Белок клеточной поверхности</td>
			<td>Энцефалит</td>
		</tr><tr><td>ОЭЗ6Л</td>
			<td>Трансмембранный белок</td>
			<td>Белок клеточной поверхности</td>
			<td>Энцефалит</td>
		</tr><tr><td>Амфифизин</td>
			<td>Структурная молекула</td>
			<td>Белок клеточной поверхности</td>
			<td>Лимбический энцефалит</td>
		</tr><tr><td>DPPX</td>
			<td>Пептидаза</td>
			<td>Белок клеточной поверхности</td>
			<td>Энцефалит</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Антитела к поверхности нейрональной клетки и синаптические белки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Cell culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12-565-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm round coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9708845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x NA 0.75 S Fluor air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Super Fluor 20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12-565-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Cell culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12-565-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 100 mL</td>
			<td>Pirex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11009-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>DMEM-HXRXA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Wistar rat (18-days pregnant)</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-angled forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-curved forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11272-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Standard Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Human AF488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Capricorn</td>
			<td>HBSS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-E medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12476-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum (HS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-NMDAR antibody (CSF)</td>
			<td>Patient Sample</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-NMDAR antibody (Serum)</td>
			<td>Patient Sample</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td>v1.50i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>X0550-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cell chamber</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2-CAG-GCaMP5G</td>
			<td>VectorBiolabs</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J199943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine (PLL)</td>
			<td>Peptide international</td>
			<td>OKK-35056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene ice tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>re-used cap of a polysterene box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision spring-scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14068-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0642-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile endotoxine free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis

За последние 15 лет была охарактеризована новая категория опосредованных антителами заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) и теперь определяется как «аутоиммунный энцефалит» (АЭ). В настоящее время известно 17 синдромов АЭ, и все они связаны с антителами против поверхности нейрональных клеток или синаптическими белками. Клинические синдромы являются сложными и варьируются в зависимости от типа ассоциированного антитела. Наиболее известным из этих заболеваний является энцефалит анти-N-метил-D-аспартатного рецептора (NMDAR), который является заметным нервно-психическим расстройством, связанным с тяжелыми нарушениями памяти и поведения. Ассоциированные антитела реагируют с субъединицей GluN1 NMDAR в N-концевом домене. Подход, наиболее часто используемый для обнаружения и характеристики антител к АЭ, включает культуру диссоциированных, фетальных, грызуновых нейронов гиппокампа. В процессе характеристики антител живые нейроны в культуре подвергаются воздействию сыворотки или ликвора пациента, и обнаружение реактивности указывает на то, что сыворотка или образцы ликвора пациента содержат антитела против нейронных поверхностных антигенов. Культуры гиппокампа также могут быть использованы для определения того, являются ли антитела у пациентов потенциально патогенными, изучая, вызывают ли они структурные или функциональные изменения нейронов. Уровень успеха этих исследований зависит от качества культур и от протоколов, используемых для получения и обнаружения реактивности образцов пациентов. В данной статье представлен оптимизированный протокол для первичной клеточной культуры нейронов гиппокампа плодных крыс в сочетании с иммуноокрашиванием для определения наличия антител в сыворотке или ликворе пациентов. Также представлен пример того, как исследовать потенциальные патогенные эффекты антител NMDAR с использованием культивируемых нейронов и визуализации кальция.

Watch this Scientific Journal Video about Hippocampal Neuronal Cultures to Detect and Study New Pathogenic Antibodies Involved in Autoimmune Encephalitis at JoVE.com

Hippocampal Neuronal Cultures to Detect and Study New Pathogenic Antibodies Involved in Autoimmune Encephalitis

Аутоиммунный энцефалит – это новая категория антителоопосредованных заболеваний центральной нервной системы. Нейроны гиппокампа могут быть использованы для обнаружения и характеристики этих антител. В данной статье представлен протокол первичной клеточной культуры и иммуноокрашивания для определения аутоантител в сыворотке и спинномозговой жидкости пациентов.

