Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Forberedelse av virus og mygg
<ol><li>Forberedelse av virus MERK: Alle prosesser ble utført i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) laboratorium. Nivået av biosikkerhetsbegrensning som brukes, bør bestemmes av patogenets risikovurdering og forskrifter som er spesifikke for nasjoner og regioner. Prosessen må utføres i et biosikkerhetsskap.<ol><li>Inokuler 1 x 106 C6/36 celler i en T75 kulturkolbe. Fyll kolben med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium som inneholder 10%...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+update+of+phylum+Negarnaviricota+(Riboviria:+Orthornavirae),+including+the+large+orders+Bunyavirales+and+Mononegavirales.">Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales.</a> Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).</li><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika:+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus.">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+DENV-2+Among+Aedes+albopictus+(Diptera:+Culicidae)+Populations+in+China.">Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).</li><li>Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Zika+virus+by+SYBR+green+one-step+real-time+RT-PCR.">Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR.</a> Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+and+transcriptional+response+of+Aedes+aegypti+for+Ebinur+Lake+virus,+a+newly+mosquito-borne+orthobunyavirus.">Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Britton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-acquired+dengue+virus+infection--a+case+report.">Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).</li><li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara,+Jalisco,+Mexico+for+Zika+virus.">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).</li></ol>

Målet med denne metoden var å gi en helhetlig risikovurdering av ett myggbårent virus ved å evaluere vektorkompetanse gjennom oral ernæring og intratorakal inokulasjon.
I det orale fôringsforsøket må engorged-mygg plukkes ut og overføres til en ny beholder, noe som utgjør en alvorlig risiko for operatørene. Årsaken til dette er fordi enhver mygg, inkludert uinfiserte mygg, kan være en kilde til infeksjon19. Følgelig må mygg bedøves først, som spesifiser...

Myggbårne virus (MBV), en heterogen gruppe RNA-virus, kan vedvare i myggvektorer og deretter spre seg til virveldyrverter1. De klinisk viktige MBVene er hovedsakelig fordelt i fire virusfamilier, nemlig Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae og Peribunyavividae 2,3. I de siste tiårene har disse virusene blitt rapportert over hele verden, noe som forårsaker folkehelseproblemer. Som en av de mest kjente MBVene har Dengue-viruset (DENV) blitt det mest utbredte fremvoksende eller gjenoppståtte arboviruset i over 100 land i løpet av de siste 20 årene4. Siden oppdagelsen av Zika-virus (ZIKV) i innlandet har nesten alle tropiske og subtropiske land og territorier på kontinentet rapportert menneskelige ZIKV-infeksjoner5. For å vurdere risikoen for virusoverføring har mange studier de siste årene fokusert på myggvektorkompetanse for disse virusene 6,7. Som et resultat er det avgjørende å effektivt forebygge og kontrollere vektorbårne sykdommer.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), en av de lettest oppdrettede myggene i laboratoriet, er en viktig vektor av DENV, ZIKV, Chikungunya-virus (CHIKV) og gulfebervirus (YFV)8. Lenge fantes Ae. aegypti utelukkende på det afrikanske kontinentet og i Sørøst-Asia, men de siste årene har den kolonisert nesten alle kontinenter9. Videre har den globale overfloden av Ae. aegypti kontinuerlig vokst, med en estimert økning på 20% innen slutten av århundret10. Fra 2004 til 2009 i Kina var det en tydelig økning i Ae. aegypti vektorkompetanse for DENV på grunn av høyere dag-til-dag temperaturer11. Statusen til Ae. aegypti som den patogene vektoren har økt betydelig i Kina. For å møte disse utfordringene er det derfor nødvendig å undersøke vektorkompetansen til Ae. aegypti for å overføre virus.
Som en hematofagøs leddyr gjennomborer den kvinnelige myggen huden til en vertebratvert og spiser på blodet. Mygg får av og til virus fra virusinfiserte verter og overfører deretter virusene til en ny vert. Som sådan, for å bestemme vektorkompetanse, blir mygg matet et kunstig blodmel som inneholder arbovirus gjennom et fôringssystem i laboratorieinnstillingen12. Individuelle mygg er separert i hoder, kropper og spytt sekreter flere dager etter infeksjon. For å måle virusinfeksjon, spredning og overføringshastigheter har virustitere blitt detektert ved kvantitativ reverstranskripsjons-PCR (qRT-PCR) eller plakkanalyse. Imidlertid utvikler ikke alle mygg midgut infeksjoner og kapasitet til å overføre et virus til neste vert etter blodfôring. Det er knyttet til myggens fysiologiske barrierer, som hindrer patogener i å trenge inn i kroppen og spiller en viktig rolle i deres medfødte immunitet13. Midttarmbarrierene, spesielt midttarminfeksjonsbarrieren (MIB) og midgut escape barrier (MEB), påvirker om viruset kan infisere vektoren systemisk og effektiviteten som den sprer seg med. Det hindrer analysen av andre vevs infeksjon, for eksempel spyttkjertler som også viser spyttkjertelinfeksjon og rømningsbarrierer13,14. For bedre å karakterisere infeksjonen av midguts og spyttkjertler i vektoren, presenteres en detaljert protokoll for oral fôring og intratorakal inokulering av arbovirus i Ae. aegypti her. Denne protokollen kan brukes på ytterligere arbovirusinfeksjoner i en rekke myggvektorer, for eksempel DENV- og ZIKV-infeksjon i Aedes spp., Og kan vise seg å være en praktisk prosedyre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

