Name: isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

129S4 mus var en gave fra Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine på Mount Sinai. Dette arbejde blev støttet med midler fra National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 og K02 DE028572 til K.A.F., F31 DE029976 til M.A.R. og F31 DE029364 til B.J.C.D.

Alle procedurer, der involverer dyr, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Colorado Anschutz Medical Campus og udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og regler. Hunmus fra 129S4 ved 1,5-6 måneders alderen og ophuset ved en subtermoneutral temperatur på 21-23 °C blev anvendt til embryohøst. En skematisk arbejdsgang for protokollen er repræsenteret i figur 1. Se tabellen over materialer for detaljer v...

Protokollen beskrevet her giver forskere mulighed for at undersøge kritiske fosforyleringsafhængige signalhændelser under kraniofacial udvikling på en robust og reproducerbar måde. Der er flere kritiske trin i denne protokol, der sikrer korrekt indsamling af data og analyse af resultater. Uanset om man isolerer phosphoproteiner fra musens ansigtsprocesser og / eller dyrkede palatale mesenchymceller, er det bydende nødvendigt at bevæge sig hurtigt og effektivt, samtidig med at alle reagenser og materialer holdes p?...

Pattedyrs kraniofaciale udvikling er en kompleks morfologisk proces, hvor flere cellepopulationer koordinerer for at generere det frontonasale skelet. I musen begynder denne proces på embryonal dag (E) 9,5 med dannelsen af den frontonasale fremtrædende plads og par af maksillære og mandibulære processer, der hver især indeholder post-migrerende kraniale neurale kamceller. De laterale og mediale nasale processer stammer fra den frontonasale fremtrædende plads med udseendet af næsegravene og til sidst smelter sammen for at danne næseborene. Endvidere smelter de mediale nasale processer og maksillære processer sammen for at generere overlæben. Samtidig indledes palatogenese med dannelsen af forskellige udvækst - de sekundære palatale hylder - fra den orale side af de maksillære processer ved E11.5. Over tid vokser de palatale hylder nedad på hver side af tungen, hæver sig til en modsat position over tungen og smelter til sidst sammen ved midterlinjen for at danne en kontinuerlig gane, der adskiller næse- og mundhulen med E16.51.
Disse morfologiske ændringer gennem kraniofacial udvikling initieres og opretholdes gennem forskellige signalinteraktioner, som ofte inkluderer proteinfosforylering af kinaser. For eksempel er cellemembranreceptorer, såsom underfamilier af transformerende vækstfaktor (TGF)-β receptorer, herunder knoglemorfogenetiske proteinreceptorer (BMPR'er) og forskellige receptor tyrosinkinase (RTK) familier, autophosphoryleret ved ligandbinding og aktivering i kraniale neurale kamceller 2,3,4 . Derudover bliver den G-proteinkoblede transmembranreceptor Smoothened fosforyleret i kraniale neurale kamceller og kraniofacial ektoderm nedstrøms for Sonic hedgehog (SHH) ligandbinding til Patched1-receptoren, hvilket resulterer i udjævnet akkumulering ved ciliarymembranen og SHH-vejaktivering5. Sådanne ligandreceptorinteraktioner kan forekomme gennem autokrin, parakrin og / eller juxtacrin signalering i kraniofaciale sammenhænge. For eksempel er BMP6 kendt for at signalere på en autokrin måde under chondrocytdifferentiering6, mens fibroblastvækstfaktor (FGF) 8 udtrykkes i svælgbueektoderm og binder til medlemmer af FGF-familien af RTK'er udtrykt i pharyngeal arch mesenchymen på en parakrin måde for at indlede mønster og udvækst af svælgbuerne7, 8,9,10. Desuden aktiveres Notch-signalering i både chondrocytter og osteoblaster under kraniofacial skeletudvikling gennem juxtacrinsignalering, når transmembrandelta og / eller takkede ligander binder til transmembran Notch-receptorer på naboceller, som efterfølgende spaltes og fosforyleres11. Der er dog andre ligand- og receptorpar, der er vigtige for kraniofacial udvikling, der har fleksibiliteten til at fungere i både autokrin og parakrin signalering. Som et eksempel, under murine tandmorfogenese, blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF)-AA ligand er blevet påvist at signalere på en autokrin måde for at aktivere RTK PDGFRα i emaljeorganepitelet12. I modsætning hertil udtrykkes transkripter, der koder for liganderne PDGF-AA og PDGF-CC, i murine-ansigtsprocesser under midten af drægtigheden i den kraniofaciale ektoderm, mens PDGFRα-receptoren udtrykkes i det underliggende kraniale neurale kamafledte mesenchym, hvilket resulterer i parakrinsignalering 13,14,15,16,17 . Uanset signalmekanismen resulterer disse receptorphosphoryleringshændelser ofte i rekruttering af adaptorproteiner og / eller signalmolekyler, som ofte bliver fosforyleret selv for at initiere intracellulære kinasekaskader såsom den mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) vej18,19.
De terminale intracellulære effektorer af disse kaskader kan derefter fosforylere en række substrater, såsom transkriptionsfaktorer, RNA-bindende, cytoskeletale og ekstracellulære matrixproteiner. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 og Sox926 er blandt transkriptionsfaktorerne fosforyleret i forbindelse med kraniofacial udvikling. Denne post-translationelle modifikation (PTM) kan direkte påvirke modtageligheden for alternative PTM'er, dimerisering, stabilitet, spaltning og / eller DNA-bindende affinitet, blandt andre aktiviteter 20,21,25,26. Derudover fosforyleres det RNA-bindende protein Srsf3 i forbindelse med kraniofacial udvikling, hvilket fører til dets nukleare translokation27. Generelt har fosforylering af RNA-bindende proteiner vist sig at påvirke deres subcellulære lokalisering, protein-protein-interaktioner, RNA-binding og / eller sekvensseksealitet28. Desuden kan fosforylering af actomyosin føre til cytoskeletale omlejringer gennem hele kraniofacial udvikling29,30, og fosforylering af ekstracellulære matrixproteiner, såsom små integrinbindende ligand N-bundne glycoproteiner, bidrager til biomineralisering under skeletudvikling31. Gennem ovenstående og talrige andre eksempler er det tydeligt, at der er brede implikationer for proteinfosforylering under kraniofacial udvikling. Ved at tilføje et yderligere reguleringsniveau moduleres proteinphosphorylering yderligere af fosfataser, som modvirker kinaser ved at fjerne fosfatgrupper.
