Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le projet de plan scientifique et technologique de Wuhan (2018201261638501).

1. Préparation de virus et de moustiques
<ol><li>Préparation des virus REMARQUE : Tous les procédés ont été effectués dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Le niveau de biosécurité utilisé doit être déterminé par l’évaluation des risques de l’agent pathogène et les réglementations spécifiques aux pays et aux régions. Le processus doit être effectué dans une enceinte de biosécurité.<ol><li>Inoculer 1 x 106 cellules C6/36 dans une fiole de cultu...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+update+of+phylum+Negarnaviricota+(Riboviria:+Orthornavirae),+including+the+large+orders+Bunyavirales+and+Mononegavirales.">Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales.</a> Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).</li><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika:+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus.">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+DENV-2+Among+Aedes+albopictus+(Diptera:+Culicidae)+Populations+in+China.">Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).</li><li>Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Zika+virus+by+SYBR+green+one-step+real-time+RT-PCR.">Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR.</a> Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+and+transcriptional+response+of+Aedes+aegypti+for+Ebinur+Lake+virus,+a+newly+mosquito-borne+orthobunyavirus.">Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Britton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-acquired+dengue+virus+infection--a+case+report.">Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).</li><li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara,+Jalisco,+Mexico+for+Zika+virus.">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).</li></ol>

L’objectif de cette méthode était de fournir une évaluation complète des risques d’un virus transmis par les moustiques en évaluant la compétence des vecteurs par l’alimentation orale et l’inoculation intrathoracique.
Dans l’expérience d’alimentation orale, les moustiques engorgés doivent être choisis et transférés dans un nouveau conteneur, ce qui pose un risque grave pour les opérateurs. La raison en est que tout moustique, y compris les moustiques non infectés, pour...

Les virus transmis par les moustiques (MBV), un groupe hétérogène de virus à ARN, peuvent persister chez les moustiques vecteurs et se propager ensuite aux hôtes vertébrés1. Les MBV cliniquement importants sont principalement répartis dans quatre familles de virus, à savoir Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae et Peribunyavividae 2,3. Au cours des dernières décennies, ces virus ont été signalés partout dans le monde, causant des problèmes de santé publique. En tant que l’un des MBV les plus connus, le virus de la dengue (DENV) est devenu l’arbovirus émergent ou ré-émergent le plus répandu dans plus de 100 pays au cours des 20 dernières années4. Depuis la découverte du virus Zika (ZIKV) à l’intérieur des terres, presque tous les pays et territoires tropicaux et subtropicaux du continent ont signalé des infections humaines par le ZIKV5. Afin d’évaluer le risque de transmission du virus, de nombreuses études menées ces dernières années ont porté sur la compétence des moustiques vecteurs pour ces virus 6,7. Par conséquent, il est essentiel de prévenir et de contrôler efficacement les maladies à transmission vectorielle.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), l’un des moustiques les plus faciles à élever en laboratoire, est un vecteur important du DENV, du ZIKV, du virus Chikungunya (CHIKV) et du virus de la fièvre jaune (YFV)8. Pendant longtemps, Ae. aegypti n’a été trouvé que sur le continent africain et en Asie du Sud-Est, mais ces dernières années, il a colonisé presque tous les continents9. En outre, l’abondance mondiale d’Ae. aegypti n’a cessé de croître, avec une augmentation estimée à 20% d’ici la fin du siècle10. De 2004 à 2009 en Chine, il y a eu une augmentation évidente de la compétence du vecteur Ae. aegypti pour le DENV en raison des températures quotidiennes plus élevées11. Le statut d’Ae. aegypti en tant que vecteur pathogène a considérablement augmenté en Chine. Par conséquent, pour relever ces défis, il est nécessaire d’étudier la compétence vectorielle des Ae. aegypti pour transmettre des virus.
En tant qu’arthropode hématophage, le moustique femelle perce la peau d’un hôte vertébré et se nourrit du sang. Les moustiques acquièrent parfois des virus auprès d’hôtes infectés par des virus, puis transfèrent les virus à un nouvel hôte. Ainsi, pour déterminer la compétence des vecteurs, les moustiques sont nourris avec une farine de sang artificielle contenant des arbovirus grâce à un système d’alimentation en laboratoire12. Les moustiques individuels sont séparés en têtes, corps et sécrétions de salive plusieurs jours après l’infection. Pour mesurer les taux d’infection, de dissémination et de transmission du virus, les titres de virus ont été détectés par PCR quantitative à transcription inverse (qRT-PCR) ou dosage de plaque. Cependant, tous les moustiques ne développent pas d’infections de l’intestin moyen et la capacité de transférer un virus à l’hôte suivant après l’alimentation par le sang. Il est lié aux barrières physiologiques des moustiques, qui empêchent les agents pathogènes de pénétrer dans le corps et jouent un rôle essentiel dans leur immunité innée13. Les barrières de l’intestin moyen, en particulier la barrière d’infection de l’intestin moyen (MIB) et la barrière de fuite de l’intestin moyen (MEB), influencent si le virus pourrait infecter le vecteur par voie systémique et l’efficacité avec laquelle il se propage. Il entrave l’analyse de l’infection d’autres tissus, tels que les glandes salivaires qui présentent également une infection des glandes salivaires et échappentaux barrières 13,14. Pour mieux caractériser l’infection de l’intestin moyen et des glandes salivaires chez le vecteur, un protocole détaillé pour l’alimentation orale et l’inoculation intrathoracique de l’arbovirus chez Ae. aegypti est présenté ici. Ce protocole pourrait être appliqué à d’autres infections à arbovirus chez divers moustiques vecteurs, tels que l’infection par le DENV et le ZIKV chez Aedes spp., et pourrait s’avérer une procédure pratique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