Myggbårne virus (MBV), som er smittsomme patogener til vertebrater, spres av mange myggarter, og utgjør en alvorlig trussel mot folkehelsen. Når de er inntatt, må virusene overvinne myggens midttarmbarriere for å nå hemolymfen, hvorfra de potensielt kan spre seg til spyttkjertlene. Når en mygg biter, spres disse virusene til nye vertebratverter. På samme måte kan myggen plukke opp forskjellige virus. Generelt kan bare en liten del av virus komme inn i spyttkjertlene via tarmen. Overføringseffektiviteten til disse virusene til kjertlene påvirkes av de to fysiske barrierene som finnes i forskjellige myggarter: midttarmbarrierer og spyttkjertlerbarrierer. Denne protokollen presenterer en metode for viruspåvisning i spyttkjertler av Aedes aegyptis etter oral ernæring og intratorakal injeksjonsinfeksjon. Videre kan fastsettelse av om tarmen og / eller spyttkjertlene hindrer virusspredning hjelpe til med risikovurderingene av MBV overført av Aedes aegypti.

For å undersøke EBIV-distribusjon i de infiserte myggene via kunstig blodfôring (viral slutttiter var 6,4 x 106 PFU/ml) og intratorakal injeksjon (virusdose var 340 PFU), ble virale RNA i spytt, hoder og innvoller hos myggen 10 dager etter infeksjon (dpi) bestemt.
For Ae. aegypti var virustiter av EBIV i tarm, hoder og spytt hos de intratorakalt inokulerte hunnmyggene mye høyere enn hos de oralinfiserte hunnmyggene (figur 2A-C<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Denne metoden, som inkluderte oral ernæring og intratorakal injeksjonsinfeksjon, kunne effektivt vurdere påvirkningen av midttarms- og/eller spyttkjertelbarrierer på arbovirusinfeksjon.

