Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
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이 작업은 우한 과학 기술 계획 프로젝트 (2018201261638501)의 지원을 받았습니다.

1. 바이러스 및 모기의 준비
<ol><li>바이러스의 준비 참고: 모든 공정은 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실에서 수행되었습니다. 사용되는 생물 안전성 관리 수준은 병원체의 위험 평가 및 국가 및 지역에 특정한 규정에 따라 결정되어야 합니다. 이 과정은 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.<ol><li>1 x 106 C6/36 세포를 T75 배양 플라스크에 접종합니다. 10% 열 비활성화 태아 소 혈?...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+update+of+phylum+Negarnaviricota+(Riboviria:+Orthornavirae),+including+the+large+orders+Bunyavirales+and+Mononegavirales.">Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales.</a> Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).</li><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. 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F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Zika+virus+by+SYBR+green+one-step+real-time+RT-PCR.">Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR.</a> Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+and+transcriptional+response+of+Aedes+aegypti+for+Ebinur+Lake+virus,+a+newly+mosquito-borne+orthobunyavirus.">Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Britton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-acquired+dengue+virus+infection--a+case+report.">Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).</li><li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara,+Jalisco,+Mexico+for+Zika+virus.">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).</li></ol>

이 방법의 목표는 경구 수유 및 흉부 내 접종을 통해 벡터 능력을 평가하여 모기 매개 바이러스에 대한 포괄적인 위험 평가를 제공하는 것이었습니다.
구강 수유 실험에서 충혈 된 모기를 골라내어 새 용기로 옮겨야하므로 작업자에게 심각한 위험을 초래할 수 있습니다. 그 이유는 감염되지 않은 모기를 포함한 모든 모기가 감염원이 될 수 있기 때문이다19. ?...

모기 매개 바이러스(Mosquito-borne virus, MBVs)는 이질적인 RNA 바이러스 그룹으로, 모기 매개체에서 잔류하다가 척추동물 숙주로 퍼질 수 있다1. 임상적으로 중요한 MBV는 주로 Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae 및 Peribunyavividae 2,3의 4가지 바이러스 계열에 분포합니다. 최근 수십 년 동안 이러한 바이러스는 전 세계적으로 보고되어 공중 보건 문제를 일으켰습니다. 가장 잘 알려진 MBV 중 하나인 뎅기열 바이러스(DENV)는 지난 20년 동안 100개 이상의 국가에서 가장 널리 퍼진 신종 또는 재출현 아르보 바이러스가 되었습니다4. 내륙에서 지카 바이러스(Zika virus, ZIKV)가 발견된 이후, 아프리카 대륙의 거의 모든 열대 및 아열대 국가와 영토에서 인간 ZIKV 감염이 보고되었다5. 바이러스 전파 위험을 평가하기 위해 최근 몇 년 동안 많은 연구가 이러한 바이러스에 대한 모기 벡터 능력에 초점을 맞추었습니다 6,7. 따라서 매개체 매개 질병을 효과적으로 예방하고 통제하는 것이 중요합니다.
이집트숲모기(Ae. aegypti)는 실험실에서 가장 쉽게 사육되는 모기 중 하나로, DENV, ZIKV, 치쿤구니야 바이러스(CHIKV) 및 황열병 바이러스(YFV)의 중요한 매개체입니다8. 오랫동안 Ae. aegypti는 아프리카 대륙과 동남아시아에서만 발견되었지만 최근 몇 년 동안 거의 모든 대륙을 식민지화했습니다9. 또한, Ae. 이집트는 지속적으로 성장하고 있으며, 10 세기 말까지20 % 증가 할 것으로 예상됩니다. 2004년부터 2009년까지 중국에서는 Ae가 뚜렷하게 증가했습니다. 더 높은 일일 온도로 인한 DENV에 대한 이집트 벡터 역량11. 병원성 매개체로서의 이집트의 지위는 중국에서 크게 상승했다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위해서는 Ae의 벡터 능력을 조사할 필요가 있습니다. 이집트는 바이러스를 전염시킵니다.
haematophagous 절지 동물로서, 암컷 모기는 척추 동물 숙주의 피부를 관통하고 혈액을 먹습니다. 모기는 때때로 바이러스에 감염된 숙주로부터 바이러스를 얻은 다음 바이러스를 새로운 숙주로 옮깁니다. 이와 같이, 벡터 능력을 결정하기 위해, 모기는 실험실 설정12에서 공급 시스템을 통해 아르보 바이러스를 함유하는 인공 혈액 식사를 공급받는다. 개별 모기는 감염 후 며칠 후에 머리, 몸통, 타액 분비물로 분리됩니다. 바이러스 감염, 전파 및 전파 속도를 측정하기 위해 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR) 또는 플라크 분석을 통해 바이러스 역가를 검출했습니다. 그러나 모든 모기가 중장 감염을 일으키는 것은 아니며 혈액 공급 후 다음 숙주에게 바이러스를 옮길 수 있는 능력이 있습니다. 이는 모기의 생리적 장벽과 관련이 있어 병원체가 체내로 침투하는 것을 방지하고 모기의 선천성 면역에 중요한 역할을 한다13. 중장 장벽, 특히 중장 감염 장벽(MIB) 및 중장 탈출 장벽(MEB)은 바이러스가 벡터를 전신적으로 감염시킬 수 있는지 여부와 확산 효율성에 영향을 미칩니다. 그것은 또한 침샘 감염을 나타내고 장벽을 탈출하는 타액선과 같은 다른 조직의 감염 분석을 방해합니다13,14. 벡터에서 중장 및 침샘의 감염을 더 잘 특성화하기 위해, Ae에서 아르보바이러스의 경구 수유 및 흉강내 접종을 위한 상세한 프로토콜. 이집트가 본원에 제시되어 있다. 이 프로토콜은 Aedes spp.의 DENV 및 ZIKV 감염과 같은 다양한 모기 매개체의 추가 아르보 바이러스 감염에 적용될 수 있으며 실행 가능한 절차로 판명될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

