Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Forberedelse af vira og myg
<ol><li>Fremstilling af vira BEMÆRK: Alle processer blev udført i et laboratorium for biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2). Niveauet af anvendt biosikkerhedsindhold bør bestemmes af patogenets risikovurdering og regler, der er specifikke for nationer og regioner. Processen skal udføres i et biosikkerhedsskab.<ol><li>1 x 106 C6/36-celler podes i en T75-dyrkningskolbe. Kolben fyldes med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium indeholdende 10% var...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+update+of+phylum+Negarnaviricota+(Riboviria:+Orthornavirae),+including+the+large+orders+Bunyavirales+and+Mononegavirales.">Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales.</a> Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).</li><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika:+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus.">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+DENV-2+Among+Aedes+albopictus+(Diptera:+Culicidae)+Populations+in+China.">Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).</li><li>Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Zika+virus+by+SYBR+green+one-step+real-time+RT-PCR.">Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR.</a> Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+and+transcriptional+response+of+Aedes+aegypti+for+Ebinur+Lake+virus,+a+newly+mosquito-borne+orthobunyavirus.">Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Britton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-acquired+dengue+virus+infection--a+case+report.">Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).</li><li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara,+Jalisco,+Mexico+for+Zika+virus.">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).</li></ol>

Målet med denne metode var at give en omfattende risikovurdering af en myggebåren virus ved at evaluere vektorkompetence gennem oral fodring og intrathoraxpodning.
I oralfodringsforsøget skal engorged-myg udvælges og overføres til en ny beholder, hvilket udgør en alvorlig risiko for operatørerne. Årsagen til dette er, at enhver myg, herunder uinficerede myg, kan være en kilde til infektion19. Derfor skal myg først bedøves som angivet i protokollen, og derefte...

Myggebårne vira (MBV'er), en heterogen gruppe af RNA-vira, kan fortsætte i mygvektorer og derefter sprede sig til hvirveldyrværter1. De klinisk vigtige MBV'er er hovedsageligt fordelt i fire virusfamilier, nemlig Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae og Peribunyavividae 2,3. I de seneste årtier er disse vira blevet rapporteret over hele kloden og forårsager folkesundhedsproblemer. Som en af de mest kendte MBV'er er Dengue-virus (DENV) blevet den mest udbredte nye eller genopståede arbovirus i over 100 lande i løbet af de sidste 20 år4. Siden opdagelsen af zikavirus (ZIKV) inde i landet har næsten alle tropiske og subtropiske lande og territorier på kontinentet rapporteret humane ZIKV-infektioner5. For at vurdere risikoen for virusoverførsel har adskillige undersøgelser i de senere år fokuseret på mygvektorkompetence for disse vira 6,7. Som følge heraf er det afgørende effektivt at forebygge og kontrollere vektorbårne sygdomme.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), en af de lettest opdrættede myg i laboratoriet, er en vigtig vektor for DENV, ZIKV, Chikungunya-virus (CHIKV) og gul feber-virus (YFV)8. I lang tid blev Ae. aegypti udelukkende fundet på det afrikanske kontinent og i Sydøstasien, men i de senere år har det koloniseret næsten alle kontinenter9. Desuden er den globale overflod af Ae. aegypti vokset kontinuerligt med en anslået stigning på 20% ved udgangen af århundredet10. Fra 2004 til 2009 i Kina var der en tydelig stigning i Ae. aegypti vektorkompetence for DENV på grund af højere dag-til-dag temperaturer11. Status for Ae. aegypti som den patogene vektor er steget betydeligt i Kina. For at imødegå disse udfordringer er det derfor nødvendigt at undersøge Ae. aegyptis vektorkompetence til at overføre vira.
Som en hæmatofagisk leddyr gennemborer den kvindelige myg huden på en hvirveldyrvært og føder på blodet. Myg erhverver lejlighedsvis vira fra virusinficerede værter og overfører derefter virusserne til en ny vært. For at bestemme vektorkompetence fodres myg som sådan med et kunstigt blodmel indeholdende arbovirus gennem et fodringssystem i laboratorieindstillingen12. Individuelle myg adskilles i hoveder, kroppe og spytsekretioner flere dage efter infektion. For at måle virusinfektion, spredning og transmissionshastigheder er virustitere blevet påvist ved kvantitativ omvendt transkription PCR (qRT-PCR) eller plaqueassay. Imidlertid udvikler ikke alle myg midgutinfektioner og evnen til at overføre en virus til den næste vært efter blodfodring. Det er forbundet med myggenes fysiologiske barrierer, som forhindrer patogener i at trænge ind i kroppen og spiller en afgørende rolle i deres medfødte immunitet13. Midgut-barriererne, især midgut-infektionsbarrieren (MIB) og midgut-flugtbarrieren (MEB), påvirker, om virussen kan inficere vektoren systemisk og den effektivitet, hvormed den spredes. Det forhindrer analysen af andre vævs infektion, såsom spytkirtler, som også udviser spytkirtelinfektion og undslipper barrierer13,14. For bedre at karakterisere infektionen af midguts og spytkirtler i vektoren præsenteres en detaljeret protokol for oral fodring og intrathoraxinokulation af arbovirus i Ae. aegypti heri. Denne protokol kan anvendes på yderligere arbovirusinfektioner i en række mygvektorer, såsom DENV- og ZIKV-infektion i Aedes spp., Og kan vise sig at være en praktisk procedure.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