Disse fosforyleringshændelser på både receptor- og effektormolekyleniveauerne er kritiske for udbredelsen af signalveje og resulterer i sidste ende i ændringer i genekspression i kernen, der driver specifikke celleaktiviteter, såsom migration, proliferation, overlevelse og differentiering, hvilket resulterer i korrekt dannelse af pattedyrets ansigt. I betragtning af kontekstskelheden af proteininteraktioner med kinaser og fosfataser, de resulterende ændringer i PTM'er og deres virkninger på celleaktivitet er det afgørende, at disse parametre undersøges i en fysiologisk relevant indstilling for at få en fuldstændig forståelse af fosforyleringshændelsernes bidrag til kraniofacial udvikling. Her gives eksempler på to sammenhænge, hvor man kan studere fosforylering af proteiner og dermed aktivering af signalveje under pattedyrs kraniofaciale udvikling: musens ansigtsprocesser, især E11.5 maksillære processer, og dyrkede museembryale palatale mesenchymceller afledt af E13.5 sekundære palatale hylder - både primære32 og udødeliggjorte33 . Ved E11.5 er de maksillære processer i færd med at smelte sammen med de laterale og mediale nasale processer1 og derved repræsentere et kritisk tidspunkt under musens kraniofaciale udvikling. Endvidere blev maksillære processer og celler afledt af de palatale hylder valgt her, fordi sidstnævnte strukturer er derivater af førstnævnte, hvilket giver forskere mulighed for at forhøre proteinphosphorylering in vivo og in vitro i beslægtede sammenhænge. Denne protokol gælder dog også for alternative ansigtsprocesser og udviklingstidspunkter.
Et kritisk problem ved at studere fosforylerede proteiner er, at de let dephosphoryleres under proteinisolering af rigelige miljøphosphataser. For at overvinde denne barriere diskuteres tilpasninger og modifikationer til standard laboratoriemetoder, der muliggør isolering af fosforylerede proteiner. Derudover findes der bedste praksis for korrekt analyse og kvantificering af fosforylerede proteiner. Disse teknikker, især i kombination med farmakologiske hæmmere og/eller murine genetiske modeller, kan bruges til at få større indsigt i dynamikken og rollerne af forskellige signalveje, der er aktive under kraniofacial udvikling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block for mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>chemiluminescence imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, air jacket</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board, 11 x 13 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09 002 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95003001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z604062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for SDS-PAGE</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular ice pan, maxi 9 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350649020000000</td>
			<td>dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11 676 341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02 215 414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9358182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 6 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, polypropylene, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 9&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pouches, transparent, polyethylene lining</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small latex bulb, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 25 mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with luer tip, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot cassette opening lever</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4560000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann 3MM chr chromatography paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5422-25G</td>
			<td>stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC403140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>stock concentration 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>E7</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI32106</td>
			<td>low picogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-302B</td>
			<td>low femtogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610772</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2705HC</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 6N (certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56-500</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal Ca - 630 non-ionic detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19859650</td>
			<td>Nonidet P-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>stock concentration 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9102S</td>
			<td>1:1,000; anti-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB recombinant ligand, rat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>520BB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3169S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>stock concentration 100 U/mL, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC215740100</td>
			<td>PMSF; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9101S</td>
			<td>1:1,000, anti-phospho-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PDGF Receptor &#945; /PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3170S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution, 10%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (crystalline/biological,certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205330500</td>
			<td>Na3VO4; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610771</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioWorld</td>
			<td>21560033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot molecular weight marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female 129S4 mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis

Pattedyrs kraniofaciale udvikling er en kompleks morfologisk proces, hvor flere cellepopulationer koordinerer for at generere det frontonasale skelet. Disse morfologiske ændringer initieres og opretholdes gennem forskellige signalinteraktioner, som ofte omfatter proteinfosforylering af kinaser. Her gives to eksempler på fysiologisk relevante sammenhænge, hvor man kan studere fosforylering af proteiner under pattedyrs kraniofaciale udvikling: musens ansigtsprocesser, især E11.5 maksillære processer, og dyrkede museembryonale palatale mesenchymceller afledt af E13.5 sekundære palatale hylder. For at overvinde den fælles barriere for dephosphorylering under proteinisolering diskuteres tilpasninger og modifikationer af standard laboratoriemetoder, der muliggør isolering af phosphoproteiner. Derudover gives bedste praksis for korrekt analyse og kvantificering af phosphoproteiner efter vestlig blotting af helcelleproteinlysater. Disse teknikker, især i kombination med farmakologiske hæmmere og /eller murine genetiske modeller, kan bruges til at få større indsigt i dynamikken og rollerne af forskellige phosphoproteiner, der er aktive under kraniofacial udvikling.

Når man forsøger at karakterisere fosforylering af proteiner isoleret fra musens ansigtsprocesser og/eller dyrkede palatale mesenchymceller, vil de repræsentative resultater ideelt set afsløre et tydeligt, reproducerbart bånd efter vestlig blotting med et anti-phosphoproteinantistof, der løber i eller nær højden af det tilsvarende samlede proteinbånd (figur 3 ). Men hvis der opstår omfattende fosforylering af proteinet, kan der være en lille opadgående forskydning af phosphoprote...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Protokollen præsenterer en metode til isolering af helcelleproteinlysater fra dissekerede museembryo-ansigtsprocesser eller dyrkede museembryonale palatale mesenchymceller og udfører efterfølgende western blotting for at vurdere fosforylerede proteinniveauer.

Isolering af helcelleproteinlysater fra musens ansigtsprocesser og dyrkede palatale mesenchymceller til fosfoproteinanalyse

