Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Preparazione di virus e zanzare
<ol><li>Preparazione di virus NOTA: Tutti i processi sono stati eseguiti in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Il livello di contaminazione di biosicurezza utilizzato dovrebbe essere determinato dalla valutazione del rischio del patogeno e dalle normative specifiche per nazioni e regioni. Il processo deve essere eseguito in un armadio di biosicurezza.<ol><li>Inoculare 1 x 106 cellule C6/36 in un matraccio di coltura T75. Riempire il mat...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. 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F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. 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L'obiettivo di questo metodo era quello di fornire una valutazione completa del rischio di un virus trasmesso dalle zanzare valutando la competenza del vettore attraverso l'alimentazione orale e l'inoculazione intratoracica.
Nell'esperimento di alimentazione orale, le zanzare ingoiate devono essere selezionate e trasferite in un nuovo contenitore, ponendo un grave rischio per gli operatori. La ragione di ciò è perché qualsiasi zanzara, comprese le zanzare non infette, potrebbe essere una fo...

I virus trasmessi dalle zanzare (MBV), un gruppo eterogeneo di virus a RNA, possono persistere nei vettori delle zanzare e successivamente diffondersi agli ospiti vertebrati1. Gli MBV clinicamente importanti sono principalmente distribuiti in quattro famiglie di virus, vale a dire Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae e Peribunyavividae 2,3. Negli ultimi decenni, questi virus sono stati segnalati in tutto il mondo, causando problemi di salute pubblica. Come uno dei MBV più noti, il virus Dengue (DENV) è diventato l'arbovirus emergente o riemergente più diffuso in oltre 100 paesi negli ultimi 20 anni4. Dalla scoperta del virus Zika (ZIKV) nell'entroterra, quasi tutti i paesi e territori tropicali e subtropicali del continente hanno riportato infezioni umane da ZIKV5. Al fine di valutare il rischio di trasmissione del virus, numerosi studi negli ultimi anni si sono concentrati sulla competenza dei vettori di zanzare per questi virus 6,7. Di conseguenza, è fondamentale prevenire e controllare efficacemente le malattie trasmesse da vettori.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), una delle zanzare più facilmente allevate in laboratorio, è un importante vettore di DENV, ZIKV, virus Chikungunya (CHIKV) e virus della febbre gialla (YFV)8. Per molto tempo, Ae. aegypti è stato trovato solo nel continente africano e nel sud-est asiatico, ma negli ultimi anni ha colonizzato quasi tutti i continenti9. Inoltre, l'abbondanza globale di Ae. aegypti è in continua crescita, con un aumento stimato del 20% entro la fine del secolo10. Dal 2004 al 2009 in Cina, c'è stato un evidente aumento della competenza del vettore Ae. aegypti per DENV a causa delle temperature giornaliere più elevate11. Lo status di Ae. aegypti come vettore patogeno è aumentato significativamente in Cina. Di conseguenza, per affrontare queste sfide, è necessario studiare la competenza vettoriale di Ae. aegypti per trasmettere virus.
Come artropode ematofago, la zanzara femmina perfora la pelle di un ospite vertebrato e si nutre del sangue. Le zanzare occasionalmente acquisiscono virus da host infetti da virus e quindi trasferiscono i virus a un nuovo ospite. Pertanto, per determinare la competenza del vettore, le zanzare vengono alimentate con una farina di sangue artificiale contenente arbovirus attraverso un sistema di alimentazione nell'impostazione di laboratorio12. Le singole zanzare vengono separate in teste, corpi e secrezioni di saliva diversi giorni dopo l'infezione. Per misurare i tassi di infezione, diffusione e trasmissione del virus, i titoli virali sono stati rilevati mediante PCR quantitativa a trascrizione inversa (qRT-PCR) o test di placca. Tuttavia, non tutte le zanzare sviluppano infezioni dell'intestino medio e la capacità di trasferire un virus all'ospite successivo dopo l'alimentazione del sangue. È collegato alle barriere fisiologiche delle zanzare, che impediscono agli agenti patogeni di penetrare nel corpo e svolgono un ruolo vitale nella loro immunità innata13. Le barriere dell'intestino medio, in particolare la barriera di infezione dell'intestino medio (MIB) e la barriera di fuga dell'intestino medio (MEB), influenzano se il virus potrebbe infettare il vettore sistemicamente e l'efficienza con cui si diffonde. Ostacola l'analisi delle infezioni di altri tessuti, come le ghiandole salivari che presentano anche infezioni delle ghiandole salivari e barriere di fuga13,14. Per caratterizzare meglio l'infezione delle viscere intermedie e delle ghiandole salivari nel vettore, viene presentato qui un protocollo dettagliato per l'alimentazione orale e l'inoculazione intratoracica dell'arbovirus in Ae. aegypti. Questo protocollo potrebbe essere applicato a ulteriori infezioni da arbovirus in una varietà di vettori di zanzare, come l'infezione da DENV e ZIKV in Aedes spp., e potrebbe rivelarsi una procedura praticabile.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

