Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch das Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501) unterstützt.

1. Vorbereitung von Viren und Mücken
<ol><li>Präparation von Viren HINWEIS: Alle Prozesse wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Der Grad der verwendeten biologischen Sicherheit sollte durch die Risikobewertung des Erregers und die länder- und regionsspezifischen Vorschriften bestimmt werden. Der Prozess muss in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.<ol><li>1 x 106 C6 /36-Zellen in einen T75-Kulturkolben impfen. Füllen Sie den Kolben mit 10 ...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. 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F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. 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Das Ziel dieser Methode war es, eine umfassende Risikobewertung für ein durch Stechmücken übertragenes Virus zu ermöglichen, indem die Vektorkompetenz durch orale Ernährung und intrathorakale Inokulation bewertet wurde.
Bei dem oralen Fütterungsexperiment müssen die angeschwollenen Mücken herausgesucht und in einen neuen Behälter umgepflanzt werden, was ein ernsthaftes Risiko für die Bediener darstellt. Der Grund dafür ist, dass jede Mücke, einschließlich nicht infizierter Mücken...

Durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs), eine heterogene Gruppe von RNA-Viren, können in Mückenvektoren persistieren und sich anschließend auf Wirbeltierwirte ausbreiten1. Die klinisch bedeutsamen MBVs sind hauptsächlich in vier Virusfamilien verteilt, nämlich Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae und Peribunyavividae 2,3. In den letzten Jahrzehnten wurden diese Viren auf der ganzen Welt gemeldet und verursachten Probleme für die öffentliche Gesundheit. Als eines der bekanntesten MBVs hat sich das Dengue-Virus (DENV) in den letzten 20 Jahren in über 100 Ländern zum am weitesten verbreiteten neu auftretenden oder wieder auftretenden Arbovirus entwickelt4. Seit der Entdeckung des Zika-Virus (ZIKV) im Landesinneren haben fast alle tropischen und subtropischen Länder und Territorien des Kontinents ZIKV-Infektionen beim Menschen gemeldet5. Um das Risiko einer Virusübertragung abschätzen zu können, haben sich in den letzten Jahren zahlreiche Studien auf die Vektorkompetenz von Stechmücken für diese Viren konzentriert 6,7. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, durch Vektoren übertragene Krankheiten wirksam zu verhindern und zu kontrollieren.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), eine der am leichtesten zu züchtenden Stechmücken im Labor, ist ein wichtiger Vektor von DENV, ZIKV, Chikungunya-Virus (CHIKV) und Gelbfiebervirus (YFV)8. Lange Zeit kam Ae. aegypti nur auf dem afrikanischen Kontinent und in Südostasien vor, hat aber in den letzten Jahren fast alle Kontinente besiedelt9. Darüber hinaus hat die weltweite Häufigkeit von Ae. aegypti kontinuierlich zugenommen, mit einem geschätzten Anstieg von 20 % bis zum Ende des Jahrhunderts10. Von 2004 bis 2009 gab es in China einen deutlichen Anstieg der Ae. aegypti-Vektorkompetenz für DENV aufgrund höherer Tagestemperaturen11. Der Status von Ae. aegypti als pathogener Vektor ist in China deutlich gestiegen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, ist es daher notwendig, die Vektorkompetenz von Ae. aegypti zur Übertragung von Viren zu untersuchen.
Als hämatophager Gliederfüßer durchbohrt die weibliche Stechmücke die Haut eines Wirbeltierwirts und ernährt sich vom Blut. Stechmücken erwerben gelegentlich Viren von virusinfizierten Wirten und übertragen die Viren dann auf einen neuen Wirt. Um die Vektorkompetenz zu bestimmen, werden Stechmücken daher über ein Fütterungssystem in der Laborumgebung mit einem künstlichen Blutmehl gefüttert, das Arboviren enthält12. Einzelne Stechmücken werden einige Tage nach der Infektion in Köpfe, Körper und Speichelsekrete getrennt. Zur Messung der Virusinfektion, -verbreitung und -übertragungsraten wurden Virustiter mittels quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR) oder Plaque-Assay nachgewiesen. Allerdings entwickeln nicht alle Mücken Mitteldarminfektionen und die Fähigkeit, ein Virus nach der Blutfütterung auf den nächsten Wirt zu übertragen. Es ist mit den physiologischen Barrieren der Mücken verbunden, die das Eindringen von Krankheitserregern in den Körper verhindern und eine wichtige Rolle für ihre angeborene Immunität spielen13. Die Mitteldarmbarrieren, insbesondere die Mitteldarm-Infektionsbarriere (MIB) und die Mitteldarm-Escape-Barriere (MEB), beeinflussen, ob das Virus den Vektor systemisch infizieren kann und mit welcher Effizienz es sich ausbreitet. Es behindert die Analyse der Infektion anderer Gewebe, wie z. B. Speicheldrüsen, die ebenfalls eine Speicheldrüseninfektion aufweisen, und Fluchtbarrieren13,14. Um die Infektion von Mitteldärmen und Speicheldrüsen im Vektor besser charakterisieren zu können, wird hier ein detailliertes Protokoll für die orale Ernährung und intrathorakale Inokulation von Arboviren bei Ae. aegypti vorgestellt. Dieses Protokoll könnte auf zusätzliche Arbovirusinfektionen in einer Vielzahl von Mückenvektoren angewendet werden, wie z. B. die DENV- und ZIKV-Infektion bei Aedes spp., und könnte sich als praktikables Verfahren erweisen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

Durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs), die infektiöse Krankheitserreger für Wirbeltiere sind, werden von vielen Mückenarten verbreitet und stellen eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Nach der Aufnahme müssen die Viren die Mitteldarmbarriere der Mücken überwinden, um die Hämolymphe zu erreichen, von wo aus sie sich möglicherweise auf die Speicheldrüsen ausbreiten können. Wenn eine Mücke sticht, werden diese Viren auf neue Wirbeltierwirte übertragen. In ähnlicher Weise kann die Mücke verschiedene Viren aufnehmen. In der Regel kann nur ein winziger Teil der Viren über den Darm in die Speicheldrüsen gelangen. Die Übertragungseffizienz dieser Viren auf die Drüsen wird durch die beiden physikalischen Barrieren beeinflusst, die bei verschiedenen Mückenarten zu finden sind: Mitteldarmbarrieren und Speicheldrüsenbarrieren. Dieses Protokoll stellt eine Methode zum Virusnachweis in Speicheldrüsen von Aedes aegypti nach oraler Nahrungsaufnahme und intrathorakaler Injektionsinfektion dar. Darüber hinaus kann die Feststellung, ob der Darm und/oder die Speicheldrüsen die Virusausbreitung behindern, bei der Risikobewertung von MBVs helfen, die von Aedes aegypti übertragen werden.

Um die EBIV-Verteilung in den infizierten Stechmücken mittels künstlicher Blutfütterung (der virale Endtiter betrug 6,4 x 106 PFU/ml) und intrathorakaler Injektion (die Virusdosis betrug 340 PFU) zu untersuchen, wurden virale RNAs in Speichel, Kopf und Darm der Mücken 10 Tage nach der Infektion (dpi) bestimmt.
Bei Ae. aegypti war der Virustiter von EBIV in den Eingeweiden, Köpfen und im Speichel der intrathorakal inokulierten weiblichen Stechmücken viel höhe...

