Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Beredning av virus och myggor
<ol><li>Framställning av virus OBS: Alla processer utfördes i ett biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) laboratorium. Nivån på biosäkerhetskontaminering som används bör bestämmas av patogenens riskbedömning och bestämmelser som är specifika för nationer och regioner. Processen måste utföras i ett biosäkerhetsskåp.<ol><li>Inokulera 1 x 106 C6/36-celler i en T75-odlingskolv. Fyll kolven med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium inne...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+update+of+phylum+Negarnaviricota+(Riboviria:+Orthornavirae),+including+the+large+orders+Bunyavirales+and+Mononegavirales.">Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales.</a> Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).</li><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika:+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus.">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+DENV-2+Among+Aedes+albopictus+(Diptera:+Culicidae)+Populations+in+China.">Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).</li><li>Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Zika+virus+by+SYBR+green+one-step+real-time+RT-PCR.">Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR.</a> Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+and+transcriptional+response+of+Aedes+aegypti+for+Ebinur+Lake+virus,+a+newly+mosquito-borne+orthobunyavirus.">Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Britton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-acquired+dengue+virus+infection--a+case+report.">Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).</li><li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara,+Jalisco,+Mexico+for+Zika+virus.">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).</li></ol>

Målet med denna metod var att tillhandahålla en omfattande riskbedömning av ett myggburet virus genom att utvärdera vektorkompetens genom oral utfodring och intratorakal inokulering.
I det orala utfodringsexperimentet måste engorged-myggor plockas ut och överföras till en ny behållare, vilket utgör en allvarlig risk för operatörerna. Anledningen till detta är att någon mygga, inklusive oinfekterade myggor, kan vara en källa till infektion19. Följaktligen ...

Myggburna virus (MBV), en heterogen grupp av RNA-virus, kan kvarstå i myggvektorer och därefter spridas till ryggradsdjurvärdar 1. De kliniskt viktiga MBV:erna är huvudsakligen fördelade i fyra virusfamiljer, nämligen Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae och Peribunyavividae 2,3. Under de senaste decennierna har dessa virus rapporterats över hela världen och orsakat folkhälsoproblem. Som en av de mest kända MBV: erna har Dengue-virus (DENV) blivit det vanligaste framväxande eller återuppväxande arboviruset i över 100 länder under de senaste 20 åren4. Sedan upptäckten av Zika-virus (ZIKV) inåt landet har nästan alla tropiska och subtropiska länder och territorier på kontinenten rapporterat humana ZIKV-infektioner5. För att bedöma risken för virusöverföring har många studier de senaste åren fokuserat på myggvektorkompetens för dessa virus 6,7. Som ett resultat är det viktigt att effektivt förebygga och kontrollera vektorburna sjukdomar.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), en av de lättast uppfödda myggorna i laboratoriet, är en viktig vektor av DENV, ZIKV, Chikungunya-virus (CHIKV) och gulfebervirus (YFV)8. Under lång tid hittades Ae. aegypti enbart på den afrikanska kontinenten och i Sydostasien, men de senaste åren har den koloniserat nästan alla kontinenter9. Dessutom har det globala överflödet av Ae. aegypti ökat kontinuerligt, med en uppskattad ökning med 20% i slutet av seklet10. Från 2004 till 2009 i Kina fanns det en tydlig ökning av Ae. aegypti vektorkompetens för DENV på grund av högre dagliga temperaturer11. Statusen för Ae. aegypti som den patogena vektorn har ökat avsevärt i Kina. För att ta itu med dessa utmaningar är det därför nödvändigt att undersöka vektorkompetensen hos Ae. aegypti att överföra virus.
Som en hematofagisk leddjur genomtränger den kvinnliga myggan huden hos en ryggradsdjur värd och matar på blodet. Myggor förvärvar ibland virus från virusinfekterade värdar och överför sedan virusen till en ny värd. Som sådan, för att bestämma vektorkompetens, matas myggor ett konstgjort blodmjöl innehållande arbovirus genom ett matningssystem i laboratorieinställningen12. Enskilda myggor separeras i huvuden, kroppar och salivsekretioner flera dagar efter infektion. För att mäta virusinfektion, spridning och överföringshastigheter har virustitrar detekterats genom kvantitativ omvänd transkription PCR (qRT-PCR) eller plackanalys. Men inte alla myggor utvecklar midgutinfektioner och förmågan att överföra ett virus till nästa värd efter blodmatning. Det är kopplat till myggans fysiologiska barriärer, som hindrar patogener från att tränga in i kroppen och spelar en viktig roll i deras medfödda immunitet13. Midgutbarriärerna, särskilt midgut infection barrier (MIB) och midgut escape barrier (MEB), påverkar om viruset kan infektera vektorn systemiskt och effektiviteten med vilken den sprids. Det hindrar analysen av andra vävnaders infektion, såsom spottkörtlar som också uppvisar spottkörtelinfektion och undgår hinder13,14. För att bättre karakterisera infektionen av midguts och spottkörtlar i vektorn, presenteras ett detaljerat protokoll för oral utfodring och intratorakal inokulering av arbovirus i Ae. aegypti häri. Detta protokoll kan tillämpas på ytterligare arbovirusinfektioner i en mängd olika myggvektorer, såsom DENV- och ZIKV-infektion i Aedes spp., och kan visa sig vara ett praktiskt förfarande.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

