Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של ווהאן (2018201261638501).

1. הכנת וירוסים ויתושים
<ol><li>הכנת וירוסים הערה: כל התהליכים בוצעו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). רמת הבטיחות הביולוגית בה נעשה שימוש צריכה להיקבע על ידי הערכת הסיכון של הפתוגן והתקנות הספציפיות למדינות ולאזורים. התהליך חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית.<ol><li>חסן 1 x 106 C6/...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+update+of+phylum+Negarnaviricota+(Riboviria:+Orthornavirae),+including+the+large+orders+Bunyavirales+and+Mononegavirales.">Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales.</a> Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).</li><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika:+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus.">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+DENV-2+Among+Aedes+albopictus+(Diptera:+Culicidae)+Populations+in+China.">Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).</li><li>Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Zika+virus+by+SYBR+green+one-step+real-time+RT-PCR.">Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR.</a> Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+and+transcriptional+response+of+Aedes+aegypti+for+Ebinur+Lake+virus,+a+newly+mosquito-borne+orthobunyavirus.">Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Britton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-acquired+dengue+virus+infection--a+case+report.">Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).</li><li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara,+Jalisco,+Mexico+for+Zika+virus.">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).</li></ol>

מטרת שיטה זו הייתה לספק הערכת סיכונים מקיפה של נגיף אחד המועבר על ידי יתושים על ידי הערכת יכולת וקטורית באמצעות הזנה אוראלית וחיסון תוך חזי.
בניסוי האכלה דרך הפה, יש לקטוף יתושים חרוטים ולהעבירם למיכל חדש, דבר המהווה סיכון חמור למפעילים. הסיבה לכך היא שכל יתוש, כולל יתושים לא...

וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs), קבוצה הטרוגנית של נגיפי RNA, יכולים להישאר בווקטורים של יתושים ולאחר מכן להתפשט לפונדקאים בעלי חוליות1. MBVs החשובים מבחינה קלינית מופצים בעיקר בארבע משפחות וירוסים, כלומר Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae ו- Peribunyavividae 2,3. בעשורים האחרונים, וירוסים אלה דווחו בכל רחבי העולם, וגרמו לבעיות בריאות הציבור. כאחד ה- MBV הידועים ביותר, נגיף דנגי (DENV) הפך לנגיף הארבו המתעורר או המתעורר מחדש הנפוץ ביותר ביותר מ -100 מדינות במהלך 20 השנים האחרונות4. מאז גילוי נגיף הזיקה (ZIKV) בפנים הארץ, כמעט כל המדינות והטריטוריות הטרופיות והסובטרופיות ביבשת דיווחו על זיהומי ZIKV אנושיים5. על מנת להעריך את הסיכון להעברת הנגיף, מחקרים רבים בשנים האחרונות התמקדו בכשירות וקטור יתושים לנגיפים אלה 6,7. כתוצאה מכך, חיוני למנוע ולשלוט ביעילות במחלות המועברות על ידי וקטורים.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), אחד היתושים הקלים ביותר לגידול במעבדה, הוא וקטור חשוב של DENV, ZIKV, וירוס Chikungunya (CHIKV) ווירוס קדחת צהובה (YFV)8. במשך זמן רב, Ae. aegypti נמצא אך ורק ביבשת אפריקה ובדרום מזרח אסיה, אך בשנים האחרונות הוא התיישב כמעט בכל היבשות9. יתר על כן, השפע העולמי של Ae. aegypti גדל בהתמדה, עם גידול מוערך של 20% עד סוף המאה10. משנת 2004 עד 2009 בסין, חלה עלייה ניכרת ביכולת הווקטור Ae. aegypti עבור DENV עקב טמפרטורות יומיומיות גבוהות יותר11. מעמדו של Ae. aegypti כווקטור הפתוגני עלה משמעותית בסין. כתוצאה מכך, כדי להתמודד עם אתגרים אלה, יש צורך לחקור את היכולת הווקטורית של Ae. aegypti להעביר וירוסים.
כפרוק רגליים המטופגי, נקבת היתוש מנקבת את עורו של פונדקאי בעל חוליות וניזונה מהדם. יתושים אכן רוכשים מדי פעם וירוסים מפונדקאים נגועים בנגיף ואז מעבירים את הנגיפים לפונדקאי חדש. לכן, כדי לקבוע כשירות וקטורית, יתושים מוזנים בקמח דם מלאכותי המכיל ארבו-וירוסים באמצעות מערכת הזנה בסביבת מעבדה12. יתושים בודדים מופרדים לראשים, לגוף ולהפרשות רוק מספר ימים לאחר ההדבקה. כדי למדוד את שיעורי ההדבקה, ההפצה וההעברה של הנגיף, טיטרים של וירוסים זוהו על ידי PCR כמותי של שעתוק לאחור (qRT-PCR) או בדיקת פלאק. עם זאת, לא כל היתושים מפתחים זיהומים באמצע המעי ואת היכולת להעביר וירוס לפונדקאי הבא לאחר הזנת הדם. היא קשורה למחסומים הפיזיולוגיים של היתושים, המונעים מפתוגנים לחדור לגוף וממלאים תפקיד חיוני בחסינות המולדת שלהם13. מחסומי אמצע המעי, במיוחד מחסום הזיהום של המעי התיכון (MIB) ומחסום המילוט של המעי התיכון (MEB), משפיעים על היכולת של הנגיף להדביק את הווקטור באופן מערכתי ועל היעילות שבה הוא מתפשט. זה חוסם את הניתוח של זיהום של רקמות אחרות, כגון בלוטות רוק אשר גם להציג זיהום בלוטת הרוק לברוח מחסומים13,14. כדי לאפיין טוב יותר את הזיהום של המעי התיכון ובלוטות הרוק בווקטור, פרוטוקול מפורט להאכלה אוראלית וחיסון תוך חזה של arbovirus ב Ae. aegypti מוצג כאן. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם על זיהומים נוספים arbovirus במגוון רחב של וקטורים יתושים, כגון זיהום DENV ו ZIKV ב Aedes spp., והוא יכול להוכיח להיות הליך מעשי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs), שהם פתוגנים מדבקים לבעלי חוליות, מופצים על ידי מיני יתושים רבים, ומהווים איום חמור על בריאות הציבור. לאחר בליעתם, הנגיפים חייבים להתגבר על מחסום היתושים באמצע המעי כדי להגיע להמולימפה, משם הם עלולים להתפשט לבלוטות הרוק. כאשר יתוש עוקץ, וירוסים אלה מופצים לפונדקאים חדשים בעלי חוליות. באופן דומה, היתוש עלול לקלוט וירוסים שונים. באופן כללי, רק חלק זעיר מהווירוסים עשוי להיכנס לבלוטות הרוק דרך המעיים. יעילות ההעברה של נגיפים אלה לבלוטות מושפעת משני מחסומים פיזיים הנמצאים בזני יתושים שונים: מחסומי אמצע המעי ומחסומי בלוטות הרוק. פרוטוקול זה מציג שיטה לזיהוי וירוסים בבלוטות הרוק של Aedes aegypti לאחר הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה. יתר על כן, קביעה אם המעיים ו / או בלוטות הרוק מעכבים את התפשטות הנגיפים יכולה לסייע בהערכות הסיכון של MBV המועברים על ידי Aedes aegypti.