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Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Diese Methodik, die orale Ernährung und intrathorakale Injektionsinfektionen umfasste, konnte den Einfluss von Mitteldarm- und/oder Speicheldrüsenbarrieren auf die Arbovirusinfektion effektiv bewerten.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Dieses Protokoll kann feststellen, ob der Darm und die Schilddrüsen die Ausbreitung des Virus verhindern, und kann bei der Risikobewertung von durch Mücken übertragenen Viren helfen, die von Aedes aegypti übertragen werden. Unser Protokoll umfasste zwei Infektionsmethoden, die orale Ernährung und die intrathorakale Injektion, die die Vektorkompetenz des Arbovirus effektiv beurteilen konnten. Dieses Protokoll könnte auf zusätzliche Arbovirusinfektionen in einer Vielzahl von Mückenvektoren, wie z. B. Dengue-Virus und Zika-Virusinfektion in Aedes, angewendet werden und könnte sich als praktikables Verfahren erweisen.Fei Wang, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren. Um eine künstliche Ernährung mit dem künstlichen Mückenfütterungssystem durchzuführen, schneiden Sie die Kollagenmembranen auf die entsprechende Größe zu und befestigen Sie sie mit den O-Ringen an den Reservoirs. Geben Sie drei Milliliter des Virus-Blut-Gemisches in die Reservoirs und verschließen Sie die Reservoirs mit Plastikstopfen, um Leckagen zu vermeiden.Legen Sie die Plastikbecher mit Mücken in das Handschuhfach. Schrauben Sie die versiegelten Behälter in den FU1-Feeder und stellen Sie einen Behälter auf eine Tasse. Schalten Sie das Netzteil ein und füttern Sie die Mücken eine Stunde lang.Betäuben Sie die Mücken nach dem Füttern einige Sekunden lang mit Eis, bis sie ohnmächtig werden. Gießen Sie die betäubten Mücken in eine auf Eis gestellte Petrischale und decken Sie den Deckel schnell ab. Pflücken Sie angeschwollene weibliche Mücken mit einer Pinzette und übertragen Sie sie in neue Plastikbecher mit 50 weiblichen Mücken pro Becher.Wickeln Sie den Becher mit einem abgeschnittenen Moskitonetz ein und decken Sie ihn mit einem Deckel mit einem Loch in der Mitte ab. Schneiden Sie den Biskuit in kleine Stücke und legen Sie sie auf die Tassen. Geben Sie 8%ige Glukoselösung mit einer Einwegpipette aus Kunststoff auf den Schwamm.Stellen Sie die Becher mit weiblichen Mücken 10 Tage lang bei 27 Grad Celsius und 80 % Luftfeuchtigkeit in den Inkubator. Ersetzen Sie alle 72 Stunden einen neuen glukosegesättigten Schwamm. Für die intrathorakale Inokulation bereiten Sie weibliche Stechmücken wie im Textmanuskript beschrieben vor.Um die infektiöse Virusverdünnung vorzubereiten, nehmen Sie den Virusbestand aus dem 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und tauen Sie ihn auf Eis auf. Verdünnen Sie den Virusbestand bei einer 100-Nanoliter-Virusverdünnung, die 100 bis 500 plaquebildende Einheiten des Virus enthält, mit RPMI 1640-Medium, das 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält. Legen Sie die Virusverdünnung auf Eis.Als nächstes bereiten Sie die Mikroinjektionsnadeln mit einem Puller 1000 vor, wobei die Parameter im Nadelzieherprogramm als Hitzeindex auf 450, Kraft in g auf 110, Abstand in Millimeter auf eins und Verzögerung in Sekunden auf Null eingestellt sind. Schneiden Sie die Spitze einer gezogenen Nadel mit einer Pinzette unter einem Präpariermikroskop bei 16-facher Vergrößerung ab. Füllen Sie die Nadel mit Mineralöl über eine sterile Einwegspritze auf.Setzen Sie die Nadel gemäß den Anweisungen auf der Maschine in den Injektor ein. Führen Sie die Nadel vorsichtig in ein Röhrchen ein, das eine infektiöse Virusverdünnung enthält. Drücken Sie dann die Fülltaste, um etwa vier Mikroliter Virusverdünnung in die Nadel zu füllen.Sobald die Nadel gefüllt ist, berühren