Myggburna virus (MBV), som är infektiösa patogener för ryggradsdjur, sprids av många myggarter och utgör ett allvarligt hot mot folkhälsan. När de väl har intagits måste virusen övervinna myggmidgutbarriären för att nå hemolymfen, varifrån de potentiellt kan spridas till spottkörtlarna. När en mygga biter sprids dessa virus till nya ryggradsdjurvärdar. På samma sätt kan myggan plocka upp olika virus. I allmänhet kan endast en liten del av virus komma in i spottkörtlarna via tarmen. Överföringseffektiviteten hos dessa virus till körtlarna påverkas av de två fysiska barriärerna som finns i olika myggarter: midgutbarriärer och spottkörtlar barriärer. Detta protokoll presenterar en metod för virusdetektion i spottkörtlar av Aedes aegyptis efter oral utfodring och intratorakal injektionsinfektion. Dessutom kan bestämning av om tarmarna och / eller spottkörtlarna hindrar viral spridning hjälpa till vid riskbedömningar av MBV som överförs av Aedes aegypti.

För att undersöka EBIV-fördelningen i de infekterade myggorna via artificiell blodmatning (den virala slutliga titern var 6,4 x 106 PFU/ml) och intratorakal injektion (virusdosen var 340 PFU) bestämdes virala RNA i saliv, huvuden och myggtarmar 10 dagar efter infektion (dpi).
För Ae. aegypti var virustiter av EBIV i tarmar, huvuden och saliv hos de intratorakiskt inokulerade kvinnliga myggorna mycket högre än hos de oralt infekterade kvinnliga myggorna (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Denna metod, som inkluderade oral utfodring och intratorakal injektionsinfektion, kunde effektivt bedöma påverkan av midgut och / eller spottkörtelbarriärer på arbovirusinfektion.

Experimentell virusinfektion hos vuxna myggor genom oral utfodring och mikroinjektion