Eksperimentell virusinfeksjon hos voksne mygg ved oral fôring og mikroinjeksjon

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Denne protokollen kan avgjøre om tarmen og skjoldbruskkjertelen hindrer viral spredning og kan hjelpe til med risikovurderingene av myggbårne virus overført av Aedes aegypti. Vår protokoll inkluderte to infeksjonsmetoder, oral ernæring og intratorakal injeksjon, som effektivt kunne vurdere vektorkompetansen til arbovirus. Denne protokollen kan brukes på ytterligere arbovirusinfeksjoner i en rekke myggvektorer, for eksempel Dengue-virus og Zika-virusinfeksjon i Aedes, og kan vise seg å være en praktisk prosedyre.Demonstrere prosedyren vil være Fei Wang, en forskningsassistent fra laboratoriet mitt. For å utføre kunstig fôring ved hjelp av det kunstige myggfôringssystemet, kutt kollagenmembranene til riktig størrelse, og fest dem til reservoarene med O-ringene. Tilsett tre milliliter av virus-blodblandingen til reservoarene, og forsegle reservoarene ved hjelp av plastplugger for å forhindre lekkasjer.Sett plastkoppene som inneholder mygg inn i hanskerommet. Skru de forseglede reservoarene inn i FU1-materen, og sett ett reservoar på en kopp. Slå på kraftenheten, og mate myggene i en time.Etter fôring, bedøv myggene med is i flere sekunder til de besvimer. Hell de bedøvede myggene i en petriskål plassert på is, og dekk lokket raskt. Plukk engorged kvinnelige mygg med tang, og overfør dem til nye plastkopper på 50 kvinnelige mygg per kopp.Pakk koppen med et kuttet myggnett, og dekk det med et lokk med et hull i midten. Skjær svampen i små biter, og legg dem på koppene. Tilsett 8% glukoseoppløsning på svampen ved hjelp av en engangsdråpe av plast.Plasser koppene som inneholder kvinnelige mygg i inkubatoren ved 27 grader Celsius ved 80% fuktighet i 10 dager. Bytt ut en ny glukosemettet svamp hver 72. For intratorakal inokulasjon, forberede kvinnelige mygg som beskrevet i tekstmanuskriptet.For å forberede den smittsomme virusfortynningen, fjern virusbeholdningen fra fryseren på 80 grader Celsius, og tine dem på is. Fortynn viruslager ved en 100-nanoliters virusfortynning som inneholder 100 til 500 plakkdannende enhetsvirus med RPMI 1640-medium som inneholder 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Legg virusfortynningen på is.Forbered deretter mikroinjeksjonsnålene ved hjelp av en Puller 1000 med parametrene i nåletrekkerprogrammet satt som varmeindeks til 450, kraft i g til 110, avstand i millimeter til en og forsinkelse i sekunder til null. Klipp spissen av en trukket nål med pinsett under et dissekerende mikroskop ved 16x forstørrelse. Fyll på nålen med mineralolje gjennom en steril engangssprøyte.Fest kanylen inn i injektoren i henhold til instruksjonene på maskinen. Stikk kanylen forsiktig inn i et rør som inneholder en smittsom virusfortynning. Trykk deretter på fyllknappen for å fylle omtrent fire mikroliter virusfortynning i nålen.Når kanylen er fylt, må du ikke berøre eller skade nålen. Plukk ca 50 kvinnelige bedøvede mygg med pinsett, og legg dem på en isplate. Plasser platen under injektoren, og sett nålen inn i myggens thoraxhule under et dissekerende mikroskop.Sett injeksjonsvolumet til 100 nanoliter og hastigheten til 50 nanoliter per sekund. Trykk på injeksjonsknappen for å la virusoppløsningen strømme inn i myggen. Etter vellykket injeksjon bukker magen litt.Sett den infiserte myggen i en ny plastkopp plassert på is. Når antall smittede mygg er nok, pakk koppen med et kuttet myggnett og dekk det med lokket. For å samle spytt fra de smittede kvinnelige myggene, hell de bedøvede myggene i en petriskål plassert på is, og lukk lokket raskt.Plasser 10 mikroliter pipettespisser fylt med nedsenkningsolje side om side på gummislammet. Velg de kvinnelige myggene med pinsett, og legg dem på en isplate. Fjern bena og vingene med pinsett.Plasser munndelen av en mygg på hver pipettespiss for å samle spyttet som skilles ut i oljen av myggene ved romtemperatur. Etter 45 til 60 minutter, plasser pipettespissene i 1,5 milliliter rør som inneholder 200 mikroliter virusfortynningsmedium. Sentrifuge rørene ved 5.000 g i fem minutter ved fire grader Celsius for å utvise spytt i rørene.Oppbevar spyttholdige rør ved 80 grader Celsius for senere bestemmelse av overføringshastigheter. Etter spyttsamling, dissekere de smittede kvinnelige myggene. Bruk pinsett, kutt myggens hoder, og legg hvert hode inn i et individuelt rør som inneholder 200 mikroliter RPMI 1640 medium.Ta tak i brystkassen med en pinsett. Ta deretter tak i det nest siste segmentet av magen med en annen pinsett, og trekk tarmen ut. Rengjør tarmen for bortkommen vev og organer.Vask tarmen med PBS, og plasser hver tarm i et individuelt rør som inneholder 200 mikroliter RPMI 1640 medium. Oppbevar disse rørene ved 80 grader Celsius for senere bestemmelse av virusspredning og infeksjonshastighet. I denne representative analysen ble virale RNA i tarmen, hodet og spyttet til hunnmyggene 10 dager etter infeksjon bestemt.Virustiteren av Ebinur Lake-viruset i tarmen, hodene og spyttet til de intratorakalt inokulerte myggene var høyere enn i de oralinfiserte myggene. Infeksjons- og spredningshastigheten for de intratorakalt inokulerte myggene var 100% og for de oralinfiserte myggene ble funnet å være henholdsvis 70% og 38,1%. Overføringshastigheten for de intratorakalt inokulerte myggene nådde opptil 90%men for de oralinfiserte myggene var bare 4,8%De engorged kvinnelige myggene ble plukket for å opprettholde konsistens, da fôringsmengden påvirker virusinnholdet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrking Microglia fra Neonatal og voksne sentralnervesystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D- og 3D-kromosommaleri i malariamygg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvikling av lyofilisert Loop-mediert Isotermiske amplifiseringsreagenser for deteksjon av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling av Influensa neuraminidase Inhibering antistofftitere ved enzym-bundet lektin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Oppdagelse av lavt kopi nummer integrert virus-DNA dannet av In Vitro hepatitt B-smitte

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modellering tuberkulose Mycobacterium marinum infisert voksen sebrafisk

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...