척추동물에 대한 감염성 병원체인 모기 매개 바이러스(MBV)는 많은 모기 종에 의해 전파되어 공중 보건에 심각한 위협이 됩니다. 일단 섭취되면 바이러스는 모기 중장 장벽을 극복하여 체액림프에 도달해야 하며, 그곳에서 잠재적으로 침샘으로 퍼질 수 있습니다. 모기에 물리면 이 바이러스는 새로운 척추동물 숙주에게 퍼집니다. 마찬가지로 모기는 다른 바이러스를 집어 올릴 수 있습니다. 일반적으로 바이러스의 아주 작은 부분만이 장을 통해 침샘으로 들어갈 수 있습니다. 땀샘으로의 이러한 바이러스의 전염 효율은 다른 모기 종에서 발견되는 두 가지 물리적 장벽, 즉 중장 장벽과 침샘 장벽의 영향을 받습니다. 이 프로토콜은 이집트숲모기의 경구 수유 및 흉강내 주사 감염 후 타액선에서 바이러스 검출 방법을 제시합니다. 또한, 내장 및/또는 침샘이 바이러스 확산을 방해하는지 여부를 결정하면 이집트숲모기에 의해 전염되는 MBV의 위험 평가에 도움이 될 수 있습니다.

인공 혈액 공급(바이러스 최종 역가는 6.4 x 106 PFU/mL) 및 흉부 내 주사(바이러스 용량은 340 PFU)를 통해 감염된 모기의 EBIV 분포를 조사하기 위해 감염 후 10일(dpi)에 모기의 타액, 머리 및 내장에 있는 바이러스 RNA를 결정했습니다.
Ae. aegypti의 경우, 흉부내 접종된 암컷 모기의 내장, 머리 및 타액에서 EBIV의 바이러스 역가는 경구에 감염된 암컷 모기보다 훨씬 ...

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Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

경구 수유 및 흉강내 주사 감염을 포함하는 이 방법론은 아르보 바이러스 감염에 대한 중장 및/또는 침샘 장벽의 영향을 효과적으로 평가할 수 있습니다.