כדי לבחון את התפלגות EBIV ביתושים הנגועים באמצעות הזנת דם מלאכותית (הטיטר הסופי הנגיפי היה 6.4 x 106 PFU/mL) והזרקה תוך חזה (המינון הנגיפי היה 340 PFU), נקבעו RNA נגיפי ברוק, בראש ובמעיים של היתושים לאחר 10 ימים לאחר ההדבקה (dpi).
עבור Ae. aegypti, טיטר הנגיף של EBIV במעיים, בראש וברוק ש...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

מתודולוגיה זו, שכללה הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה, יכולה להעריך ביעילות את ההשפעה של מחסומי המעי התיכון ו / או בלוטת הרוק על זיהום arbovirus.

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

פרוטוקול זה יכול לקבוע אם המעיים ובלוטות התריס מעכבים את התפשטות הנגיפים ויכול לסייע בהערכת הסיכון של וירוסים המועברים על ידי יתושים המועברים על ידי Aedes aegypti. הפרוטוקול שלנו כלל שתי שיטות זיהום, הזנה דרך הפה וזריקה תוך חזה, אשר יכול להעריך ביעילות את היכולת הווקטורית של arbovirus. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם על זיהומים נוספים arbovirus במגוון רחב של וקטורים יתושים, כגון וירוס דנגי זיהום וירוס זיקה ב Aedes, והוא יכול להוכיח להיות הליך מעשי.מי שתדגים את ההליך תהיה פיי וואנג, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. כדי לבצע הזנה מלאכותית באמצעות מערכת האכלת יתושים מלאכותית, חתכו את קרומי הקולגן לגודל המתאים, והצמידו אותם למאגרים בעזרת אורינגים. הוסיפו שלושה מיליליטר מתערובת הנגיף-דם למאגרים, ואטמו את המאגרים באמצעות פקקי פלסטיק למניעת דליפות.הכניסו את כוסות הפלסטיק המכילות יתושים לתא הכפפות. הבריגו את המאגרים האטומים למזין FU1, והניחו מאגר אחד על אחת. הפעל את יחידת הכוח, והאכיל את היתושים במשך שעה אחת.לאחר האכלה, להרדים את היתושים עם קרח במשך כמה שניות עד שהם מתעלפים. יוצקים את היתושים המורדמים לתוך צלחת פטרי המונחת על קרח, ומכסים את המכסה במהירות. קטפו נקבות יתושים חרוטות בעזרת מלקחיים, והעבירו אותן לכוסות פלסטיק חדשות ב-50 נקבות יתושים לכוס.עוטפים את הכוס ברשת כילה חתוכה, ומכסים אותה במכסה עם חור באמצע. חותכים את הספוג לחתיכות קטנות, ומניחים אותם על הכוסות. יש להוסיף תמיסת גלוקוז 8% לספוג באמצעות טפטפת חד פעמית מפלסטיק.הניחו את הכוסות המכילות נקבות יתושים באינקובטור בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס בלחות של 80% למשך 10 ימים. החליפו ספוג חדש רווי גלוקוז כל 72 שעות. לחיסון תוך חזי, הכינו נקבות יתושים כמתואר בכתב היד של הטקסט.כדי להכין את דילול הנגיף המדבק, הוציאו את מלאי הנגיף מהמקפיא של 80 מעלות צלזיוס, והפשירו אותו על קרח. מלאי וירוסים מדוללים בדילול וירוס של 100 ננוליטר המכיל 100 עד 500 יחידות יוצרות פלאק עם RPMI 1640 בינוני המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. מניחים את דילול הנגיף על קרח.