I virus trasmessi dalle zanzare (MBV), che sono agenti patogeni infettivi per i vertebrati, sono diffusi da molte specie di zanzare, rappresentando una grave minaccia per la salute pubblica. Una volta ingeriti, i virus devono superare la barriera intestinale della zanzara per raggiungere l'emolinfa, da dove potrebbero potenzialmente diffondersi alle ghiandole salivari. Quando una zanzara morde, questi virus si diffondono a nuovi ospiti vertebrati. Allo stesso modo, la zanzara può raccogliere diversi virus. In generale, solo una piccola parte dei virus può entrare nelle ghiandole salivari attraverso l'intestino. L'efficienza di trasmissione di questi virus alle ghiandole è influenzata dalle due barriere fisiche presenti in diverse specie di zanzare: barriere midgut e barriere delle ghiandole salivari. Questo protocollo presenta un metodo per il rilevamento del virus nelle ghiandole salivari di Aedes aegypti dopo l'alimentazione orale e l'infezione da iniezione intratoracica. Inoltre, determinare se l'intestino e/o le ghiandole salivari ostacolano la diffusione virale può aiutare nella valutazione del rischio di MBV trasmessi da Aedes aegypti.

Per esaminare la distribuzione dell'EBIV nelle zanzare infette tramite alimentazione artificiale del sangue (il titolo finale virale era 6,4 x 106 PFU / ml) e iniezione intratoracica (la dose virale era 340 PFU), sono stati determinati gli RNA virali nella saliva, nelle teste e nell'intestino delle zanzare a 10 giorni dopo l'infezione (dpi).
Per Ae. aegypti, il titolo virale di EBIV nelle viscere, nelle teste e nella saliva delle zanzare femmine inoculate per via i...

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Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Questa metodologia, che includeva l'alimentazione orale e l'infezione da iniezione intratoracica, potrebbe valutare efficacemente l'influenza delle barriere dell'intestino medio e / o delle ghiandole salivari sull'infezione da arbovirus.

Infezione virale sperimentale nelle zanzare adulte mediante alimentazione orale e microiniezione