Культуры нейронов гиппокампа для обнаружения и изучения новых патогенных антител, участвующих в аутоиммунном энцефалите

Over the last 15 years, a new category of antibody-mediated diseases of the central nervous system (CNS) has been characterized and is now defined as ...

Этот протокол важен тем, что позволил выявить, содержал ли образец пациента патогенные антитела. Основное преимущество этой методики заключается в ее способности дифференцировать реактивность между поверхностными и внутриклеточными антигенами, которые не могут быть легко различимы другими методами. Культурные нейроны гиппокампа используются для идентификации новых антител.Идентификация этих новых антител в конечном итоге позволяет инициировать специфическую монотерапию для улучшения результатов лечения пациентов. Этот метод важен, потому что он может быть распространен на всю область заболеваний, связанных с патогенными антителами, направленными на поверхностные белки нейронов. Удерживая голову эмбриона тонкими изогнутыми щипцами, пронзите орбиты парой мелких прямых щипцов под углом 45 градусов.Затем отпустите мелко изогнутые щипцы. С помощью хирургических ножниц рассекают кожу и череп, начиная от затылочной кости до лобной кости. Затем удалите мозг парой тонких изогнутых щипцов и соберите его в шестисантиметровую чашку с гибернацией плюс B27.Как только мозг всех эмбрионов будет восстановлен, используйте тонкие прямые щипцы, чтобы сагиттально отделить теленцефалоны. Затем приготовьте 10-сантиметровую тарелку, поместив капли спячки плюс B27 на расстоянии одного сантиметра по кругу, и поместите один теленцефалон на каплю, чтобы визуализировать через рассекающий прицел при увеличении 1,25 X. Во время работы под микроскопом осторожно удалите таламус и очистите мозговые оболочки, чтобы лучше визуализировать гиппокамп.Затем рассекните гиппокамп точными пружинными ножницами. И поместите его в 3,5-сантиметровую тарелку с гибернацией плюс В27 и истреть две. Повторите процедуру, чтобы собрать все гиппокампы.Для ферментативной диссоциации гиппокампа добавьте один миллилитр 2,5% трипсина в 50-миллилитрную трубку, содержащую гиппокамп. Доведя объем в тюбике до пяти миллилитров с HBSS, инкубируйте трубку в течение 15 минут на водяной бане при 37 градусах Цельсия. Чтобы дополнительно разбавить трипсин, добавьте 10 миллилитров предварительно нагретого HBSS, и поместите трубку обратно в водяную баню, установленную при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.Затем используйте микропипетку объемом 1000 микролитров для переноса гиппокампа, появляющегося в виде слизевой массы, в трубку размером 50 миллилитров. И инкубируйте ткань с шестью миллилитрами предварительно нагретого HBSS в течение пяти минут, как показано. Чтобы механически диссоциировать ткань, перенесите массу гиппокампа в двухмиллилитровую трубку с коническим дном.После добавления одного миллилитра предварительно нагретой среды DMEM гомогенизируйте гранулу микропипеткой 1000 микролитра, осторожно аспирируя вверх и вниз. Следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки, повторите аспирацию вверх и вниз 10-20 раз предварительно вытянутой стеклянной пипеткой с коническим концом, контактирующим с коническим дном трубки, пока смесь не станет полупрозрачной. Подсчитайте клетки, прежде чем распределить их равномерно на 3,5-сантиметровой тарелке со скрещенными встряхивающими движениями.После этого поместите блюдо в инкубатор с 5% углекислым газом. Для флуоресцентного иммуноокрашения 14-дневных клеток in vitro добавьте образец, содержащий антитела Anti-NMDAR, к покровным слипам и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Через час обработайте образец 4% формальдегидом и PBS в качестве раствора для фиксации при комнатной температуре в течение пяти минут.Затем промывайте образец тяги PBS в течение пяти минут каждый, с последующим добавлением вторичного антитела козьего античеловека Alexa Fluor 488 в разведении от одного до 1000 в течение одного часа при комнатной температуре. Затем установите крышку, содержащую образец, с жидкой монтажной средой и аспирируйте оставшуюся жидкость. Визуализируйте нейроны с помощью флуоресцентной визуализации.