לאחר מכן, הכינו את מחטי המיקרו-הזרקה באמצעות Puller 1000 עם הפרמטרים בתוכנית מושך המחטים שנקבעו כמדד חום ל-450, כוח ב-g ל-110, מרחק במילימטר לאחד, והשהיה בשניות לאפס. חותכים קצה של מחט משוכה בפינצטה תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 16. ממלאים את המחט בשמן מינרלי באמצעות מזרק סטרילי חד פעמי.חבר את המחט למזרק בהתאם להוראות המכונה. הכנס את המחט בזהירות לתוך צינור המכיל דילול וירוס זיהומיות. לאחר מכן, לחץ על כפתור מילוי כדי למלא כארבעה מיקרוליטרים של דילול וירוס לתוך המחט.לאחר מילוי המחט, אין לגעת במחט או לפגוע בה. קטפו בפינצטה כ-50 נקבות יתושים מורדמות, והניחו אותן על צלחת קרח. מניחים את הצלחת מתחת למזרק, ומחדירים את המחט לחלל בית החזה של היתוש תחת מיקרוסקופ מנתח.הגדר את נפח ההזרקה ל -100 ננוליטר ואת הקצב ל -50 ננוליטר לשנייה. לחץ על כפתור ההזרקה כדי לאפשר לתמיסת הנגיף לזרום לתוך היתוש. לאחר הזרקה מוצלחת, הבטן בולטת מעט.הכניסו את היתוש הנגוע לכוס פלסטיק חדשה שהונחה על קרח. כאשר מספר היתושים הנגועים מספיק, עוטפים את הכוס ברשת כילה חתוכה ומכסים אותה במכסה. כדי לאסוף רוק מנקבות היתושים הנגועות, שפכו את היתושים המורדמים לתוך צלחת פטרי שהונחה על קרח, וסגרו את המכסה במהירות.מניחים קצוות פיפטה של 10 מיקרוליטר מלאים בשמן טבילה זה לצד זה על בוץ הגומי. קטפו את נקבות היתושים בפינצטה, והניחו אותן על צלחת קרח. הסירו את רגליהם וכנפיהם בפינצטה.הניחו את פיו של יתוש אחד על כל קצה פיפטה כדי לאסוף את הרוק כפי שהופרש לשמן על ידי היתושים בטמפרטורת החדר. לאחר 45 עד 60 דקות, מניחים את קצות פיפטה בצינורות 1.5 מיליליטר המכילים 200 מיקרוליטר של מדלל וירוס. צנטריפוגה את הצינורות ב 5, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגרש רוק לתוך הצינורות.אחסנו את הצינורות המכילים רוק בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לצורך קביעה עוקבת של קצבי ההדבקה. לאחר איסוף הרוק, נתחו את נקבות היתושים הנגועות. בעזרת פינצטה, חותכים את ראשי היתושים, ומניחים כל ראש לתוך צינור בודד המכיל 200 מיקרוליטר של מדיום RPMI 1640.תפוס את בית החזה עם טוויטר. לאחר מכן, תפסו את החלק הלפני אחרון של הבטן עם טוויטר נוסף, ומשכו את הבטן החוצה. נקו את המעי עבור כל רקמה ואיברים תועים.שטפו את המעי עם PBS, והכניסו כל מעי לצינור נפרד המכיל 200 מיקרוליטר של מדיום RPMI 1640. אחסנו את הצינורות הללו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לצורך קביעה עוקבת של קצב הפצת הנגיף וקצב ההדבקה. בניתוח מייצג זה נקבעו RNA נגיפי במעיים, בראש וברוק של נקבות היתושים לאחר 10 ימים לאחר ההדבקה.הטיטר הווירוסי של נגיף אגם אבינור במעיים, בראש וברוק של היתושים שחוסנו תוך בית החזה היה גבוה מזה של היתושים הנגועים דרך הפה. שיעור ההדבקה וההפצה של היתושים שחוסנו תוך בית החזה היה 100% ושל היתושים הנגועים דרך הפה נמצא על 70% ו-38.1% בהתאמה. שיעור ההדבקה של היתושים שחוסנו תוך בית החזה הגיע עד 90%, אך עבור היתושים הנגועים דרך הפה היה רק 4.8%. נקבות היתושים הנגועות נקטפו כדי לשמור על עקביות, שכן כמות ההזנה משפיעה על התוכן הנגיפי.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...