Myggebårne vira (MBV'er), som er infektiøse patogener for hvirveldyr, spredes af mange myggearter, hvilket udgør en alvorlig trussel mod folkesundheden. Når de er indtaget, skal virusserne overvinde myggens midgutbarriere for at nå hæmolymfen, hvorfra de potentielt kan sprede sig til spytkirtlerne. Når en myg bider, spredes disse vira til nye hvirveldyrværter. På samme måde kan myggen afhente forskellige vira. Generelt kan kun en lille del af vira komme ind i spytkirtlerne via tarmen. Overførselseffektiviteten af disse vira til kirtlerne påvirkes af de to fysiske barrierer, der findes i forskellige myggearter: midgutbarrierer og spytkirtler. Denne protokol præsenterer en metode til viruspåvisning i spytkirtler af Aedes aegyptis følgende oral fodring og intrathoraxinjektionsinfektion. Desuden kan bestemmelse af, om tarmene og / eller spytkirtlerne forhindrer viral spredning, hjælpe med risikovurderingen af MBV'er overført af Aedes aegypti.

For at undersøge EBIV-fordelingen i de inficerede myg via kunstig blodfodring (den virale sluttiter var 6,4 x 106 PFU/ml) og intrathoraxinjektion (virusdosis var 340 PFU) blev virale RNA'er i myggenes spyt, hoveder og tarme 10 dage efter infektion (dpi) bestemt.
For Ae. aegypti var virustiteren af EBIV i tarmene, hovederne og spyttet hos de intrathorakisk podede hunmyg meget højere end hos de oralinficerede hunmyg (figur 2A-C...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Denne metode, som omfattede oral fodring og intrathorax injektionsinfektion, kunne effektivt vurdere indflydelsen af midgut og / eller spytkirtelbarrierer på arbovirusinfektion.

