Name: isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

129S4 souris étaient un cadeau du Dr Philippe Soriano, Icahn School of Medicine à Mount Sinai. Ce travail a été soutenu par des fonds des National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 et K02 DE028572 à K.A.F., F31 DE029976 à M.A.R. et F31 DE029364 à B.J.C.D.

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du campus médical Anschutz de l’Université du Colorado et effectuées conformément aux directives et réglementations de l’établissement. Des souris femelles 129S4 âgées de 1,5 à 6 mois et logées à une température sous-thermoneutre de 21 à 23 °C ont été utilisées pour les récoltes d’embryons. Un flux de travail schématique du protocole est représenté à <strong class="xf...

Le protocole décrit ici permet aux chercheurs de sonder les événements critiques de signalisation dépendant de la phosphorylation au cours du développement craniofacial de manière robuste et reproductible. Ce protocole comporte plusieurs étapes essentielles qui garantissent une collecte appropriée des données et une analyse des résultats. Qu’il s’agisse d’isoler des phosphoprotéines des processus faciaux de souris et/ou de cultiver des cellules de mésenchyme palatal, il est impératif de se déplacer ra...

Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Chez la souris, ce processus commence au jour embryonnaire (E) 9,5 avec la formation de la proéminence frontonasale et de paires de processus maxillaires et mandibulaires, chacun contenant des cellules de la crête neurale crânienne post-migratoire. Les processus nasaux latéraux et médiaux proviennent de la proéminence frontonasale avec l’apparition des fosses nasales et finissent par fusionner pour former les narines. De plus, les processus nasaux médiaux et les processus maxillaires fusionnent pour générer la lèvre supérieure. Parallèlement, la palatogenèse est initiée par la formation d’excroissances distinctes - les plateaux palataux secondaires - du côté oral des processus maxillaires à E11.5. Au fil du temps, les étagères palatines se développent vers le bas de chaque côté de la langue, s’élèvent à une position opposée au-dessus de la langue et finissent par fusionner à la ligne médiane pour former un palais continu qui sépare les cavités nasale et buccale par E16.51.
Ces changements morphologiques tout au long du développement craniofacial sont initiés et maintenus par diverses interactions de signalisation, qui incluent souvent la phosphorylation des protéines par les kinases. Par exemple, les récepteurs de la membrane cellulaire, tels que les sous-familles de récepteurs β du facteur de croissance transformant (TGF), y compris les récepteurs de protéines morphogénétiques osseuses (BMPR) et diverses familles de récepteurs tyrosine kinase (RTK), sont autophosphorylés lors de la liaison et de l’activation du ligand dans les cellules de la crête neurale crânienne 2,3,4 . De plus, le récepteur transmembranaire couplé à la protéine G Smoothened devient phosphorylé dans les cellules de la crête neurale crânienne et l’ectoderme craniofacial en aval de la liaison du ligand sonic hedgehog (SHH) au récepteur Patched1, ce qui entraîne une accumulation lissée au niveau de la membrane ciliaire et une activation de la voie SHH5. De telles interactions ligand-récepteur peuvent se produire par signalisation autocrine, paracrine et / ou juxtacrine dans des contextes craniofaciaux. Par exemple, BMP6 est connu pour signaler de manière autocrinale lors de la différenciation des chondrocytes6, tandis que le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 8 est exprimé dans l’ectoderme de l’arc pharyngé et se lie aux membres de la famille FGF des RTK exprimés dans le mésenchyme de l’arc pharyngé de manière paracrine pour initier le modelage et l’excroissance des arcs pharyngés7, 8,9,10. En outre, la signalisation Notch est activée dans les chondrocytes et les ostéoblastes pendant le développement du squelette craniofacial par la signalisation juxtacrine lorsque les ligands transmembranaires Delta et / ou Jagged se lient aux récepteurs Transmembranaires Notch sur les cellules voisines, qui sont ensuite clivés et phosphorylés11. Cependant, il existe d’autres paires de ligands et de récepteurs importantes pour le développement craniofacial qui ont la flexibilité de fonctionner à la fois dans la signalisation autocrine et paracrine. À titre d’exemple, au cours de la morphogenèse des dents murines, il a été démontré que le ligand PDGF)-AA du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF)-AA signale de manière autocririne pour activer le RTK PDGFRα dans l’épithélium12 de l’organe de l’émail. En revanche, dans les processus faciaux murins au milieu de la gestation, les transcriptions codant pour les ligands PDGF-AA et PDGF-CC sont exprimées dans l’ectoderme craniofacial, tandis que le récepteur PDGFRα est exprimé dans le mésenchyme dérivé de la crête neurale crânienne sous-jacente, ce qui entraîne une signalisation paracrine 13,14,15,16,17 . Quel que soit le mécanisme de signalisation, ces événements de phosphorylation des récepteurs entraînent souvent le recrutement de protéines adaptatrices et/ou de molécules de signalisation, qui se phosphorylent fréquemment elles-mêmes pour initier des cascades de kinases intracellulaires telles que la voiemapk(e) de la protéine kinase activée par le mitogène (MAPK) 18,19.
Les effecteurs intracellulaires terminaux de ces cascades peuvent alors phosphoryler un ensemble de substrats, tels que les facteurs de transcription, la liaison à l’ARN, les protéines de matrice cytosquelettique et extracellulaire. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 et Sox926 font partie des facteurs de transcription phosphorylés dans le contexte du développement craniofacial. Cette modification post-traductionnelle (PTM) peut affecter directement la susceptibilité aux PTM alternatifs, la dimérisation, la stabilité, le clivage et/ou l’affinité de liaison à l’ADN, entre autres activités 20,21,25,26. De plus, la protéine de liaison à l’ARN Srsf3 est phosphorylée dans le contexte du développement craniofacial, ce qui conduit à sa translocation nucléaire27. En général, il a été démontré que la phosphorylation des protéines de liaison à l’ARN affecte leur localisation subcellulaire, les interactions protéine-protéine, la liaison à l’ARN et / ou la spécificité de la séquence28. En outre, la phosphorylation de l’actomyosine peut entraîner des réarrangements cytosquelettiques tout au long du développement craniofacial29,30, et la phosphorylation des protéines de la matrice extracellulaire, telles que les petites glycoprotéines liées à l’azote du ligand liant l’intégrine, contribue à la biominéralisation au cours du développement du squelette31. À travers ce qui précède et de nombreux autres exemples, il est évident qu’il existe de vastes implications pour la phosphorylation des protéines au cours du développement craniofacial. En ajoutant un niveau supplémentaire de régulation, la phosphorylation des protéines est encore modulée par les phosphatases, qui contrecarrent les kinases en éliminant les groupes phosphate.