Les virus transmis par les moustiques (MBV), qui sont des agents pathogènes infectieux pour les vertébrés, sont propagés par de nombreuses espèces de moustiques, ce qui constitue une grave menace pour la santé publique. Une fois ingérés, les virus doivent surmonter la barrière de l’intestin moyen des moustiques pour atteindre l’hémolymphe, d’où ils pourraient potentiellement se propager aux glandes salivaires. Lorsqu’un moustique pique, ces virus se propagent à de nouveaux hôtes vertébrés. De même, le moustique peut attraper différents virus. En général, seule une infime partie des virus peut pénétrer dans les glandes salivaires par l’intestin. L’efficacité de transmission de ces virus aux glandes est affectée par les deux barrières physiques trouvées chez différentes espèces de moustiques: les barrières de l’intestin moyen et les barrières des glandes salivaires. Ce protocole présente une méthode de détection du virus dans les glandes salivaires d’Aedes aegypti après une infection par voie orale et par injection intrathoracique. De plus, déterminer si les intestins et/ou les glandes salivaires entravent la propagation virale peut aider à évaluer les risques de MBV transmis par Aedes aegypti.

Pour examiner la distribution du VEB chez les moustiques infectés par injection sanguine artificielle (le titre final viral était de 6,4 x 106 UFP/mL) et par injection intrathoracique (la dose virale était de 340 UFP), les ARN viraux dans la salive, la tête et les intestins des moustiques 10 jours après l’infection (dpi) ont été déterminés.
Dans le cas d’Ae. aegypti, le titre du virus de l’EBIV dans les intestins, la tête et la salive des moustiques...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Cette méthodologie, qui comprenait l’alimentation par voie orale et l’infection par injection intrathoracique, pourrait évaluer efficacement l’influence des barrières de l’intestin moyen et / ou des glandes salivaires sur l’infection à arbovirus.