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Questo protocollo può determinare se l'intestino e le ghiandole tiroidee ostacolano la diffusione virale e può aiutare nella valutazione del rischio di virus trasmessi dalle zanzare trasmessi da Aedes aegypti. Il nostro protocollo includeva due metodi di infezione, l'alimentazione orale e l'iniezione intratoracica, che potevano valutare efficacemente la competenza del vettore dell'arbovirus. Questo protocollo potrebbe essere applicato a ulteriori infezioni da arbovirus in una varietà di vettori di zanzare, come il virus Dengue e l'infezione da virus Zika in Aedes, e potrebbe rivelarsi una procedura praticabile.A dimostrare la procedura sarà Fei Wang, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Per eseguire l'alimentazione artificiale utilizzando il sistema di alimentazione artificiale delle zanzare, tagliare le membrane di collagene alla dimensione appropriata e fissarle ai serbatoi con gli O-ring. Aggiungere tre millilitri della miscela virus-sangue ai serbatoi e sigillare i serbatoi utilizzando tappi di plastica per evitare perdite.Metti i bicchieri di plastica contenenti zanzare nel vano portaoggetti. Avvitare i serbatoi sigillati nell'alimentatore FU1 e mettere un serbatoio su una tazza. Accendi l'unità di alimentazione e dai da mangiare alle zanzare per un'ora.Dopo aver mangiato, anestetizzare le zanzare con ghiaccio per diversi secondi fino a quando non svengono. Versare le zanzare anestetizzate, in una capsula di Petri posta sul ghiaccio, e coprire rapidamente il coperchio. Scegli le zanzare femmine ingorgate con una pinza e trasferiscile in nuovi bicchieri di plastica a 50 zanzare femmine per tazza.Avvolgere la tazza con una rete di zanzariera tagliata e coprirla con un coperchio con un buco nel mezzo. Tagliare la spugna a pezzetti e metterli sulle tazze. Aggiungere una soluzione di glucosio all'8% sulla spugna utilizzando un contagocce monouso di plastica.Posizionare le tazze contenenti zanzare femmine nell'incubatrice a 27 gradi Celsius all'80% di umidità per 10 giorni. Sostituire una nuova spugna satura di glucosio ogni 72 ore. Per l'inoculazione intratoracica, preparare zanzare femmine come descritto nel manoscritto del testo.Per preparare la diluizione del virus infettivo, rimuovere lo stock di virus dal congelatore a 80 gradi Celsius e scongelarli sul ghiaccio. Diluire lo stock di virus a una diluizione del virus da 100 nanolitri contenente da 100 a 500 unità di virus formanti placca con terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Mettere la diluizione del virus sul ghiaccio.Quindi, preparare gli aghi per microiniezione utilizzando un Puller 1000 con i parametri nel programma di estrazione dell'ago impostati come indice di calore su 450, forza in g a 110, distanza in millimetri a uno e ritardo in secondi a zero. Tagliare la punta di un ago tirato con una pinzetta al microscopio da dissezione con ingrandimento 16x. Riempire l'ago con olio minerale attraverso una siringa sterile monouso.Inserire l'ago nell'iniettore seguendo le istruzioni riportate sulla macchina. Inserire con cautela l'ago in una provetta contenente una diluizione del virus infettivo. Quindi, premere il pulsante Fill per riempire circa quattro microlitri di diluizione del virus nell'ago.Una volta riempito l'ago, non toccare o danneggiare l'ago. Scegli circa 50 zanzare anestetizzate femmine con una pinzetta e mettile su una piastra di ghiaccio. Posizionare la piastra sotto l'iniettore e inserire l'ago nella cavità toracica della zanzara al microscopio da dissezione.Impostare il volume di iniezione su 100 nanolitri e la velocità su 50 nanolitri al secondo. Premere il pulsante Inietta per consentire alla soluzione virale di fluire nella zanzara. Dopo l'iniezione riuscita, l'addome si gonfia leggermente.Metti la zanzara infetta in un nuovo bicchiere di plastica posto sul ghiaccio. Quando il numero di zanzare infette è sufficiente, avvolgere la tazza con una rete di zanzariera tagliata e coprirla con il coperchio. Per raccogliere la saliva dalle zanzare femmine infette, versare le zanzare anestetizzate, in una capsula di Petri posta sul ghiaccio e chiudere rapidamente il coperchio.Posizionare le punte delle pipette da 10 microlitri riempite con olio ad immersione fianco a fianco sul fango di gomma. Scegli le zanzare femmine con una pinzetta e mettile su una piastra di ghiaccio. Rimuovi le gambe e le ali con una pinzetta.Posizionare l'apparato boccale di una zanzara su ciascuna punta della pipetta per raccogliere la saliva secreta nell'olio dalle zanzare a temperatura ambiente. Dopo 45-60 minuti, posizionare le punte delle pipette in provette da 1,5 millilitri contenenti 200 microlitri di mezzo di diluente virale. Centrifugare i tubi a 5.000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per espellere la saliva nei tubi.Conservare i tubi contenenti saliva a 80 gradi Celsius per la successiva determinazione delle velocità di trasmissione. Dopo la raccolta della saliva, sezionare le zanzare femmine infette. Usando una pinzetta, taglia le teste delle zanzare e posiziona ogni testa in un singolo tubo contenente 200 microlitri di mezzo RPMI 1640.Prendi il torace con una pinzetta. Quindi, afferra il penultimo segmento dell'addome con un'altra pinzetta e tira fuori l'intestino. Pulire l'intestino per eventuali tessuti e organi vaganti.Lavare l'intestino con PBS e posizionare ogni budello in un singolo tubo contenente 200 microlitri di mezzo RPMI 1640. Conservare queste provette a 80 gradi Celsius per la successiva determinazione della diffusione del virus e del tasso di infezione. In questa analisi rappresentativa, sono stati determinati gli RNA virali nell'intestino, nella testa e nella saliva delle zanzare femmine a 10 giorni dopo l'infezione.Il titolo virale del virus del lago Ebinur nelle viscere, nelle teste e nella saliva delle zanzare inoculate per via intratoracica era superiore a quello delle zanzare infette per via orale. Il tasso di infezione e diffusione per le zanzare inoculate per via intratoracica era del 100% e per le zanzare infette per via orale è risultato essere rispettivamente del 70% e del 38,1%. Il tasso di trasmissione per le zanzare inoculate intratoracicamente ha raggiunto fino al 90%, ma per le zanzare infette per via orale è stato solo del 4,8% Le zanzare femmine ingorgate sono state scelte per mantenere la coerenza, poiché la quantità di alimentazione influisce sul contenuto virale.

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Ricerca

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