Name: experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Bu çalışma Wuhan Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (2018201261638501) tarafından desteklenmiştir.

1. Virüs ve sivrisineklerin hazırlanması
<ol><li>Virüslerin hazırlanması NOT: Tüm süreçler biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Kullanılan biyogüvenlik kontaminasyonu seviyesi, patojenin risk değerlendirmesi ve ülkelere ve bölgelere özgü düzenlemeler tarafından belirlenmelidir. İşlem bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.<ol><li>1 x 106 C6/36 hücrelerini bir T75 kültür şişesine aşılayın. Şişeyi,% 10 ısıyla inaktive ...

<ol>
	<li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle.">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li><li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dengue+to+Zika:+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses.">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li><li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+update+of+phylum+Negarnaviricota+(Riboviria:+Orthornavirae),+including+the+large+orders+Bunyavirales+and+Mononegavirales.">Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales.</a> Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).</li><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika:+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus.">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+DENV-2+Among+Aedes+albopictus+(Diptera:+Culicidae)+Populations+in+China.">Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).</li><li>Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity.">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li><li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Global+Status+and+Preventive+Strategies.">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li><li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus:+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics.">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li><li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+Past,+Present,+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios.">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change:+seizing+the+window+of+opportunity.">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li><li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses.">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 188 (2020).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Innate+Immunity.">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li><li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes.">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border.">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays:+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems.">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Zika+virus+by+SYBR+green+one-step+real-time+RT-PCR.">Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR.</a> Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+and+transcriptional+response+of+Aedes+aegypti+for+Ebinur+Lake+virus,+a+newly+mosquito-borne+orthobunyavirus.">Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Britton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-acquired+dengue+virus+infection--a+case+report.">Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).</li><li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara,+Jalisco,+Mexico+for+Zika+virus.">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).</li></ol>

Bu yöntemin amacı, oral beslenme ve intratorasik aşılama yoluyla vektör yeterliliğini değerlendirerek sivrisinek kaynaklı bir virüsün kapsamlı bir risk değerlendirmesini sağlamaktır.
Oral beslenme deneyinde, engorged-sivrisineklerin toplanması ve operatörler için ciddi bir risk oluşturan yeni bir kaba aktarılması gerekir. Bunun nedeni, enfekte olmamış sivrisinekler de dahil olmak üzere herhangi bir sivrisineğin bir enfeksiyon kaynağı olabileceğidir1...