Infection virale expérimentale chez les moustiques adultes par alimentation orale et micro-injection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Ce protocole peut déterminer si les intestins et les glandes thyroïdes entravent la propagation virale et peut aider à évaluer les risques de virus transmis par les moustiques transmis par Aedes aegypti. Notre protocole comprenait deux méthodes d’infection, l’alimentation orale et l’injection intrathoracique, qui pouvaient évaluer efficacement la compétence vectorielle de l’arbovirus. Ce protocole pourrait être appliqué à d’autres infections à arbovirus chez divers moustiques vecteurs, tels que le virus de la dengue et l’infection par le virus Zika chez Aedes, et pourrait s’avérer une procédure réalisable.La démonstration de la procédure sera Fei Wang, un assistant de recherche de mon laboratoire. Pour effectuer une alimentation artificielle à l’aide du système d’alimentation artificiel contre les moustiques, coupez les membranes de collagène à la taille appropriée et fixez-les aux réservoirs avec les joints toriques. Ajoutez trois millilitres du mélange virus-sang dans les réservoirs et scellez les réservoirs à l’aide de bouchons en plastique pour éviter les fuites.Mettez les gobelets en plastique contenant des moustiques dans la boîte à gants. Vissez les réservoirs scellés dans le chargeur FU1 et placez un réservoir sur une tasse. Allumez l’unité d’alimentation et nourrissez les moustiques pendant une heure.Après s’être nourris, anesthésiez les moustiques avec de la glace pendant plusieurs secondes jusqu’à ce qu’ils s’évanouissent. Versez les moustiques anesthésiés dans une boîte de Petri placée sur de la glace et couvrez rapidement le couvercle. Choisissez des moustiques femelles engorgées avec des forceps et transférez-les dans de nouveaux gobelets en plastique à 50 moustiques femelles par tasse.Enveloppez la tasse avec un filet de moustiquaire coupé et couvrez-la d’un couvercle percé d’un trou au milieu. Coupez l’éponge en petits morceaux et mettez-les sur les tasses. Ajouter la solution de glucose à 8% sur l’éponge à l’aide d’un compte-gouttes jetable en plastique.Placez les tasses contenant des moustiques femelles dans l’incubateur à 27 degrés Celsius à 80% d’humidité pendant 10 jours. Remplacez une nouvelle éponge saturée en glucose toutes les 72 heures. Pour l’inoculation intrathoracique, préparer les moustiques femelles comme décrit dans le manuscrit.Pour préparer la dilution du virus infectieux, retirez le stock de virus du congélateur à 80 degrés Celsius et décongelez-le sur de la glace. Diluer le stock de virus à une dilution virale de 100 nanolitres contenant 100 à 500 unités formant des plaques virales avec un milieu RPMI 1640 contenant 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine. Placer la dilution du virus sur de la glace.Ensuite, préparez les aiguilles de micro-injection à l’aide d’un Puller 1000 avec les paramètres du programme d’extraction d’aiguilles réglés comme indice de chaleur à 450, force en g à 110, distance en millimètre à un et retard en secondes à zéro. Couper la pointe d’une aiguille tirée avec une pince à épiler au microscope à dissection à un grossissement de 16x. Remplissez l’aiguille avec de l’huile minérale à l’aide d’une seringue stérile jetable.Fixez l’aiguille dans l’injecteur en suivant les instructions de la machine. Insérez soigneusement l’aiguille dans un tube contenant une dilution virale infectieuse. Ensuite, appuyez sur le bouton Fill pour remplir environ quatre microlitres de dilution virale dans l’aiguille.Une fois l’aiguille remplie, ne touchez pas et n’endommagez pas l’aiguille. Choisissez environ 50 moustiques anesthésiés femelles avec une pince à épiler et placez-les sur une plaque de glace. Placez la plaque sous l’injecteur et insérez l’aiguille dans la cavité thoracique du moustique sous un microscope à dissection.Réglez le volume d’injection sur 100 nanolitres et le débit sur 50 nanolitres par seconde. Appuyez sur le bouton Injecter pour laisser la solution virale s’écouler dans le moustique. En cas d’injection réussie, l’abdomen se gonfle légèrement.Mettez le moustique infecté dans un nouveau gobelet en plastique placé sur de la glace. Lorsque le nombre de moustiques infectés est suffisant, enveloppez la tasse avec un filet de moustiquaire coupé et couvrez-le avec le couvercle. Pour recueillir la salive des moustiques femelles infectées, versez les moustiques anesthésiés dans une boîte de Petri placée sur de la glace et fermez le couvercle rapidement.Placez côte à côte des embouts de pipette de 10 microlitres remplis d’huile d’immersion sur la boue de caoutchouc. Choisissez les moustiques femelles avec une pince à épiler et placez-les sur une plaque de glace. Enlevez leurs pattes et leurs ailes avec une pince à épiler.Placez la partie buccale d’un moustique sur chaque pointe de pipette pour recueillir la salive sécrétée dans l’huile par les moustiques à température ambiante. Après 45 à 60 minutes, placez les embouts des pipettes dans des tubes de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de milieu diluant pour virus. Centrifuger les tubes à 5 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour expulser la salive dans les tubes.Entreposer les tubes contenant de la salive à 80 degrés Celsius pour déterminer ensuite les taux de transmission. Après la collecte de salive, disséquez les moustiques femelles infectées. À l’aide d’une pince à épiler, coupez la tête des moustiques et placez chaque tête dans un tube individuel contenant 200 microlitres de milieu RPMI 1640.Saisissez le thorax avec une pince à épiler. Ensuite, saisissez l’avant-dernier segment de l’abdomen avec une autre pince à épiler et retirez l’intestin. Nettoyez l’intestin pour tout tissu et organe errant.Lavez l’intestin avec du PBS et placez chaque intestin dans un tube individuel contenant 200 microlitres de milieu RPMI 1640. Conservez ces tubes à 80 degrés Celsius pour déterminer ensuite la dissémination du virus et le taux d’infection. Dans cette analyse représentative, les ARN viraux dans l’intestin, la tête et la salive des moustiques femelles 10 jours après l’infection ont été déterminés.Le titre du virus du lac Ebinur dans les intestins, la tête et la salive des moustiques inoculés par voie intrathoracique était plus élevé que celui des moustiques infectés par voie orale. Le taux d’infection et de dissémination des moustiques inoculés par voie intrathoracique était de 100 % et de 70 % et 38,1 % respectivement pour les moustiques infectés par voie orale. Le taux de transmission des moustiques inoculés par voie intrathoracique a atteint jusqu’à 90%, mais pour les moustiques infectés par voie orale, il n’était que de 4,8%Les moustiques femelles engorgées ont été cueillies pour maintenir la consistance, car la quantité d’alimentation affecte le contenu viral.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Une analyse boîte à outils de l&#39;évaluation biochimique, structurel et transcriptomique globale des biofilms buccaux médiée par Streptococcus mutans

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Recherche

Immunologie et infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l&#39;adulte

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Peinture chromosomique 2D et 3D chez les moustiques du paludisme

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Détection de faibles copies numéro ADN Viral intégré formé par In Vitro l’infection par l’hépatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modélisation de la tuberculose chez Mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...