Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع خطة ووهان للعلوم والتكنولوجيا (2018201261638501).

1. تحضير الفيروسات والبعوض
<ol><li>تحضير الفيروسات ملاحظة: نفذت جميع العمليات في مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 2 (BSL-2). وينبغي تحديد مستوى السلامة الأحيائية المستخدمة من خلال تقييم مخاطر العامل الممرض واللوائح الخاصة بالدول والأقاليم. يجب تنفيذ العملية في خزانة السلامة البيو?...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+update+of+phylum+Negarnaviricota+(Riboviria:+Orthornavirae),+including+the+large+orders+Bunyavirales+and+Mononegavirales.">Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales.</a> Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).</li><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika:+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus.">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+DENV-2+Among+Aedes+albopictus+(Diptera:+Culicidae)+Populations+in+China.">Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).</li><li>Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Zika+virus+by+SYBR+green+one-step+real-time+RT-PCR.">Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR.</a> Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+and+transcriptional+response+of+Aedes+aegypti+for+Ebinur+Lake+virus,+a+newly+mosquito-borne+orthobunyavirus.">Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Britton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-acquired+dengue+virus+infection--a+case+report.">Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).</li><li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara,+Jalisco,+Mexico+for+Zika+virus.">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).</li></ol>

كان الهدف من هذه الطريقة هو توفير تقييم شامل لمخاطر فيروس واحد ينقله البعوض من خلال تقييم كفاءة النواقل من خلال التغذية الفموية والتلقيح داخل الصدر.
في تجربة التغذية الفموية ، يجب التقاط البعوض المحتقن ونقله إلى حاوية جديدة ، مما يشكل خطرا شديدا على المشغلين. والسبب في ذلك ?...

يمكن أن تستمر الفيروسات التي ينقلها البعوض (MBVs) ، وهي مجموعة غير متجانسة من فيروسات الحمض النووي الريبي ، في ناقلات البعوض وتنتشر لاحقا إلى مضيفات الفقاريات1. يتم توزيع MBVs المهمة سريريا بشكل رئيسي في أربع عائلات فيروسية ، وهي Flaviviridae و Togaviridae و Reoviridae و Peribunyavividae 2,3. في العقود الأخيرة ، تم الإبلاغ عن هذه الفيروسات في جميع أنحاء العالم ، مما تسبب في مشاكل الصحة العامة. كواحد من أكثر فيروسات MBV المعروفة ، أصبح فيروس حمى الضنك (DENV) أكثر الفيروسات المنقولة بالمفصليات الناشئة أو معاودة الظهور انتشارا في أكثر من 100 دولة خلال السنوات ال 20الماضية 4. منذ اكتشاف فيروس زيكا (ZIKV) في الداخل ، أبلغت جميع البلدان والأقاليم المدارية وشبه المدارية تقريبا في القارة عن حالات عدوى بشرية بفيروسزيكا 5. من أجل تقييم مخاطر انتقال الفيروس ، ركزت العديد من الدراسات في السنوات الأخيرة على كفاءة البعوض الناقل لهذه الفيروسات 6,7. ونتيجة لذلك، من الأهمية بمكان الوقاية من الأمراض المنقولة بالنواقل ومكافحتها بشكل فعال.
الزاعجة المصرية (Ae. aegypti) ، وهي واحدة من أسهل أنواع البعوض التي يسهل تربيتها في المختبر ، هي ناقل مهم لفيروس حمى الضنك ، وفيروس زيكا ، وفيروس شيكونغونيا (CHIKV) ، وفيروس الحمى الصفراء (YFV)8. لفترة طويلة ، تم العثور على Ae. aegypti فقط في القارة الأفريقية وجنوب شرق آسيا ، ولكن في السنوات الأخيرة استعمرت جميع القارات تقريبا9. علاوة على ذلك ، فإن الوفرة العالمية ل Ae. aegypti تنمو باستمرار ، مع زيادة تقدر بنحو 20٪ بحلول نهاية القرن10. من عام 2004 إلى عام 2009 في الصين ، كانت هناك زيادة واضحة في كفاءة ناقل Ae. aegypti لفيروس DENV بسبب ارتفاع درجات الحرارة اليومية11. وقد ارتفع وضع Ae. aegypti باعتباره الناقل الممرض ارتفاعا ملحوظا في الصين. وبالتالي ، لمواجهة هذه التحديات ، من الضروري التحقيق في كفاءة ناقلات Ae. aegypti لنقل الفيروسات.
كمفصليات دموية ، تخترق البعوضة الأنثوية جلد مضيف الفقاريات وتتغذى على الدم. يكتسب البعوض أحيانا فيروسات من مضيفين مصابين بالفيروس ثم ينقل الفيروسات إلى مضيف جديد. وعلى هذا النحو، ولتحديد كفاءة النواقل، يتغذى البعوض على مسحوق دم اصطناعي يحتوي على فيروسات مفصلية من خلال نظام تغذية في بيئة المختبر12. يتم فصل البعوض الفردي إلى رؤوس وأجسام وإفرازات لعاب بعد عدة أيام من الإصابة. لقياس معدلات الإصابة بالفيروس وانتشاره وانتقاله ، تم الكشف عن عيار الفيروس عن طريق النسخ العكسي الكمي PCR (qRT-PCR) أو مقايسة البلاك. ومع ذلك ، لا يصاب جميع البعوض بالتهابات الأمعاء الوسطى والقدرة على نقل الفيروس إلى المضيف التالي بعد تغذية الدم. يرتبط بالحواجز الفسيولوجية للبعوض ، والتي تمنع مسببات الأمراض من اختراق الجسم وتلعب دورا حيويا في مناعتها الفطرية13. تؤثر حواجز الأمعاء الوسطى ، وخاصة حاجز عدوى الأمعاء الوسطى (MIB) وحاجز الهروب من الأمعاء الوسطى (MEB) ، على ما إذا كان الفيروس يمكن أن يصيب الناقل بشكل منهجي والكفاءة التي ينتشر بها. إنه يعيق تحليل عدوى الأنسجة الأخرى ، مثل الغدد اللعابية التي تظهر أيضا عدوى الغدد اللعابية وحواجز الهروب13,14. لتوصيف أفضل لعدوى الأمعاء الوسطى والغدد اللعابية في الناقل ، يتم عرض بروتوكول مفصل للتغذية عن طريق الفم والتلقيح داخل الصدر للفيروس arbovirus في Ae. aegypti هنا. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على حالات عدوى إضافية بالفيروسات المنقولة بالمفصليات في مجموعة متنوعة من ناقلات البعوض، مثل عدوى فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا في الزاعجة النيابة، ويمكن أن يثبت أنه إجراء عملي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