Для визуализации кальция используйте клетки in vitro от 14 до 18 дней, которые были выращены на покровных листах. Перед визуализацией обработайте клетки вирусным вектором, кодирующим pAAV2 CAG GCaMP 5G в 2,5 раза по 10-10 копий генома на миллилитр в течение пяти-семи дней. За день до визуализации инкубируйте клетки с образцом пациента в течение 24 часов.В день визуализации подготовьте установку и установите камеру клетки микроскопа на 37 градусов по Цельсию. Заполните дорожку дистиллированной водой, наполните ее 5% углекислым газом для поддержания физиологических условий клеток. После покрытия клеток внеклеточным физиологическим раствором перенесите их в клеточную камеру микроскопа.Добавьте 10 микромоляров NBQX для блокирования рецепторов AMPA и KA и визуализируйте реакцию рецептора NMDA. Получите фильм продолжительностью четыре минуты с кадрами, записанными каждые 100 миллисекунд. Вскоре после начала приобретения добавьте в блюдо стимулирующий раствор.При стимуляции извлекали флуоресцентный сигнал с течением времени из культуры, инкубированной с контрольной и спинномозговой жидкостью пациента или образцами ликвора с помощью программного обеспечения для обработки, такого как Image J.It было замечено, что клетки в один день in vitro были равномерно распределены и прилипли к пластине с ламеллой, развивающейся вокруг тела клетки, и незначительными нейритами, начинающими расширяться. После нескольких дней в культуре нейриты простирались на небольшое расстояние, и клетки показали значительную поляризацию. Нейронная сеть продолжала расти и усложнялась.Через 18 дней нейроны были зрелыми, взаимосвязанными и строили нейронную сеть. Репрезентные флуоресцентные изображения показывают зрелые нейроны через 18 дней с использованием селективных маркеров. Инкубация культур с образцами пациентов производила интенсивный флуоресцентный сигнал, поскольку он содержит аутоантителы, которые распознавали NMDA-рецептор, присутствующий на поверхности нейронов.Напротив, контрольные образцы не производили флуоресцентного сигнала при введении в нейронные культуры. Применение NMDA увеличивало интенсивность флуоресценции, о чем свидетельствует изменение внутриклеточной зеленой флуоресценции. Когда применялся стимулятор, нейроны, обработанные контрольным образцом CSF, показали более высокую разницу в интенсивности флуоресценции, чем клетки, обработанные образцом CSF пациентов.Выявление свойств и рассечение гиппокампа определяют чистоту культур. Агрегация клеток является ключевым фактором, особенно при использовании культур для целей визуализации. Кроме того, культивируемые нейроны гиппокампа могут быть использованы для идентификации новых антител и их целевых антигенов в сочетании с методами иммунопреципитации и масс-спектрометрии.Эта методика позволила охарактеризовать новую категорию заболеваний, опосредованных антителами. Поэтому он имеет важное значение при изучении новой области наноиммунологии.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Органотипической гиппокампа культур фрагмент

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

После вложения Immunogold маркировки синаптические белки в гиппокампе культур Slice

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Секс Стратифицированная нейронов культур для изучения ишемических: Подготовка гибель клеток

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Иммуногистохимия и множественные Маркировка с антителами из того же вида-хозяина по изучению взрослых гиппокампа нейрогенеза

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic гиппокампа ломтик культур как модель для изучения нейропротекции и инвазии опухолевых клеток

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Зависящее от времени увеличение ответа сети на стимуляцию нейронных клеточных культур на микроэлектродных массивах

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

New Methods to Study Gustatory Coding

Новые методы изучения кодирования вкуса

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...