Heterojen bir RNA virüsü grubu olan sivrisinek kaynaklı virüsler (MBV'ler), sivrisinek vektörlerinde kalabilir ve daha sonra omurgalı konakçılara yayılabilir1. Klinik olarak önemli MBV'ler büyük ölçüde Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae ve Peribunyavividae 2,3 olmak üzere dört virüs ailesine dağılmıştır. Son yıllarda, bu virüsler tüm dünyada rapor edilmiş ve halk sağlığı sorunlarına neden olmuştur. En iyi bilinen MBV'lerden biri olan Dang virüsü (DENV), son 20 yılda 100'den fazla ülkede en yaygın olarak ortaya çıkan veya yeniden ortaya çıkan arbovirüs haline gelmiştir4. İç kesimlerde Zika virüsünün (ZIKV) keşfinden bu yana, kıtanın hemen hemen tüm tropikal ve subtropikal ülkeleri ve bölgeleri insan ZIKV enfeksiyonlarını bildirmiştir5. Virüs bulaşma riskini değerlendirmek için son yıllarda yapılan çok sayıda çalışma, bu virüsler için sivrisinek vektör yeterliliğine odaklanmıştır 6,7. Sonuç olarak, vektör kaynaklı hastalıkları etkili bir şekilde önlemek ve kontrol etmek kritik öneme sahiptir.
Laboratuvarda en kolay yetiştirilen sivrisineklerden biri olan Aedes aegypti (Ae. aegypti), DENV, ZIKV, Chikungunya virüsü (CHIKV) ve sarı humma virüsünün (YFV)8 önemli bir vektörüdür. Uzun bir süre boyunca, Ae. aegypti sadece Afrika kıtasında ve Güneydoğu Asya'da bulundu, ancak son yıllarda neredeyse tüm kıtaları sömürgeleştirdi9. Dahası, Ae. aegypti'nin küresel bolluğu sürekli olarak büyümekte ve yüzyılın sonuna kadar tahminen% 20'lik bir artış göstermektedir10. Çin'de 2004'ten 2009'a kadar, daha yüksek günlük sıcaklıklar nedeniyle DENV için Ae ae. aegypti vektör yeterliliğinde belirgin bir artış oldu11. Ae. aegypti'nin patojenik vektör olarak statüsü Çin'de önemli ölçüde artmıştır. Sonuç olarak, bu zorlukları ele almak için, Ae. aegypti'nin virüsleri iletme vektör yeterliliğini araştırmak gerekir.
Bir hematofagus eklembacaklı olarak, dişi sivrisinek omurgalı bir konağın derisini deler ve kanla beslenir. Sivrisinekler zaman zaman virüs bulaşmış konakçılardan virüs alır ve daha sonra virüsleri yeni bir konakçıya aktarır. Bu nedenle, vektör yeterliliğini belirlemek için, sivrisinekler laboratuvar ortamında bir besleme sistemi aracılığıyla arbovirüsler içeren yapay bir kan unu ile beslenir12. Bireysel sivrisinekler, enfeksiyondan birkaç gün sonra kafalara, vücutlara ve tükürük salgılarına ayrılır. Virüs enfeksiyonunu, yayılımını ve bulaşma oranlarını ölçmek için, virüs titreleri kantitatif ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) veya plak testi ile tespit edilmiştir. Bununla birlikte, tüm sivrisinekler midgut enfeksiyonları ve kan beslemeyi takiben bir virüsü bir sonraki konakçıya aktarma kapasitesi geliştirmez. Patojenlerin vücuda nüfuz etmesini önleyen ve doğuştan gelen bağışıklıklarında hayati bir rol oynayan sivrisineklerin fizyolojik bariyerleri ile bağlantılıdır13. Midgut bariyerleri, özellikle midgut enfeksiyonu bariyeri (MIB) ve midgut kaçış bariyeri (MEB), virüsün vektörü sistemik olarak enfekte edip edemeyeceğini ve yayıldığı etkinliği etkiler. Tükürük bezi enfeksiyonu ve kaçış bariyerleri de sergileyen tükürük bezleri gibi diğer dokuların enfeksiyonlarının analizini engeller13,14. Vektördeki midgutların ve tükürük bezlerinin enfeksiyonunu daha iyi karakterize etmek için, Ae'de arbovirüsün oral beslenmesi ve intratorasik aşılaması için ayrıntılı bir protokol. aegypti burada sunulmuştur. Bu protokol, Aedes spp.'deki DENV ve ZIKV enfeksiyonu gibi çeşitli sivrisinek vektörlerinde ek arbovirüs enfeksiyonlarına uygulanabilir ve uygulanabilir bir prosedür olduğu kanıtlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rockefeller strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system&#160;</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells&#160;</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide spray gun&#160;</td>
			<td>wuhan Yihong</td>
			<td>YHDFPCO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac&#160;</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96 Touch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Wuhan Baiqiandu</td>
			<td>B0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Hushi</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16908-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>HPP750T7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>NMG0966-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mesh cages (30 x 30 x 30 cm)</td>
			<td>Huayu</td>
			<td>HY-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>17851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mice feedstuff powder&#160;</td>
			<td>BESSN</td>
			<td>BS018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>PUL-1000&#160;is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito net meshes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR096A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>151140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cupes (7 oz)&#160;</td>
			<td>Hubei Duoanduo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cups (24 oz)&#160;</td>
			<td>Anhui shangji</td>
			<td>PET32-Tub-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable droppers</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-XG-O3L-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Glass Capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL )</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow dishes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile defibrillated horse blood</td>
			<td>Wuhan Purity Biotechnology</td>
			<td>CDHXB413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The artificial mosquito feeding system&#160;</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>&#160;stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The ice plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine&#160;</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental viral infection in adult mosquitoes by oral feeding and microinjection

Omurgalılar için bulaşıcı patojenler olan sivrisinek kaynaklı virüsler (MBV'ler), birçok sivrisinek türü tarafından yayılmakta ve halk sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Yutulduktan sonra, virüsler potansiyel olarak tükürük bezlerine yayılabilecekleri hemolenfe ulaşmak için sivrisinek midgut bariyerinin üstesinden gelmelidir. Bir sivrisinek ısırdığında, bu virüsler yeni omurgalı konakçılara yayılır. Benzer şekilde, sivrisinek farklı virüsleri alabilir. Genel olarak, virüslerin sadece küçük bir kısmı tükürük bezlerine bağırsak yoluyla girebilir. Bu virüslerin bezlere bulaşma etkinliği, farklı sivrisinek türlerinde bulunan iki fiziksel bariyerden etkilenir: midgut bariyerleri ve tükürük bezleri bariyerleri. Bu protokol, Aedes aegypti'nin tükürük bezlerinde oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon enfeksiyonunu takiben virüs tespiti için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, bağırsakların ve / veya tükürük bezlerinin viral yayılmayı engelleyip engellemediğini belirlemek, Aedes aegypti tarafından iletilen MBV'lerin risk değerlendirmelerine yardımcı olabilir.