경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

이 프로토콜은 내장과 갑상선이 바이러스 확산을 방해하는지 여부를 결정할 수 있으며 이집트숲모기에 의해 전염되는 모기 매개 바이러스의 위험 평가에 도움이 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜에는 아르보 바이러스의 벡터 능력을 효과적으로 평가할 수 있는 경구 수유와 흉강내 주사의 두 가지 감염 방법이 포함되었습니다. 이 프로토콜은 뎅기열 바이러스 및 Aedes의 지카 바이러스 감염과 같은 다양한 모기 매개체의 추가 아르보 바이러스 감염에 적용될 수 있으며 실행 가능한 절차로 판명될 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 연구 조교 인 Fei Wang이 될 것입니다. 인공 모기 먹이 시스템을 사용하여 인공 먹이를 수행하려면 콜라겐 막을 적절한 크기로 자르고 O-링으로 저장소에 고정합니다. 3 밀리리터의 바이러스 - 혈액 혼합물을 저장소에 넣고 누출을 방지하기 위해 플라스틱 플러그를 사용하여 저장소를 밀봉하십시오.모기가 들어있는 플라스틱 컵을 글러브 박스에 넣으십시오. 밀봉된 저장소를 FU1 공급 장치에 나사로 고정하고 하나의 저장소에 하나의 컵을 넣습니다. 전원 장치를 켜고 모기에게 1 시간 동안 먹이를주십시오.먹이를 먹은 후 모기가 희미 할 때까지 몇 초 동안 얼음으로 마취하십시오. 마취 된 모기를 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 붓고 뚜껑을 빨리 덮으십시오. 집게로 충혈 된 암컷 모기를 골라 컵당 50 마리의 암컷 모기로 새 플라스틱 컵에 옮깁니다.컵을 자른 모기장 메쉬로 감싸고 중간에 구멍이있는 뚜껑으로 덮으십시오. 스폰지를 작은 조각으로 자르고 컵에 올려 놓으십시오. 플라스틱 일회용 스포이드를 사용하여 스폰지에 8% 포도당 용액을 추가합니다.암컷 모기가 들어있는 컵을 섭씨 27도, 습도 80 %의 인큐베이터에 10 일 동안 놓습니다. 72시간마다 새 포도당 포화 스폰지를 교체하십시오. 흉부 내 접종의 경우, 텍스트 원고에 설명 된대로 암컷 모기를 준비하십시오.감염성 바이러스 희석액을 준비하려면 섭씨 80도 냉동고에서 바이러스 스톡을 꺼내 얼음에서 해동합니다. 100 내지 500 플라크 형성 단위 바이러스를 함유하는 100 나노리터 바이러스 희석액으로 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지로 바이러스 스톡을 희석한다. 바이러스 희석액을 얼음에 놓습니다.다음으로, 열 지수를 450으로, g에서 110까지의 힘, 밀리미터 단위의 거리를 1로, 초 단위에서 0으로 설정된 바늘 풀러 프로그램의 매개 변수로 Puller 1000을 사용하여 미세 주입 바늘을 준비합니다. 핀셋으로 뽑은 바늘 끝을 16배 배율로 해부 현미경으로 자릅니다. 일회용 멸균 주사기를 통해 바늘에 미네랄 오일을 다시 채웁니다.기계의 지침에 따라 바늘을 인젝터에 부착합니다. 감염성 바이러스 희석액이 들어있는 튜브에 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. 그런 다음 채우기 버튼을 눌러 약 4마이크로리터의 바이러스 희석액을 바늘에 채웁니다.바늘이 채워지면 바늘을 만지거나 손상시키지 마십시오. 핀셋으로 약 50 마리의 암컷 마취 모기를 골라 얼음 접시에 올려 놓습니다. 인젝터 아래에 플레이트를 놓고 해부 현미경으로 모기의 흉강에 바늘을 삽입합니다.주입량을 100 나노리터로 설정하고 속도를 초당 50 나노리터로 설정합니다. 주입 버튼을 눌러 바이러스 용액이 모기로 흐르도록 합니다. 성공적으로 주사하면 복부가 약간 부풀어 오릅니다.감염된 모기를 얼음 위에 놓인 새 플라스틱 컵에 넣으십시오. 감염된 모기의 수가 충분하면 컵을 모기장 메쉬로 감싸고 뚜껑으로 덮으십시오. 감염된 암컷 모기에서 타액을 채취하려면 마취 된 모기를 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 붓고 뚜껑을 빨리 닫으십시오.침지 오일로 채워진 10마이크로리터 피펫 팁을 고무 진흙 위에 나란히 놓습니다. 핀셋으로 암컷 모기를 골라 얼음 접시에 올려 놓습니다. 핀셋으로 다리와 날개를 제거하십시오.각 피펫 팁에 모기 한 마리의 입 부분을 놓아 실온에서 모기에 의해 기름으로 분비되는 타액을 수집합니다. 45 내지 60분 후, 200 마이크로리터의 바이러스 희석제 배지가 들어 있는 1.5-밀리리터 튜브에 피펫 팁을 넣는다. 튜브를 섭씨 4도에서 5 분 동안 5, 000g에서 원심 분리하여 타액을 튜브로 배출합니다.이후 투과율을 측정하기 위해 타액 함유 튜브를 섭씨 80도에 보관하십시오. 타액 채취 후 감염된 암컷 모기를 해부합니다. 핀셋을 사용하여 모기의 머리를 자르고 각 머리를 200마이크로리터의 RPMI 1640 배지가 들어 있는 개별 튜브에 넣습니다.핀셋으로 흉부를 잡으십시오. 그런 다음 다른 핀셋으로 복부의 끝에서 두 번째 부분을 잡고 내장을 빼냅니다. 흩어진 조직과 장기가 있는지 장을 청소하십시오.PBS로 장을 세척하고 각 장을 200마이크로리터의 RPMI 1640 배지가 들어 있는 개별 튜브에 넣습니다. 바이러스 전파 및 감염률의 후속 측정을 위해 이 튜브를 섭씨 80도에 보관하십시오. 이 대표적인 분석에서는 감염 후 10일 동안 암컷 모기의 장, 머리 및 타액에 있는 바이러스 RNA를 측정했습니다.흉강내 접종된 모기의 내장, 머리 및 타액에 있는 Ebinur Lake 바이러스의 바이러스 역가는 경구 감염 모기보다 높았습니다. 흉강내 접종 모기의 감염 및 파종률은 각각 100%, 경구에 감염된 모기의 감염률은 70%와 38.1%로 나타났다. 흉부 내 접종 모기의 전염률은 최대 90 %에 달했지만 구강에 감염된 모기의 경우 4.8 %에 불과했다 먹이가 바이러스 함량에 영향을 미치기 때문에 일관성을 유지하기 위해 충혈 된 암컷 모기를 골랐다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

구강 Biofilms의 종합, 생물 구조 및 Transcriptome 평가를위한 분석 도구 - 상자가 Mutans Streptococci의 중재

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

연구

면역학 및 감염병학

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

말라리아 모기의 2D 및 3D 염색체 페인팅

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

낮은 복사의 번호 통합된 바이러스 성 DNA 생체 외에서 B 형 간염 감염에 의해 형성 된

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...