Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Эта работа была поддержана Уханьским проектом научно-технического плана (2018201261638501).

1. Подготовка вирусов и комаров
<ol><li>Подготовка вирусов ПРИМЕЧАНИЕ: Все процессы проводились в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Используемый уровень биобезопасности должен определяться оценкой риска патогена и правилами, характерными для стран и регионов. Процесс...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+update+of+phylum+Negarnaviricota+(Riboviria:+Orthornavirae),+including+the+large+orders+Bunyavirales+and+Mononegavirales.">Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales.</a> Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).</li><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika:+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus.">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+DENV-2+Among+Aedes+albopictus+(Diptera:+Culicidae)+Populations+in+China.">Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).</li><li>Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Zika+virus+by+SYBR+green+one-step+real-time+RT-PCR.">Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR.</a> Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+and+transcriptional+response+of+Aedes+aegypti+for+Ebinur+Lake+virus,+a+newly+mosquito-borne+orthobunyavirus.">Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Britton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-acquired+dengue+virus+infection--a+case+report.">Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).</li><li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara,+Jalisco,+Mexico+for+Zika+virus.">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).</li></ol>

Цель этого метода состояла в том, чтобы обеспечить всестороннюю оценку риска одного вируса, переносимого комарами, путем оценки компетентности переносчиков посредством перорального кормления и внутригрудной инокуляции.
В эксперименте с пероральным кормлением набухши...

Переносимые комарами вирусы (MBV), гетерогенная группа РНК-вирусов, могут сохраняться в комарах-переносчиках и впоследствии распространяться на позвоночныххозяев1. Клинически значимые MBV в основном распространены в четырех семействах вирусов, а именно Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae и Peribunyavividae 2,3. В последние десятилетия эти вирусы были зарегистрированы по всему миру, вызывая проблемы общественного здравоохранения. Будучи одним из наиболее известных МБВ, вирус денге (DENV) стал наиболее распространенным возникающим или вновь возникающим арбовирусом в более чем 100 странах за последние 20 лет4. С момента обнаружения вируса Зика (ZIKV) внутри страны почти все тропические и субтропические страны и территории континента сообщили о случаях инфицирования людей вирусом ZIKV5. Чтобы оценить риск передачи вируса, многочисленные исследования в последние годы были сосредоточены на компетентности комаров-переносчиков этих вирусов 6,7. В связи с этим крайне важно эффективно предотвращать трансмиссивные болезни и бороться с ними.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), один из комаров, которых легче всего выращивать в лаборатории, является важным переносчиком DENV, ZIKV, вируса чикунгунья (CHIKV) и вируса желтой лихорадки (YFV)8. Долгое время Ae. aegypti был найден исключительно на африканском континенте и в Юго-Восточной Азии, но в последние годы он колонизировал почти все континенты9. Кроме того, глобальная численность Ae. aegypti постоянно растет, и, по оценкам, к концу столетия она увеличится на 20%10. В период с 2004 по 2009 гг. в Китае наблюдалось явное увеличение компетентности переносчиков Ae. aegypti для DENV из-за более высоких дневных температур11. Статус Ae. aegypti как патогенного переносчика значительно повысился в Китае. Следовательно, для решения этих проблем необходимо исследовать векторную способность Ae. aegypti передавать вирусы.
Как членистоногое-гематофаг, самка комара прокалывает кожу позвоночного хозяина и питается кровью. Комары иногда приобретают вирусы от инфицированных вирусом хозяев, а затем передают вирусы новому хозяину. Таким образом, для определения компетентности переносчиков комаров кормят искусственной кровяной мукой, содержащей арбовирусы, через систему кормления в лабораторных условиях12. Отдельные комары разделяются на головы, тела и выделения слюны через несколько дней после заражения. Для измерения вирусной инфекции, скорости распространения и передачи титры вируса были обнаружены с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR) или анализа бляшек. Однако не у всех комаров развиваются инфекции средней кишки и способность передавать вирус следующему хозяину после кормления кровью. Это связано с физиологическими барьерами комаров, которые препятствуют проникновению патогенов в организм и играют жизненно важную роль в их врожденном иммунитете13. Барьеры средней кишки, особенно инфекционный барьер средней кишки (MIB) и барьер побега средней кишки (MEB), влияют на то, может ли вирус системно инфицировать вектора и эффективность, с которой он распространяется. Он препятствует анализу инфекции других тканей, таких как слюнные железы, которые также проявляют инфекцию слюнных желез и избегают барьеров13,14. Чтобы лучше охарактеризовать инфекцию средней кишки и слюнных желез у переносчика, здесь представлен подробный протокол перорального кормления и внутригрудной инокуляции арбовируса Ae. aegypti. Этот протокол может быть применен к дополнительным арбовирусным инфекциям у различных комаров-переносчиков, таких как инфекция DENV и ZIKV у Aedes spp., и может оказаться практически осуществимой процедурой.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