تنتشر الفيروسات التي ينقلها البعوض (MBVs) ، وهي مسببات الأمراض المعدية للفقاريات ، عن طريق العديد من أنواع البعوض ، مما يشكل تهديدا خطيرا للصحة العامة. بمجرد تناولها ، يجب أن تتغلب الفيروسات على حاجز الأمعاء الوسطى للبعوض للوصول إلى الدملمف ، حيث قد تنتشر إلى الغدد اللعابية. عندما تلدغ البعوضة ، تنتشر هذه الفيروسات إلى مضيفات فقارية جديدة. وبالمثل ، قد تلتقط البعوضة فيروسات مختلفة. بشكل عام ، قد يدخل جزء صغير فقط من الفيروسات الغدد اللعابية عبر الأمعاء. تتأثر كفاءة انتقال هذه الفيروسات إلى الغدد بحاجزين ماديين موجودين في أنواع مختلفة من البعوض: حواجز الأمعاء الوسطى وحواجز الغدد اللعابية. يقدم هذا البروتوكول طريقة للكشف عن الفيروس في الغدد اللعابية للزاعجة المصرية بعد التغذية الفموية وعدوى الحقن داخل الصدر. علاوة على ذلك ، فإن تحديد ما إذا كانت الأمعاء و / أو الغدد اللعابية تعيق انتشار الفيروس يمكن أن يساعد في تقييم مخاطر MBVs التي تنتقل عن طريق الزاعجة المصرية.

لفحص توزيع EBIV في البعوض المصاب عن طريق تغذية الدم الاصطناعي (كان العيار النهائي الفيروسي 6.4 × 106 PFU / mL) والحقن داخل الصدر (كانت الجرعة الفيروسية 340 PFU) ، تم تحديد الحمض النووي الريبي الفيروسي في اللعاب والرؤوس وأحشاء البعوض بعد 10 أيام من الإصابة (dpi).
بالنسبة ل Ae. aegypti...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

هذه المنهجية، التي شملت التغذية الفموية وعدوى الحقن داخل الصدر، يمكن أن تقيم بشكل فعال تأثير حواجز الأمعاء الوسطى و / أو الغدد اللعابية على عدوى الفيروسات المنقولة بالمفصليات.