Enfekte sivrisineklerde yapay kan besleme (viral son titre 6.4 x 106 PFU/mL idi) ve intratorasik enjeksiyon (viral doz 340 PFU idi) yoluyla EBIV dağılımını incelemek için, enfeksiyondan 10 gün sonra sivrisineklerin tükürük, kafa ve bağırsaklarındaki viral RNA'lar (dpi) belirlendi.
Ae. aegypti için, intratorasik olarak aşılanmış dişi sivrisineklerin bağırsaklarındaki, kafalarındaki ve tükürüklerindeki EBIV virüs titresi, oral enfekte dişi...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection at JoVE.com

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon enfeksiyonunu içeren bu metodoloji, midgut ve / veya tükürük bezi bariyerlerinin arbovirüs enfeksiyonu üzerindeki etkisini etkili bir şekilde değerlendirebilir.

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Bu protokol, bağırsakların ve tiroid bezlerinin viral yayılmayı engelleyip engellemediğini belirleyebilir ve Aedes aegypti tarafından bulaşan sivrisinek kaynaklı virüslerin risk değerlendirmelerine yardımcı olabilir. Protokolümüz, arbovirüsün vektör yeterliliğini etkili bir şekilde değerlendirebilen oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon olmak üzere iki enfeksiyon yöntemini içeriyordu. Bu protokol, Aedes'te Dang virüsü ve Zika virüsü enfeksiyonu gibi çeşitli sivrisinek vektörlerinde ek arbovirüs enfeksiyonlarına uygulanabilir ve uygulanabilir bir prosedür olduğu kanıtlanabilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Fei Wang olacak. Yapay sivrisinek besleme sistemini kullanarak yapay besleme yapmak için, kollajen membranlarını uygun boyuta kesin ve O-halkalarla rezervuarlara sabitleyin. Rezervuarlara üç mililitre virüs-kan karışımı ekleyin ve sızıntıları önlemek için rezervuarları plastik tapalar kullanarak kapatın.Sivrisinek içeren plastik bardakları torpido gözüne koyun. Sızdırmaz rezervuarları FU1 besleyiciye vidalayın ve bir kabın üzerine bir rezervuar koyun. Güç ünitesini açın ve sivrisinekleri bir saat boyunca besleyin.Beslendikten sonra, sivrisinekleri bayılıncaya kadar birkaç saniye buzla uyuşturun. Anestezi altındaki sivrisinekleri buz üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına dökün ve kapağı hızlıca örtün. Forsepsli dişi sivrisinekleri toplayın ve fincan başına 50 dişi sivrisinek ile yeni plastik kaplara aktarın.Bardağı kesilmiş bir cibinlik ağı ile sarın ve ortasında bir delik bulunan bir kapakla örtün. Süngeri küçük parçalara ayırın ve bardaklara koyun. Plastik tek kullanımlık bir damlalık kullanarak sünger üzerine% 8 glikoz çözeltisi ekleyin.Dişi sivrisinek içeren bardakları inkübatöre 27 santigrat derecede, 10 gün boyunca% 80 nemde yerleştirin. Her 72 saatte bir yeni bir glikoza doymuş sünger değiştirin. İntratorasik aşılama için, metin makalesinde açıklandığı gibi dişi sivrisinekleri hazırlayın.Enfeksiyöz virüs seyreltmesini hazırlamak için, virüs stokunu 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözün. Virüs stoğunu, 100 ila 500 plak oluşturan birim virüs içeren 100 nanolitrelik bir virüs seyreltmesinde,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren RPMI 1640 ortamı ile seyreltin. Virüs seyreltmesini buzun üzerine yerleştirin.Daha sonra, mikroenjeksiyon iğnelerini, iğne çektirme programındaki parametreler ısı indeksi olarak 450, g cinsinden kuvvet olarak 110, milimetre cinsinden mesafe bire ve saniye cinsinden sıfıra kadar gecikme olarak ayarlanmış bir Çektirme 1000 kullanarak hazırlayın. Çekilen bir iğnenin ucunu 16x büyütmede diseksiyon mikroskobu altında cımbızla kesin. İğneyi tek kullanımlık steril bir şırıngadan mineral yağ ile doldurun.Makinedeki talimatları izleyerek iğneyi enjektöre takın. İğneyi dikkatlice bulaşıcı bir virüs seyreltmesi içeren bir tüpe yerleştirin. Ardından, iğneye yaklaşık dört mikrolitre virüs seyreltmesini doldurmak için Doldur düğmesine basın.