Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Wuhan (2018201261638501).

1. Preparación de virus y mosquitos
<ol><li>Preparación de virus NOTA: Todos los procesos se llevaron a cabo en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). El nivel de contención de bioseguridad utilizado debe determinarse mediante la evaluación de riesgos del patógeno y las regulaciones específicas de las naciones y regiones. El proceso debe realizarse en un gabinete de bioseguridad.<ol><li>Inocular 1 x 106 células C6/36 en un matraz de cultivo T75. Llene el matraz con 10 m...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. 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El objetivo de este método era proporcionar una evaluación integral del riesgo de un virus transmitido por mosquitos mediante la evaluación de la competencia del vector a través de la alimentación oral y la inoculación intratorácica.
En el experimento de alimentación oral, los mosquitos hinchados deben ser recogidos y transferidos a un nuevo contenedor, lo que representa un grave riesgo para los operadores. La razón de esto es porque cualquier mosquito, incluidos los mosquitos no infe...

Los virus transmitidos por mosquitos (MBV), un grupo heterogéneo de virus de ARN, pueden persistir en los mosquitos vectores y posteriormente propagarse a los huéspedes vertebrados1. Los MBV clínicamente importantes se distribuyen principalmente en cuatro familias de virus, a saber, Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae y Peribunyavividae 2,3. En las últimas décadas, estos virus se han reportado en todo el mundo, causando problemas de salud pública. Como uno de los MBV más conocidos, el virus del dengue (DENV) se ha convertido en el arbovirus emergente o reemergente más prevalente en más de 100 países durante los últimos 20 años4. Desde el descubrimiento del virus del Zika (ZIKV) en el interior, casi todos los países y territorios tropicales y subtropicales del continente han notificado infecciones humanas por ZIKV5. Con el fin de evaluar el riesgo de transmisión del virus, numerosos estudios en los últimos años se han centrado en la competencia del vector mosquito para estos virus 6,7. Como resultado, es fundamental prevenir y controlar eficazmente las enfermedades transmitidas por vectores.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), uno de los mosquitos más fáciles de criar en el laboratorio, es un vector importante de DENV, ZIKV, virus Chikungunya (CHIKV) y virus de la fiebre amarilla (YFV)8. Durante mucho tiempo, Ae. aegypti se encontró únicamente en el continente africano y en el sudeste asiático, pero en los últimos años ha colonizado casi todos los continentes9. Además, la abundancia global de Ae. aegypti ha estado creciendo continuamente, con un aumento estimado del 20% para fines del siglo10. De 2004 a 2009 en China, hubo un aumento evidente en la competencia vectorial Ae. aegypti para DENV debido a temperaturas diarias más altas11. El estado de Ae. aegypti como vector patógeno ha aumentado significativamente en China. En consecuencia, para abordar estos desafíos, es necesario investigar la competencia vectorial de Ae. aegypti para transmitir virus.
Como artrópodo hematófago, el mosquito hembra perfora la piel de un huésped vertebrado y se alimenta de la sangre. Los mosquitos ocasionalmente adquieren virus de huéspedes infectados por virus y luego transfieren los virus a un nuevo huésped. Como tal, para determinar la competencia del vector, los mosquitos son alimentados con una harina de sangre artificial que contiene arbovirus a través de un sistema de alimentación en el entorno de laboratorio12. Los mosquitos individuales se separan en cabezas, cuerpos y secreciones de saliva varios días después de la infección. Para medir las tasas de infección, diseminación y transmisión del virus, se han detectado títulos de virus mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa (qRT-PCR) o ensayo de placa. Sin embargo, no todos los mosquitos desarrollan infecciones del intestino medio y la capacidad de transferir un virus al siguiente huésped después de la alimentación con sangre. Está relacionado con las barreras fisiológicas de los mosquitos, que evitan que los patógenos penetren en el cuerpo y juegan un papel vital en su inmunidad innata13. Las barreras del intestino medio, en particular la barrera de infección del intestino medio (MIB) y la barrera de escape del intestino medio (MEB), influyen en si el virus podría infectar el vector sistémicamente y la eficiencia con la que se propaga. Obstruye el análisis de la infección de otros tejidos, como las glándulas salivales, que también presentan infección de las glándulas salivales y barreras de escape13,14. Para caracterizar mejor la infección del intestino medio y las glándulas salivales en el vector, se presenta aquí un protocolo detallado para la alimentación oral y la inoculación intratorácica de arbovirus en Ae. aegypti. Este protocolo podría aplicarse a infecciones adicionales por arbovirus en una variedad de mosquitos vectores, como la infección por DENV y ZIKV en Aedes spp., y podría resultar un procedimiento practicable.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