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Denne protokol kan bruges til at få større indsigt i dynamikken og rollerne af fosfoproteiner, der er aktive under pattedyrs kraniofaciale udvikling. Denne protokol overvinder den fælles barriere for dephosphorylation under proteinisolering fra to fysiologisk relevante kontekst, muse ansigtsbehandlingsprocesser og dyrkede museembrynale palasenchymeceller. Det er bydende nødvendigt at bevæge sig hurtigt, mens alle reagenser og materialer opbevares på is og at anvende fosfatasehæmmere i alle lysisbuffere for at opretholde integriteten af phosphorylerede proteiner.Til at begynde med skal du lægge musekroppen på et dissekeringsbræt med den ventrale side opad og sprøjte museunderlivet med 70% ethanol. Åbn derefter bukhulen ved at klemme og løfte huden anterior til vaginalåbningen med lige Semken-tang. Skær derefter den løftede hud i underliggende lag med lige knivkirurgisk saks i en 45 graders vinkel på hver side for at generere en V-form, der strækker sig til hver lateral overflade omtrent halvvejs mellem de fire lemmer og bagbenene.Brug Semken-tangen til at gribe et af livmoderhornene og skære under ovidukten og over livmoderhalsen med kirurgisk saks. For at muliggøre fuldstændig fjernelse af livmoderhornet skal du skære mesometrium væk og derefter overføre det dissekerede livmoderhorn til 10 ml histologi PBS i en 10 centimeter petriskål. På samme måde skal du fjerne det andet livmoderhorn på den modsatte side af bukhulen.Læg derefter den 10 centimeter lange petriskål med begge livmoderhorn på is. Under et dissekerende stereomikroskop dissekeres hvert embryo forsigtigt fra livmoderhornene med Dumont 5 fine tang. Træk derefter langsomt myometrium, løvfældende og chorion væk.Riv derefter og fjern den relativt gennemsigtige amnion, der omgiver embryoet, og skær navlestrengen, der forbinder embryoet med moderkagen. Overfør derefter hvert dissekeret embryo til 2,5 ml histologi PBS i en individuel brønd af en 12-brønd cellekulturplade på is ved hjælp af et skåret plastoverførselsrør. Forbered tre 10 centimeter petriskåle indeholdende 10 ml histologi PBS og opbevar dem på is til brug i rotation mellem embryoner.Overfør derefter et embryo fra en individuel brønd i 12-brønds cellekulturpladen til en af de 10 centimeter petriskåle med histologi PBS på is ved hjælp af en skåret plastoverførselspipette. Under dissekeringsmikroskopet adskilles hver maksillær proces fra ansigtet ved hjælp af de fine tang ved først at lave et snit på den forreste side af en maksillær proces langs den naturlige indrykning, der adskiller den laterale nasale proces i den maksillære proces. Skær derefter den bageste side af den maksillære proces langs den naturlige indrykning, der adskiller den maksillære proces og mandibulærprocessen.Adskil derefter den maksillære proces fuldstændigt ved at foretage et lodret snit fra de forreste til bageste sider af den maksillære proces på øjensiden af den maksillære proces, hvor de naturlige fordybninger, der henvises til ovenfor, slutter. Brug en ni tommer Pasteur-pipette med en to milliliter lille latexpære til at overføre det dissekerede par maksillære processer i en lille dråbe på ca. 30 mikroliter histologi PBS til en mærket 35 millimeter petriskål på is. Overfør derefter parret af maksillære procesvæv til et mærket 1,5 ml mikrocentrifugerør på is ved hjælp af Pasteur-pipetten, hvilket minimerer overførslen af histologi PBS.Fjern endvidere overskydende histologi PBS i 1,5 ml mikrocentrifugerøret med Pasteur-pipetten. Tilsæt 0,1 ml iskold NP40 lysisbuffer med protease- og fosfatasehæmmere tilsat umiddelbart før brug på is. Pipetter derefter op og ned 10 gange med en 200 mikroliter PIPETMAN.Derefter hvirvel i 10 sekunder, og pipette derefter op og ned 10 gange med en 200 mikroliter PIPETMAN, mens du undgår generering af bobler. Inkuber ved fire grader Celsius i to timer, mens du roterer ende-over-ende ved hjælp af en 1,5 milliliter eller to milliliter padle med en rørrevolver. Centrifuger derefter prøverne ved 13.500 x g i 20 minutter ved fire grader Celsius og saml supernatanten til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør på is med en 200 ml PIPETMAN.Først aspireres mediet fra musens embryonale palatale mesenchymeceller ved hjælp af en 5,75 tommer Pasteur-pipette fastgjort til et vakuumsystem. Vask derefter cellerne to gange med iskold vævskultur PBS, og vip pladen til siden under den sidste vask for at sikre, at al vævskultur PBS aspireres. Derefter tilsættes iskold NP40 lysisbuffer med protease- og fosfatasehæmmere tilsat umiddelbart før brug på is for at lyse cellerne.Inkuber pladen på is i fem minutter med rotation ca. hvert minut for at sikre fuldstændig dækning af pladen. Skrab derefter cellerne af pladen ved hjælp af en forkølet celleløfter, og overfør cellesuspensionen til et forkølet 1,5 ml mikrocentrifugerør på is. Derefter inkuberes cellesuspensionen ved fire grader Celsius i 30 minutter, mens du roterer ende-over-ende ved hjælp af en 1,5 milliliter eller to milliliter padle med en rørrevolver.Centrifuger derefter prøverne ved 13.500 x g i 20 minutter ved fire grader Celsius og saml supernatanten til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør på is med en 200 ml PIPETMAN. Western blot-analyse af hele cellelysater fra udødeliggjorte museembryonale palatale mesenchymeceller efter stimulering med PDFG-B-ligand fra 2 til 15 minutter afslørede forskellige reproducerbare bånd for phosphoproteiner, der løber ved eller nær højden af det tilsvarende samlede proteinbånd. En stigning i phosphoproteinbåndintensiteter blev observeret ved behandling med en vækstfaktor sammenlignet med ubehandlede celler, mens totale proteinbåndintensiteter var relativt ens mellem prøver.Denne protokol kan bruges til at undersøge, hvordan forstyrrelser og phosphorylering direkte påvirker intercellulær signalering, genekspression og cellulær aktivitet i kraniofaciale sammenhænge.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektiv Isolering af Functional Islets fra Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolering og analysere celler i bugspytkirtlen mesenchym ved flowcytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Hele-celle patch-clamp optagelser af isolerede primære epitelceller fra epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus infektion af kulturperler menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller til andre analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount immunofluorescens og follikel kvantificering af kulturperler mus æggestokke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolering og farvning af mus hud keratinocytter for celle cyklus specifik analyse af cellulært protein ekspression ved Massecytometri

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse af hjerte kammer udvikling under musen embryogenese bruger hele bjerget epifluorescensmikroskop

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Forberedelse af små RNA-biblioteker til sekventering fra tidlige museembryoner

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...