العدوى الفيروسية التجريبية في البعوض البالغ عن طريق التغذية الفموية والحقن المجهري

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

يمكن أن يحدد هذا البروتوكول ما إذا كانت الأمعاء والغدد الدرقية تعيق انتشار الفيروس ويمكن أن يساعد في تقييم مخاطر الفيروسات التي ينقلها البعوض والتي تنتقل عن طريق الزاعجة المصرية. تضمن بروتوكولنا طريقتين للعدوى ، التغذية الفموية والحقن داخل الصدر ، والتي يمكن أن تقيم بشكل فعال كفاءة ناقل الفيروس المفصلي. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على حالات عدوى إضافية بالفيروسات المنقولة بالمفصليات في مجموعة متنوعة من ناقلات البعوض، مثل عدوى فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا في الزاعجة، ويمكن أن يثبت أنه إجراء عملي.سيوضح الإجراء فاي وانغ ، مساعد باحث من مختبري. لأداء التغذية الاصطناعية باستخدام نظام تغذية البعوض الاصطناعي ، قم بقطع أغشية الكولاجين إلى الحجم المناسب ، وقم بتثبيتها في الخزانات باستخدام الحلقات O. أضف ثلاثة ملليلتر من خليط الفيروس والدم إلى الخزانات ، وأغلق الخزانات باستخدام سدادات بلاستيكية لمنع التسرب.ضع الأكواب البلاستيكية التي تحتوي على البعوض في صندوق القفازات. قم بربط الخزانات المختومة في وحدة التغذية FU1 ، وضع خزانا واحدا على كوب واحد. قم بتشغيل وحدة الطاقة ، وإطعام البعوض لمدة ساعة واحدة.بعد الرضاعة ، قم بتخدير البعوض بالثلج لعدة ثوان حتى يغمى عليه. صب البعوض المخدر في طبق بتري وضعت على الجليد ، وتغطية الغطاء بسرعة. اختر أنثى البعوض المحتقن بالملقط ، وانقلها إلى أكواب بلاستيكية جديدة بمعدل 50 أنثى بعوضة لكل كوب.لف الكأس بشبكة ناموسية مقطوعة ، وقم بتغطيتها بغطاء به فتحة في المنتصف. قطع الاسفنجة إلى قطع صغيرة ، ووضعها على الكؤوس. أضف 8٪ محلول جلوكوز على الإسفنجة باستخدام قطارة بلاستيكية يمكن التخلص منها.ضع الأكواب التي تحتوي على إناث البعوض في الحاضنة عند 27 درجة مئوية عند رطوبة 80٪ لمدة 10 أيام. استبدل إسفنجة جديدة مشبعة بالجلوكوز كل 72 ساعة. للتلقيح داخل الصدر ، قم بإعداد البعوض الأنثوي كما هو موضح في مخطوطة النص.لتحضير تخفيف الفيروس المعدي ، قم بإزالة مخزون الفيروس من الفريزر 80 درجة مئوية ، وقم بإذابة الجليد. قم بتخفيف مخزون الفيروسات عند تخفيف فيروس 100 نانولتر يحتوي على 100 إلى 500 وحدة من وحدات تكوين البلاك مع وسيط RPMI 1640 يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. ضع تخفيف الفيروس على الثلج.بعد ذلك ، قم بإعداد إبر الحقن المجهري باستخدام Puller 1000 مع تعيين المعلمات في برنامج مجتذب الإبرة كمؤشر حرارة إلى 450 ، والقوة في g إلى 110 ، والمسافة بالمليمتر إلى واحد ، والتأخير في ثوان إلى الصفر. قطع طرف إبرة مسحوبة مع ملاقط تحت المجهر تشريح في تكبير 16x. ردم الإبرة بالزيت المعدني من خلال حقنة معقمة يمكن التخلص منها.قم بتوصيل الإبرة في الحاقن باتباع التعليمات الموجودة على الجهاز. أدخل الإبرة بعناية في أنبوب يحتوي على تخفيف الفيروس المعدي. ثم اضغط على زر التعبئة لملء ما يقرب من أربعة ميكرولترات من تخفيف الفيروس في الإبرة.بمجرد ملء الإبرة ، لا تلمس الإبرة أو تتلفها. اختر ما يقرب من 50 أنثى من البعوض المخدر بملاقط ، وضعها على طبق ثلج. ضع اللوحة تحت الحاقن ، وأدخل الإبرة في التجويف الصدري للبعوض تحت مجهر تشريح.