oder beschädigen Sie die Nadel nicht. Nehmen Sie etwa 50 weibliche betäubte Mücken mit einer Pinzette und legen Sie sie auf einen Eisteller. Legen Sie die Platte unter den Injektor und führen Sie die Nadel unter einem Seziermikroskop in die Brusthöhle der Mücke ein.Stellen Sie das Einspritzvolumen auf 100 Nanoliter und die Rate auf 50 Nanoliter pro Sekunde ein. Drücken Sie die Injizieren-Taste, um die Viruslösung in die Mücke fließen zu lassen. Nach erfolgreicher Injektion wölbt sich der Bauch leicht.Geben Sie die infizierte Mücke in einen neuen Plastikbecher, der auf Eis gestellt wird. Wenn die Anzahl der infizierten Mücken ausreicht, wickeln Sie den Becher mit einem geschnittenen Moskitonetznetz ein und decken Sie ihn mit dem Deckel ab. Um Speichel von den infizierten weiblichen Mücken zu sammeln, gießen Sie die betäubten Mücken in eine auf Eis gestellte Petrischale und schließen Sie den Deckel schnell.Legen Sie die mit Immersionsöl gefüllten 10-Mikroliter-Pipettenspitzen nebeneinander auf den Gummischlamm. Pflücken Sie die weiblichen Mücken mit einer Pinzette und legen Sie sie auf einen Eisteller. Entfernen Sie ihre Beine und Flügel mit einer Pinzette.Setzen Sie das Mundwerkzeug einer Mücke auf jede Pipettenspitze, um den Speichel zu sammeln, der von den Mücken bei Raumtemperatur in das Öl abgesondert wird. Legen Sie die Pipettenspitzen nach 45 bis 60 Minuten in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 200 Mikrolitern Virenverdünnungsmedium. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 5.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Speichel in die Röhrchen auszustoßen.Lagern Sie die speichelhaltigen Röhrchen bei 80 Grad Celsius zur anschließenden Bestimmung der Übertragungsraten. Sezieren Sie nach der Speichelentnahme die infizierten weiblichen Mücken. Schneiden Sie mit einer Pinzette die Köpfe der Mücken ab und legen Sie jeden Kopf in ein einzelnes Röhrchen mit 200 Mikrolitern RPMI 1640 Medium.Fassen Sie den Brustkorb mit einer Pinzette. Fassen Sie dann das vorletzte Segment des Bauches mit einer anderen Pinzette und ziehen Sie den Darm heraus. Reinigen Sie den Darm von verirrtem Gewebe und Organen.Waschen Sie den Darm mit PBS und geben Sie jeden Darm in ein einzelnes Röhrchen mit 200 Mikrolitern RPMI 1640 Medium. Lagern Sie diese Röhrchen bei 80 Grad Celsius zur anschließenden Bestimmung der Virusausbreitung und Infektionsrate. In dieser repräsentativen Analyse wurden virale RNAs im Darm, Kopf und Speichel der weiblichen Stechmücken 10 Tage nach der Infektion bestimmt.Der Virustiter des Ebinur-Lake-Virus in den Eingeweiden, Köpfen und im Speichel der intrathorakal geimpften Mücken war höher als der der oral infizierten Mücken. Die Infektions- und Ausbreitungsrate für die intrathorakal inokulierten Mücken betrug 100 % und für die oral infizierten Mücken 70 % bzw. 38,1 %. Die Übertragungsrate für die intrathorakal geimpften Mücken erreichte bis zu 90 %, aber für die oral infizierten Mücken betrug sie nur 4,8 %Die angeschwollenen weiblichen Mücken wurden ausgewählt, um die Konsistenz zu erhalten, da die Futtermenge den Virusgehalt beeinflusst.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Ein analytisches Werkzeug-Box für umfassende biochemische, strukturelle und Transkriptom Evaluation of Oral Biofilme von Mutans Streptokokken Mediated

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D und 3D Chromosom Malerei in Malaria-Mücken

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Erkennung von niedrigen Kopie Nummer integrierte virale DNA gebildet durch In-vitro- Hepatitis B-Infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modellierung von Tuberkulose Mycobacterium Marinum infizierten Erwachsenen Zebrafisch

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...