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Detta protokoll kan avgöra om tarmarna och sköldkörteln hindrar viral spridning och kan hjälpa till vid riskbedömningar av myggburna virus som överförs av Aedes aegypti. Vårt protokoll inkluderade två infektionsmetoder, oral matning och intratorakal injektion, som effektivt kunde bedöma vektorkompetensen hos arbovirus. Detta protokoll kan tillämpas på ytterligare arbovirusinfektioner i en mängd olika myggvektorer, såsom Dengue-virus och Zika-virusinfektion i Aedes, och kan visa sig vara ett praktiskt förfarande.Fei Wang, en forskningsassistent från mitt labb, demonstrerar proceduren. För att utföra konstgjord utfodring med hjälp av det konstgjorda myggmatningssystemet, skär kollagenmembranen till lämplig storlek och säkra dem till behållarna med O-ringarna. Tillsätt tre milliliter av virus-blodblandningen till behållarna och täta behållarna med plastproppar för att förhindra läckage.Lägg plastkopparna som innehåller myggor i handskfacket. Skruva fast de förseglade behållarna i FU1-mataren och sätt en behållare på en kopp. Slå på kraftenheten och mata myggorna i en timme.Efter matning, bedöva myggorna med is i flera sekunder tills de svimmar. Häll de bedövade myggorna i en petriskål placerad på is och täck locket snabbt. Plocka engorged kvinnliga myggor med pincett och överför dem till nya plastkoppar med 50 kvinnliga myggor per kopp.Vik koppen med ett skuret myggnät och täck det med ett lock med ett hål i mitten. Skär svampen i små bitar och lägg dem på kopparna. Tillsätt 8% glukoslösning på svampen med en engångspipett av plast.Placera kopparna som innehåller kvinnliga myggor i inkubatorn vid 27 grader Celsius vid 80%fuktighet i 10 dagar. Byt ut en ny glukosmättad svamp var 72: e timme. För intratorakal ympning, förbered kvinnliga myggor som beskrivs i textmanuskriptet.För att förbereda den infektiösa virusutspädningen, ta bort virusbeståndet från frysen på 80 grader Celsius och tina dem på is. Späd virusstammen vid en 100-nanoliters virusutspädning innehållande 100 till 500 plackbildande enheter virus med RPMI 1640-medium innehållande 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin. Placera virusutspädningen på is.Förbered sedan mikroinjektionsnålarna med en Puller 1000 med parametrarna i nålavdragarprogrammet inställda som värmeindex till 450, kraft i g till 110, avstånd i millimeter till en och fördröjning i sekunder till noll. Skär spetsen på en dragen nål med pincett under ett dissekerande mikroskop vid 16x förstoring. Återfyll nålen med mineralolja genom en steril engångsspruta.Sätt fast nålen i injektorn enligt anvisningarna på maskinen. För försiktigt in nålen i ett rör som innehåller en infektiös virusspädning. Tryck sedan på knappen Fyll för att fylla cirka fyra mikroliter virusspädning i nålen.När nålen är fylld, rör inte vid eller skada nålen. Plocka cirka 50 kvinnliga bedövade myggor med pincett och lägg dem på en isplatta. Placera plattan under injektorn och sätt in nålen i myggans brösthålighet under ett dissekeringsmikroskop.Ställ in injektionsvolymen på 100 nanoliter och hastigheten på 50 nanoliter per sekund. Tryck på knappen Injicera för att låta viruslösningen flöda in i myggan. Vid framgångsrik injektion utbuktar buken något.Lägg den infekterade myggan i en ny plastkopp placerad på is. När antalet infekterade myggor är tillräckligt, linda koppen med ett skuret myggnät och täck det med locket. För att samla saliv från de infekterade kvinnliga myggorna, häll de bedövade myggorna i en petriskål placerad på is och stäng locket snabbt.Placera 10-mikroliters pipettspetsar fyllda med nedsänkningsolja sida vid sida på gummislammen. Plocka kvinnliga myggor med pincett och lägg dem på en isplatta. Ta bort benen och vingarna med pincett.Placera munstycket av en mygga på varje pipettspets för att samla saliven som utsöndras i oljan av myggorna vid rumstemperatur. Efter 45 till 60 minuter, placera pipettspetsarna i 1,5 milliliter rör innehållande 200 mikroliter virusspädningsmedium. Centrifugera rören vid 5 000 g i fem minuter vid fyra grader Celsius för att utvisa saliv i rören.Förvara de salivinnehållande rören vid 80 grader Celsius för efterföljande bestämning av överföringshastigheter. Efter salivuppsamling, dissekera de infekterade kvinnliga myggorna. Skär myggens huvuden med pincett och placera varje huvud i ett enskilt rör innehållande 200 mikroliter RPMI 1640-medium.Ta tag i bröstkorgen med en pincett. Ta sedan tag i det näst sista segmentet av buken med en annan pincett och dra ut tarmen. Rengör tarmen för eventuell herrelös vävnad och organ.Tvätta tarmen med PBS och placera varje tarm i ett individuellt rör som innehåller 200 mikroliter RPMI 1640-medium. Förvara dessa rör vid 80 grader Celsius för efterföljande bestämning av virusspridning och infektionshastighet. I denna representativa analys bestämdes virala RNA i tarmen, huvudet och saliven hos kvinnliga myggor 10 dagar efter infektion.Virustitern av Ebinur Lake-virus i tarmar, huvuden och saliv hos de intratorakiskt inokulerade myggorna var högre än i de oralinfekterade myggorna. Infektions- och spridningsgraden för de intratorakalt inokulerade myggorna var 100% och för de oralt infekterade myggorna befanns vara 70% respektive 38,1%. Överföringshastigheten för de intratorakiskt inokulerade myggorna nådde upp till 90%men för de oralinfekterade myggorna var endast 4,8%De engorged kvinnliga myggorna plockades för att upprätthålla konsistens, eftersom utfodringsmängden påverkar virusinnehållet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

En analytisk verktygslåda för omfattande biokemiska, struktur-och transkriptom Utvärdering av Oral Biofilmer medieras av mutans streptokocker

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detektion av infektiösa virus från Field-in Myggor av vero-cellodling analys

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Odling Mikroglia från neonatal och vuxna centrala nervsystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D- och 3D-kromosommålning i malariamyggor

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvecklingen av lyofiliserad Loop-medie Isothermal amplifieringsreagenserna för detektion av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mätning influensaneuraminidas Inhibition Antikroppstitrar genom enzymkopplad lektin analys

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Identifiering av låg exemplar nummer integrerat virus-DNA bildas av In Vitro hepatit B-infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modellering tuberkulos i Mycobacterium marinum infekterade vuxna zebrafiskar

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...