اضبط حجم الحقن على 100 نانولتر والمعدل على 50 نانولتر في الثانية. اضغط على زر الحقن للسماح لمحلول الفيروس بالتدفق إلى البعوض. عند الحقن الناجح ، ينتفخ البطن قليلا.ضع البعوض المصاب في كوب بلاستيكي جديد يوضع على الثلج. عندما يكون عدد البعوض المصاب كافيا ، لف الكوب بشبكة ناموسية مقطوعة وقم بتغطيتها بالغطاء. لجمع اللعاب من أنثى البعوض المصابة ، صب البعوض المخدر في طبق بتري يوضع على الجليد ، وأغلق الغطاء بسرعة.ضع أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر مملوءة بزيت الغمر جنبا إلى جنب على الطين المطاطي. اختيار البعوض الإناث مع ملاقط ، ووضعها على طبق الجليد. إزالة أرجلهم وأجنحتهم مع ملاقط.ضع جزء فم بعوضة واحدة على كل طرف ماصة لجمع اللعاب كما يفرزه البعوض في الزيت في درجة حرارة الغرفة. بعد 45 إلى 60 دقيقة ، ضع أطراف الماصة في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر تحتوي على 200 ميكرولتر من الوسط المخفف للفيروس. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 5،000 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لطرد اللعاب في الأنابيب.قم بتخزين الأنابيب المحتوية على اللعاب عند 80 درجة مئوية لتحديد معدلات الإرسال لاحقا. بعد جمع اللعاب ، تشريح البعوض الإناث المصابة. باستخدام الملقط ، قم بقطع رؤوس البعوض ، وضع كل رأس في أنبوب فردي يحتوي على 200 ميكرولتر من وسط RPMI 1640.الاستيلاء على الصدر مع ملقط. ثم ، أمسك الجزء قبل الأخير من البطن بملقط آخر ، واسحب القناة الهضمية للخارج. نظف القناة الهضمية بحثا عن أي أنسجة وأعضاء طائشة.اغسل القناة الهضمية باستخدام برنامج تلفزيوني ، وضع كل أمعاء في أنبوب فردي يحتوي على 200 ميكرولتر من وسط RPMI 1640. قم بتخزين هذه الأنابيب عند 80 درجة مئوية لتحديد معدل انتشار الفيروس والعدوى لاحقا. في هذا التحليل التمثيلي ، تم تحديد الحمض النووي الريبي الفيروسي في الأمعاء والرأس واللعاب لإناث البعوض في 10 أيام بعد الإصابة.كان عيار فيروس بحيرة إبينور في أمعاء ورؤوس ولعاب البعوض الملقح داخل الصدر أعلى من البعوض المصاب عن طريق الفم. وبلغ معدل العدوى والانتشار للبعوض الملقح داخل الصدر 100 في المائة، ووجد أن معدل العدوى للبعوض المصاب عن طريق الفم كان 70 في المائة و 38.1 في المائة على التوالي. وصل معدل انتقال البعوض الملقح داخل الصدر إلى 90٪ ولكن بالنسبة للبعوض المصاب عن طريق الفم كان 4.8٪ فقط تم اختيار إناث البعوض المحتقن للحفاظ على الاتساق ، حيث تؤثر كمية التغذية على المحتوى الفيروسي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

وهو أداة تحليلية للعلبة التقييم الشامل الكيمياء الحيوية ، والهيكلية والأغشية الحيوية عن طريق الفم من Transcriptome بوساطة العقديات الطافرة

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D و 3D كروموسوم اللوحة في البعوض الملاريا

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

الكشف عن نسخة منخفضة العدد الحمض النووي الفيروسي المتكاملة التي شكلتها في المختبر عدوى التهاب الكبد باء

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

السل النمذجة في "الزرد الكبار المصابين" بكتريا مارينوم

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...