İğne doldurulduktan sonra, iğneye dokunmayın veya zarar vermeyin. Cımbızla yaklaşık 50 dişi anestezi yapılmış sivrisinek seçin ve bir buz tabağına koyun. Plakayı enjektörün altına yerleştirin ve iğneyi diseksiyon mikroskobu altında sivrisineğin göğüs boşluğuna yerleştirin.Enjeksiyon hacmini 100 nanolitreye ve hızı saniyede 50 nanolitreye ayarlayın. Virüs çözeltisinin sivrisinek içine akmasına izin vermek için Enjekte düğmesine basın. Başarılı enjeksiyon üzerine, karın hafifçe şişer.Enfekte olmuş sivrisineği buzun üzerine yerleştirilmiş yeni bir plastik kaba koyun. Enfekte sivrisineklerin sayısı yeterli olduğunda, bardağı kesilmiş bir cibinlik ağı ile sarın ve kapakla örtün. Enfekte dişi sivrisineklerden tükürük toplamak için, anestezi altındaki sivrisinekleri buz üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına dökün ve kapağı hızla kapatın.Daldırma yağı ile doldurulmuş 10 mikrolitrelik pipet uçlarını kauçuk çamurun üzerine yan yana yerleştirin. Dişi sivrisinekleri cımbızla seçin ve bir buz tabağına koyun. Bacaklarını ve kanatlarını cımbızla çıkarın.Oda sıcaklığında sivrisinekler tarafından yağa salgılanan tükürüğü toplamak için her pipet ucuna bir sivrisinek ağız kısmını yerleştirin. 45 ila 60 dakika sonra, pipet uçlarını 200 mikrolitre virüs seyreltici ortam içeren 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin. Tükürüğü tüplere atmak için tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 5.000 g'da santrifüj edin.İletim hızlarının daha sonra belirlenmesi için tükürük içeren tüpleri 80 santigrat derecede saklayın. Tükürük toplandıktan sonra, enfekte olmuş dişi sivrisinekleri disseke edin. Cımbız kullanarak, sivrisineklerin kafalarını kesin ve her kafayı 200 mikrolitre RPMI 1640 ortamı içeren ayrı bir tüpe yerleştirin.Toraksı bir cımbızla alın. Ardından, karnın sondan bir önceki bölümünü başka bir cımbızla tutun ve bağırsağı dışarı çekin. Herhangi bir başıboş doku ve organ için bağırsağı temizleyin.Bağırsağı PBS ile yıkayın ve her bir bağırsağı 200 mikrolitre RPMI 1640 ortamı içeren ayrı bir tüpe yerleştirin. Virüsün yayılma ve enfeksiyon hızının daha sonra belirlenmesi için bu tüpleri 80 santigrat derecede saklayın. Bu temsili analizde, enfeksiyondan 10 gün sonra dişi sivrisineklerin bağırsak, baş ve tükürüklerindeki viral RNA'lar belirlenmiştir.İntratorasik olarak aşılanmış sivrisineklerin bağırsaklarındaki, kafalarındaki ve tükürüklerindeki Ebinur Gölü virüsünün virüs titresi, oral enfekte sivrisineklerden daha yüksekti. İntratorasik olarak aşılanmış sivrisineklerde enfeksiyon ve yayılma oranı %100, oral infeksiyon sivrisineklerde ise sırasıyla %70 ve %38,1 olarak bulundu. İntratorasik olarak aşılanmış sivrisinekler için bulaşma oranı% 90'a kadar ulaştı, ancak oral enfekte sivrisinekler için sadece% 4.8 idiBeslenme miktarı viral içeriği etkilediğinden, tutarlılığı korumak için engorged dişi sivrisinekler seçildi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Algılama düşük kopya sayısı Vitro hepatit B enfeksiyonu tarafından kurulan entegre Viral DNA

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...