Eksperimentel virusinfektion hos voksne myg ved oral fodring og mikroinjektion

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Denne protokol kan afgøre, om tarmene og skjoldbruskkirtlen hindrer viral spredning og kan hjælpe med risikovurderinger af myggebårne vira, der overføres af Aedes aegypti. Vores protokol omfattede to infektionsmetoder, oral fodring og intrathoraxinjektion, som effektivt kunne vurdere arbovirusets vektorkompetence. Denne protokol kan anvendes på yderligere arbovirusinfektioner i en række mygvektorer, såsom Dengue-virus og Zika-virusinfektion i Aedes, og kan vise sig at være en praktisk procedure.Demonstration af proceduren vil være Fei Wang, en forskningsassistent fra mit laboratorium. For at udføre kunstig fodring ved hjælp af det kunstige mygfodringssystem skal du skære kollagenmembranerne til den passende størrelse og fastgøre dem til reservoirerne med O-ringene. Tilsæt tre ml af virus-blodblandingen til reservoirerne, og forsegl reservoirerne ved hjælp af plastikpropper for at forhindre lækager.Sæt plastikkopperne med myg i handskerummet. Skru de forseglede reservoirer ind i FU1-føderen, og sæt et reservoir på en kop. Tænd for strømforsyningen, og fodre myggene i en time.Efter fodring bedøves myggene med is i flere sekunder, indtil de besvimer. Hæld de bedøvede myg i en petriskål placeret på is, og dæk låget hurtigt. Vælg engorged kvindelige myg med tang, og overfør dem til nye plastik kopper på 50 kvindelige myg per kop.Pakk koppen med et skåret myggenet, og dæk det med et låg med et hul i midten. Skær svampen i små stykker, og læg dem på kopperne. Tilsæt 8% glukoseopløsning på svampen ved hjælp af en engangsdråber af plast.Placer kopperne indeholdende kvindelige myg i inkubatoren ved 27 grader Celsius ved 80%fugtighed i 10 dage. Udskift en ny glukosemættet svamp hver 72. time. Til intrathoracic inokulation skal du forberede kvindelige myg som beskrevet i tekstmanuskriptet.For at forberede den infektiøse virusfortynding skal du fjerne virusbestanden fra fryseren med 80 grader Celsius og optø dem på is. Fortyndet viruslager ved en 100-nanoliter virusfortynding indeholdende 100 til 500 plakdannende enhedsvirus med RPMI 1640-medium indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Anbring virusfortyndingen på is.Forbered derefter mikroinjektionsnålene ved hjælp af en Puller 1000 med parametrene i nåleudtrækningsprogrammet indstillet som varmeindeks til 450, kraft i g til 110, afstand i millimeter til en og forsinkelse i sekunder til nul. Skær spidsen af en trukket nål med pincet under et dissekerende mikroskop ved 16x forstørrelse. Fyld kanylen tilbage med mineralolie gennem en steril engangssprøjte.Sæt nålen på injektoren ved at følge instruktionerne på maskinen. Stik forsigtigt nålen ind i et rør, der indeholder en infektiøs virusfortynding. Tryk derefter på knappen Fyld for at fylde ca. fire mikroliter virusfortynding i nålen.Når nålen er fyldt, må nålen ikke berøres eller beskadiges. Vælg ca. 50 kvindelige bedøvede myg med pincet, og læg dem på en isplade. Placer pladen under injektoren, og indsæt nålen i myggens brysthule under et dissekerende mikroskop.Indstil injektionsvolumenet til 100 nanoliter og hastigheden til 50 nanoliter pr. Sekund. Tryk på knappen Injicer for at lade virusopløsningen strømme ind i myggen. Efter vellykket injektion bøjer maven lidt.Sæt den inficerede myg i en ny plastikkop placeret på is. Når antallet af inficerede myg er nok, skal du pakke koppen med et skåret myggenet og dække det med låget. For at samle spyt fra de inficerede kvindelige myg, hæld de bedøvede myg i en petriskål placeret på is og luk låget hurtigt.Placer 10 mikroliter pipettespidser fyldt med nedsænkningsolie side om side på gummimudderet. Vælg de kvindelige myg med pincet, og læg dem på en isplade. Fjern deres ben og vinger med pincet.Placer munddelen af en myg på hver pipettespids for at opsamle spyt, som udskilles i olien af myggene ved stuetemperatur. Efter 45 til 60 minutter anbringes pipettespidserne i 1,5 ml reagensglas indeholdende 200 mikroliter virusfortyndingsmedium. Centrifuger rørene ved 5.000 g i fem minutter ved fire grader Celsius for at udvise spyt i rørene.Opbevar de spytholdige rør ved 80 grader Celsius til efterfølgende bestemmelse af transmissionshastigheder. Efter spytopsamling dissekeres de inficerede kvindelige myg. Brug pincet til at skære myggenes hoveder og placere hvert hoved i et individuelt rør indeholdende 200 mikroliter RPMI 1640 medium.Grib brystkassen med en pincet. Tag derefter fat i det næstsidste segment af maven med en anden pincet, og træk tarmen ud. Rens tarmen for omstrejfende væv og organer.Vask tarmen med PBS, og læg hver tarm i et individuelt rør indeholdende 200 mikroliter RPMI 1640 medium. Opbevar disse rør ved 80 grader Celsius til efterfølgende bestemmelse af virusspredning og infektionshastighed. I denne repræsentative analyse blev virale RNA'er i tarmen, hovedet og spyt hos de kvindelige myg 10 dage efter infektion bestemt.Virustiteren af Ebinur Lake-virus i tarmene, hovederne og spyttet hos de intrathoracisk podede myg var højere end hos de oralinficerede myg. Infektions- og spredningsraten for de intrathorakisk podede myg var 100%, og for de oralinficerede myg viste sig at være henholdsvis 70% og 38,1%. Transmissionshastigheden for de intrathoracisk podede myg nåede op til 90%men for de oralinficerede myg var kun 4,8%De engorged kvindelige myg blev plukket for at opretholde konsistens, da fodringsmængden påvirker virusindholdet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrkning Mikroglia fra Neonatal og Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D og 3D kromosom maleri i malaria myg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Udviklingen af ​​Frysetørret Loop-medierede Isotermiske Amplification reagenser til påvisning af<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling Influenza neuraminidase Inhibering Antistoftitere af Enzyme-linked lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Påvisning af lav kopi nummer integreret Viral DNA dannet af In Vitro Hepatitis B infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modellering tuberkulose i Mycobacterium marinum inficeret voksen zebrafisk

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...