Вирусы, переносимые комарами (MBV), которые являются инфекционными патогенами для позвоночных, распространяются многими видами комаров, представляя серьезную угрозу для здоровья населения. После попадания в организм вирусы должны преодолеть барьер средней кишки комара, чтобы достичь гемолимфы, откуда они потенциально могут распространиться на слюнные железы. Когда комар кусает, эти вирусы распространяются на новых позвоночных хозяев. Точно так же комар может подхватывать разные вирусы. Как правило, только крошечная часть вирусов может проникать в слюнные железы через кишечник. На эффективность передачи этих вирусов в железы влияют два физических барьера, обнаруженных у разных видов комаров: барьеры средней кишки и барьеры слюнных желез. Этот протокол представляет собой метод обнаружения вируса в слюнных железах Aedes aegypti после перорального кормления и внутригрудной инъекционной инфекции. Кроме того, определение того, препятствуют ли кишки и/или слюнные железы распространению вируса, может помочь в оценке риска MBV, передаваемых Aedes aegypti.

Для изучения распределения EBIV у инфицированных комаров с помощью искусственного кормления кровью (конечный титр вируса составлял 6,4 x 106 БОЕ/мл) и внутригрудной инъекции (вирусная доза составила 340 БОЕ) определяли вирусные РНК в слюне, головах и кишках комаров через 10 дней посл...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Эта методология, которая включала пероральное кормление и инфекцию внутригрудных инъекций, могла эффективно оценить влияние барьеров средней кишки и/или слюнных желез на арбовирусную инфекцию.

Экспериментальная вирусная инфекция у взрослых комаров при пероральном кормлении и микроинъекциях