Los virus transmitidos por mosquitos (MBV), que son patógenos infecciosos para los vertebrados, se propagan por muchas especies de mosquitos, lo que representa una grave amenaza para la salud pública. Una vez ingeridos, los virus deben superar la barrera del intestino medio del mosquito para llegar a la hemolinfa, desde donde podrían propagarse a las glándulas salivales. Cuando un mosquito pica, estos virus se propagan a nuevos huéspedes vertebrados. Del mismo modo, el mosquito puede recoger diferentes virus. En general, solo una pequeña porción de virus puede ingresar a las glándulas salivales a través del intestino. La eficiencia de transmisión de estos virus a las glándulas se ve afectada por las dos barreras físicas que se encuentran en diferentes especies de mosquitos: las barreras del intestino medio y las barreras de las glándulas salivales. Este protocolo presenta un método para la detección del virus en las glándulas salivales de Aedes aegypti después de la alimentación oral y la infección por inyección intratorácica. Además, determinar si los intestinos y / o las glándulas salivales dificultan la propagación viral puede ayudar en las evaluaciones de riesgo de MBV transmitidos por Aedes aegypti.

Para examinar la distribución del EBIV en los mosquitos infectados a través de la alimentación con sangre artificial (el título final viral fue de 6,4 x 106 UFP/ml) y la inyección intratorácica (la dosis viral fue de 340 UFP), se determinaron los ARN virales en saliva, cabezas e intestinos de los mosquitos a los 10 días después de la infección (dpi).
Para Ae. aegypti, el título del virus EBIV en los intestinos, la cabeza y la saliva de los mosquitos hembr...

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Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Esta metodología, que incluyó la alimentación oral y la infección por inyección intratorácica, podría evaluar eficazmente la influencia de las barreras del intestino medio y/o de las glándulas salivales en la infección por arbovirus.

Infección viral experimental en mosquitos adultos por alimentación oral y microinyección