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Этот протокол может определить, препятствуют ли кишки и щитовидная железа распространению вируса, и может помочь в оценке риска вирусов, переносимых комарами, передаваемых Aedes aegypti. Наш протокол включал два метода инфекции: пероральное кормление и внутригрудную инъекцию, которые могли эффективно оценить векторную компетентность арбовируса. Этот протокол может быть применен к дополнительным арбовирусным инфекциям у различных комаров-переносчиков, таких как вирус денге и вирус Зика в Аэдесе, и может оказаться практически осуществимой процедурой.Продемонстрировать процедуру будет Фэй Ван, научный сотрудник моей лаборатории. Чтобы выполнить искусственное кормление с использованием системы искусственного кормления комаров, обрежьте коллагеновые мембраны до соответствующего размера и закрепите их на резервуарах с помощью уплотнительных колец. Добавьте в резервуары три миллилитра смеси вируса и крови и загерметизируйте резервуары пластиковыми пробками для предотвращения утечек.Положите пластиковые стаканчики с комарами в бардачок. Вкрутите герметичные резервуары в кормушку FU1 и поставьте один резервуар на одну чашку. Включите блок питания, и кормите комаров в течение одного часа.После кормления обезболивайте комаров льдом в течение нескольких секунд, пока они не упадут в обморок. Вылейте обезболиваемых комаров в чашку Петри, помещенную на лед, и быстро накройте крышкой. Соберите набухших самок комаров щипцами и переложите их в новые пластиковые стаканчики по 50 самок комаров на чашку.Оберните чашку разрезанной сеткой от москитной сетки, и накройте ее крышкой с отверстием посередине. Нарежьте губку небольшими кусочками и выложите их на чашки. Добавьте 8% раствор глюкозы на губку с помощью пластиковой одноразовой пипетки.Поместите чашки с самками комаров в инкубатор при температуре 27 градусов Цельсия при влажности 80% на 10 дней. Заменяйте новую губку, насыщенную глюкозой, каждые 72 часа. Для внутригрудной инокуляции подготовьте самок комаров, как описано в текстовой рукописи.Чтобы приготовить разбавление инфекционного вируса, достаньте вирусный бульон из морозильной камеры при температуре 80 градусов Цельсия и разморозьте его на льду. Разбавляют вирусный запас в 100-нанолитровом разведении вируса, содержащего от 100 до 500 бляшечных единиц вируса, средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина. Поместите разведение вируса на лед.Затем подготовьте иглы для микроинъекций с помощью Puller 1000 с параметрами в программе съёмника игл, установленными как индекс тепла 450, усилие в g до 110, расстояние в миллиметре до единицы и задержка в секундах до нуля. Отрежьте кончик вытащенной иглы пинцетом под препарирующим микроскопом при 16-кратном увеличении. Залейте иглу минеральным маслом через одноразовый стерильный шприц.Вставьте иглу в инжектор, следуя инструкциям на машине. Осторожно вставьте иглу в трубку, содержащую разведение инфекционного вируса. Затем нажмите кнопку «Заполнить», чтобы залить в иглу примерно четыре микролитра разбавления вируса.После заполнения иглы не прикасайтесь к игле и не повреждайте ее. Соберите пинцетом примерно 50 самок анестезированных комаров и положите их на тарелку со льдом. Поместите пластину под инъектор, а иглу вставьте в грудную полость комара под препарирующим микроскопом.Установите объем впрыска на 100 нанолитров и скорость на 50 нанолитров в секунду. Нажмите кнопку «Впрыскать», чтобы раствор вируса попал в комара. При успешной инъекции живот слегка выпячивается.Положите зараженного комара в новый пластиковый стаканчик, поставленный на лед. Когда количество зараженных комаров станет достаточным, оберните чашку разрезанной сеткой от москитов и накройте крышкой. Чтобы собрать слюну зараженных самок комаров, вылейте анестезированных комаров в чашку Петри, помещенную на лед, и быстро закройте крышку.Положите наконечники пипеток объемом 10 микролитров, наполненные иммерсионным маслом, рядом на резиновую грязь. Соберите самок комаров пинцетом и положите их на тарелку со льдом. Удалите им ножки и крылышки пинцетом.Поместите ротовой аппарат одного комара на каждый наконечник пипетки, чтобы собрать слюну, выделяемую комарами в масло при комнатной температуре. Через 45-60 минут поместите наконечники пипеток в 1,5-миллилитровые пробирки, содержащие 200 микролитров среды для разбавления вируса. Центрифугируйте пробирки при 5 000 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы вытеснить слюну в пробирки.Храните слюносодержащие трубки при температуре 80 градусов Цельсия для последующего определения скорости передачи. После сбора слюны препарируйте зараженных самок комаров. С помощью пинцета отрежьте головы комаров и поместите каждую голову в отдельную трубку, содержащую 200 микролитров среды RPMI 1640.Захватите грудную клетку пинцетом. Затем захватите предпоследний сегмент живота другим пинцетом и вытащите кишку. Очистите кишечник от любых бродячих тканей и органов.Промойте кишечник PBS и поместите каждую кишку в отдельную пробирку, содержащую 200 микролитров среды RPMI 1640. Храните эти пробирки при температуре 80 градусов Цельсия для последующего определения распространения вируса и скорости заражения. В этом репрезентативном анализе были определены вирусные РНК в кишечнике, голове и слюне самок комаров через 10 дней после заражения.Титр вируса озера Эбинур в кишечнике, головах и слюне внутригрудно инокулированных комаров был выше, чем у комаров, инфицированных орально. Коэффициент инфицирования и распространения для внутригрудных инокулированных комаров составил 100%, а для комаров, инфицированных орально, - 70% и 38,1% соответственно. Скорость передачи для внутригрудно инокулированных комаров достигала 90%, но для комаров, инфицированных орально, составляла только 4,8%Набухшие самки комаров были отобраны для поддержания консистенции, так как количество корма влияет на содержание вируса.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Аналитический инструмент коробки комплексных биохимические, структурные и транскриптома Оценка устного Биопленки посредничестве Mutans стрептококков

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Выявление инфекционных Касперского с поля, собранные Комары от Vero Пробирной культуры клеток

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D и 3D хромосомная живопись у малярийных комаров

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Измерение гриппа нейраминидазы ингибирования Титры антител методом ферментативного лектина Пробирной

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Обнаружение низких копии число комплексных вирусной ДНК, образованный в Vitro инфекции гепатита B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Моделирование туберкулеза Mycobacterium marinum инфицированных взрослых рыбок данио

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...