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Este protocolo puede determinar si los intestinos y las glándulas tiroides dificultan la propagación viral y puede ayudar en las evaluaciones de riesgo de los virus transmitidos por mosquitos transmitidos por Aedes aegypti. Nuestro protocolo incluía dos métodos de infección, la alimentación oral y la inyección intratorácica, que podrían evaluar eficazmente la competencia vectorial del arbovirus. Este protocolo podría aplicarse a infecciones adicionales por arbovirus en una variedad de mosquitos vectores, como el virus del dengue y la infección por el virus Zika en Aedes, y podría resultar un procedimiento practicable.Demostrando el procedimiento estará Fei Wang, un asistente de investigación de mi laboratorio. Para realizar la alimentación artificial utilizando el sistema de alimentación artificial de mosquitos, corte las membranas de colágeno al tamaño adecuado y asegúrelas a los reservorios con las juntas tóricas. Agregue tres mililitros de la mezcla de virus y sangre a los depósitos y selle los depósitos con tapones de plástico para evitar fugas.Coloque los vasos de plástico que contienen mosquitos en la guantera. Atornille los depósitos sellados en el alimentador FU1 y coloque un depósito en una taza. Encienda la unidad de alimentación y alimente a los mosquitos durante una hora.Después de alimentarse, anestesie a los mosquitos con hielo durante varios segundos hasta que se desmayen. Vierta los mosquitos anestesiados en una placa de Petri colocada sobre hielo y cubra la tapa rápidamente. Escoja mosquitos hembra hinchados con fórceps y transfiéralos a nuevos vasos de plástico a 50 mosquitos hembra por taza.Envuelva la taza con una malla de mosquitero cortada y cúbrala con una tapa con un agujero en el medio. Corte la esponja en trozos pequeños y colóquelos en las tazas. Agregue una solución de glucosa al 8% en la esponja con un gotero desechable de plástico.Coloque las tazas que contienen mosquitos hembra en la incubadora a 27 grados centígrados al 80% de humedad durante 10 días. Reemplace una nueva esponja saturada de glucosa cada 72 horas. Para la inoculación intratorácica, prepare mosquitos hembra como se describe en el texto manuscrito.Para preparar la dilución del virus infeccioso, retire las existencias de virus del congelador de 80 grados centígrados y descongélelas en hielo. Stock de virus diluido en una dilución de virus de 100 nanolitros que contiene de 100 a 500 unidades formadoras de placa de virus con medio RPMI 1640 que contiene 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Coloque la dilución del virus en hielo.A continuación, prepare las agujas de microinyección utilizando un Puller 1000 con los parámetros del programa de extracción de agujas establecidos como índice de calor en 450, fuerza en g a 110, distancia en milímetros a uno y retraso en segundos a cero. Corte la punta de una aguja tirada con pinzas bajo un microscopio de disección con un aumento de 16x. Rellene la aguja con aceite mineral a través de una jeringa estéril desechable.Coloque la aguja en el inyector siguiendo las instrucciones de la máquina. Inserte la aguja cuidadosamente en un tubo que contenga una dilución de virus infecciosos. Luego, presione el botón Rellenar para llenar aproximadamente cuatro microlitros de dilución de virus en la aguja.Una vez que la aguja esté llena, no la toque ni la dañe. Escoja aproximadamente 50 mosquitos hembras anestesiados con pinzas y colóquelos en una placa de hielo. Coloque la placa debajo del inyector e inserte la aguja en la cavidad torácica del mosquito bajo un microscopio de disección.Ajuste el volumen de inyección a 100 nanolitros y la velocidad a 50 nanolitros por segundo. Presione el botón Inyectar para permitir que la solución del virus fluya hacia el mosquito. Tras una inyección exitosa, el abdomen sobresale ligeramente.Coloque el mosquito infectado en un nuevo vaso de plástico colocado en hielo. Cuando el número de mosquitos infectados sea suficiente, envuelva la taza con una malla de mosquitero cortada y cúbrala con la tapa. Para recolectar saliva de los mosquitos hembra infectados, vierta los mosquitos anestesiados en una placa de Petri colocada en hielo y cierre la tapa rápidamente.Coloque las puntas de pipeta de 10 microlitros llenas de aceite de inmersión una al lado de la otra sobre el barro de goma. Elija los mosquitos hembra con pinzas y colóquelos en una placa de hielo. Quítale las patas y las alas con unas pinzas.Coloque la parte bucal de un mosquito en cada punta de pipeta para recoger la saliva secretada en el aceite por los mosquitos a temperatura ambiente. Después de 45 a 60 minutos, coloque las puntas de la pipeta en tubos de 1,5 mililitros que contengan 200 microlitros de medio diluyente de virus. Centrifugar los tubos a 5.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para expulsar la saliva en los tubos.Almacene los tubos que contienen saliva a 80 grados centígrados para la posterior determinación de las velocidades de transmisión. Después de la recolección de saliva, disecciona los mosquitos hembra infectados. Usando pinzas, corte las cabezas de los mosquitos y coloque cada cabeza en un tubo individual que contenga 200 microlitros de RPMI 1640 medio.Agarra el tórax con una pinza. Luego, agarre el penúltimo segmento del abdomen con otra pinza y saque la tripa. Limpie el intestino en busca de tejidos y órganos perdidos.Lave el intestino con PBS y coloque cada intestino en un tubo individual que contenga 200 microlitros de RPMI 1640 medio. Almacene estos tubos a 80 grados centígrados para la posterior determinación de la propagación del virus y la tasa de infección. En este análisis representativo, se determinaron los ARN virales en el intestino, la cabeza y la saliva de los mosquitos hembra a los 10 días posteriores a la infección.El título del virus del lago Ebinur en las entrañas, la cabeza y la saliva de los mosquitos inoculados intratorácicamente fue mayor que en los mosquitos infectados oralmente. La tasa de infección y diseminación para los mosquitos inoculados intratorácicamente fue del 100% y para los mosquitos infectados oralmente fue del 70% y 38,1%, respectivamente. La tasa de transmisión para los mosquitos inoculados intratorácica alcanzó hasta el 90%, pero para los mosquitos infectados oralmente fue solo del 4,8%Los mosquitos hembra hinchados fueron elegidos para mantener la consistencia, ya que la cantidad de alimentación afecta el contenido viral.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

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The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

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Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

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