Ces événements de phosphorylation aux niveaux du récepteur et de la molécule effectrice sont essentiels pour la propagation des voies de signalisation et entraînent finalement des changements dans l’expression des gènes dans le noyau, entraînant des activités cellulaires spécifiques, telles que la migration, la prolifération, la survie et la différenciation, qui entraînent une formation correcte du visage des mammifères. Compte tenu de la spécificité contextuelle des interactions protéiques avec les kinases et les phosphatases, des changements qui en résultent dans les PTM et de leurs effets sur l’activité cellulaire, il est essentiel que ces paramètres soient étudiés dans un cadre physiologiquement pertinent pour acquérir une compréhension complète de la contribution des événements de phosphorylation au développement craniofacial. Ici, des exemples de deux contextes dans lesquels étudier la phosphorylation des protéines et, par conséquent, l’activation des voies de signalisation au cours du développement craniofacial des mammifères sont fournis: les processus faciaux de souris, en particulier les processus maxillaires E11.5, et les cellules mésenchymes palatales embryonnaires de souris cultivées dérivées de plateaux palataux secondaires E13.5 - à la fois primaires32 et immortalisées33 . À E11.5, les processus maxillaires sont en train de fusionner avec les processus nasaux latéraux et médiaux1, représentant ainsi un point temporel critique pendant le développement craniofacial de la souris. En outre, les processus maxillaires et les cellules dérivées des plateaux palataux ont été choisis ici parce que ces dernières structures sont des dérivés de la première, offrant ainsi aux chercheurs la possibilité d’interroger la phosphorylation des protéines in vivo et in vitro dans des contextes connexes. Cependant, ce protocole est également applicable aux processus faciaux alternatifs et aux points temporels de développement.
Un problème critique dans l’étude des protéines phosphorylées est qu’elles sont facilement déphosphorylées lors de l’isolement des protéines par des phosphatases environnementales abondantes. Pour surmonter cette barrière, les adaptations et les modifications apportées aux méthodes de laboratoire standard qui permettent l’isolement des protéines phosphorylées sont discutées. De plus, des pratiques exemplaires sont fournies pour l’analyse et la quantification appropriées des protéines phosphorylées. Ces techniques, en particulier en combinaison avec des inhibiteurs pharmacologiques et / ou des modèles génétiques murins, peuvent être utilisées pour mieux comprendre la dynamique et les rôles de diverses voies de signalisation actives au cours du développement craniofacial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block for mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>chemiluminescence imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, air jacket</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board, 11 x 13 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09 002 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95003001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z604062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for SDS-PAGE</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular ice pan, maxi 9 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350649020000000</td>
			<td>dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11 676 341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02 215 414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9358182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 6 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, polypropylene, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 9&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pouches, transparent, polyethylene lining</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small latex bulb, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 25 mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with luer tip, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot cassette opening lever</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4560000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann 3MM chr chromatography paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5422-25G</td>
			<td>stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC403140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>stock concentration 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>E7</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI32106</td>
			<td>low picogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-302B</td>
			<td>low femtogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610772</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2705HC</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 6N (certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56-500</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal Ca - 630 non-ionic detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19859650</td>
			<td>Nonidet P-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>stock concentration 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9102S</td>
			<td>1:1,000; anti-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB recombinant ligand, rat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>520BB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3169S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>stock concentration 100 U/mL, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC215740100</td>
			<td>PMSF; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9101S</td>
			<td>1:1,000, anti-phospho-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PDGF Receptor &#945; /PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3170S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution, 10%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (crystalline/biological,certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205330500</td>
			<td>Na3VO4; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610771</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioWorld</td>
			<td>21560033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot molecular weight marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female 129S4 mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis

Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Ces changements morphologiques sont initiés et maintenus par diverses interactions de signalisation, qui incluent souvent la phosphorylation des protéines par les kinases. Ici, deux exemples de contextes physiologiquement pertinents dans lesquels étudier la phosphorylation des protéines au cours du développement craniofacial des mammifères sont fournis: les processus faciaux de souris, en particulier les processus maxillaires E11.5, et les cellules mésenchymates palatales embryonnaires de souris cultivées dérivées de plateaux palataux secondaires E13.5. Pour surmonter la barrière commune de la déphosphorylation lors de l’isolement des protéines, les adaptations et les modifications apportées aux méthodes de laboratoire standard qui permettent l’isolement des phosphoprotéines sont discutées. De plus, des pratiques exemplaires sont fournies pour l’analyse et la quantification appropriées des phosphoprotéines après le transfert western des lysats de protéines de cellules entières. Ces techniques, en particulier en combinaison avec des inhibiteurs pharmacologiques et / ou des modèles génétiques murins, peuvent être utilisées pour mieux comprendre la dynamique et les rôles de diverses phosphoprotéines actives au cours du développement craniofacial.

Lorsque l’on tente de caractériser la phosphorylation de protéines isolées à partir de processus faciaux de souris et/ou de cellules de mésenchyme palatales cultivées, les résultats représentatifs révéleront idéalement une bande distincte et reproductible après un transfert western avec un anticorps anti-phosphoprotéine qui se situe à la hauteur ou près de la hauteur de la bande protéique totale correspondante (Figure 3 ). Cependant, si une phosphorylation étendue de la pr...

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Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Le protocole présente une méthode pour isoler les lysats de protéines de cellules entières des processus faciaux d’embryons de souris disséqués ou de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires de souris cultivées et effectuer un transfert occidental ultérieur pour évaluer les niveaux de protéines phosphorylées.

Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Ce protocole peut être utilisé pour mieux comprendre la dynamique et les rôles des phosphoprotéines actives au cours du développement craniofacial des mammifères. Ce protocole surmonte la barrière commune de la déphosphorylation lors de l’isolement des protéines à partir de deux contextes physiologiquement pertinents, les processus faciaux de souris et les cellules de mésenchyme palatale embryonnaire de souris cultivées. Il est impératif d’agir rapidement tout en gardant tous les réactifs et matériaux sur la glace et d’utiliser des inhibiteurs de phosphatase dans tous les tampons de lyse pour maintenir l’intégrité des protéines phosphorylées.Pour commencer, posez le corps de la souris sur une planche de dissection avec le côté ventral tourné vers le haut et vaporisez l’abdomen de la souris avec de l’éthanol à 70%. Ouvrez ensuite la cavité abdominale en pinçant et en soulevant la peau antérieure à l’ouverture vaginale avec une pince Semken droite. Ensuite, coupez la peau soulevée en couches sous-jacentes avec des ciseaux chirurgicaux à lame droite à un angle de 45 degrés de chaque côté pour générer une forme en V qui s’étend à chaque surface latérale à peu près à mi-chemin entre les quatre membres et les membres postérieurs.À l’aide de la pince Semken, saisissez l’une des cornes utérines et coupez sous l’oviducte et au-dessus du col de l’utérus avec des ciseaux chirurgicaux. Pour permettre l’élimination complète de la corne utérine, coupez le mésomètre, puis transférez la corne utérine disséquée à 10 millilitres de PBS histologique dans une boîte de Petri de 10 centimètres. De même, retirez la deuxième corne utérine du côté opposé de la cavité abdominale.Ensuite, placez la boîte de Petri de 10 centimètres contenant les deux cornes utérines sur de la glace. Sous un stéréomicroscope disséquant, disséquez soigneusement chaque embryon des cornes utérines avec une pince fine Dumont 5. Ensuite, retirez lentement le myomètre, la décidua et le chorion.Ensuite, déchirez et retirez l’amnion relativement transparent entourant l’embryon et coupez le cordon ombilical reliant l’embryon au placenta. Ensuite, transférez chaque embryon disséqué à 2,5 millilitres de PBS histologique dans un puits individuel d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits sur glace à l’aide d’un tuyau de transfert en plastique coupé. Préparez trois boîtes de Petri de 10 centimètres contenant 10 millilitres de PBS histologique et conservez-les sur de la glace pour les utiliser en rotation entre les embryons.Ensuite, transférez un embryon d’un puits individuel de la plaque de culture cellulaire de 12 puits à l’une des boîtes de Petri de 10 centimètres avec l’histologie PBS sur glace à l’aide d’une pipette de transfert en plastique coupée. Sous le microscope à dissection, séparez chaque processus maxillaire du visage à l’aide de la pince fine en faisant d’abord une coupe sur le côté antérieur d’un processus maxillaire le long de l’indentation naturelle séparant le processus nasal latéral dans le processus maxillaire. Ensuite, coupez la face postérieure du processus maxillaire le long de l’indentation naturelle séparant le processus maxillaire et le processus mandibulaire.Ensuite, séparez complètement le processus maxillaire en faisant une coupe verticale des côtés antérieur à postérieur du processus maxillaire du côté oculaire du processus maxillaire où les indentations naturelles référencées ci-dessus se terminent. À l’aide d’une pipette Pasteur de neuf pouces avec une petite ampoule en latex de deux millilitres, transférez la paire disséquée de processus maxillaires dans une petite gouttelette d’environ 30 microlitres de PBS histologique dans une boîte de Petri étiquetée de 35 millimètres sur de la glace. Transférez ensuite la paire de tissus maxillaires dans un tube de microcentrifugation marqué de 1,5 millilitre sur de la glace à l’aide de la pipette Pasteur, minimisant ainsi le transfert de PBS histologique.De plus, retirez tout excès de PBS histologique dans le tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec la pipette Pasteur. Ajouter 0,1 millilitre de tampon de lyse NP40 glacé avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase ajoutés immédiatement avant utilisation sur glace. Puis pipette de haut en bas 10 fois avec un PIPETMAN de 200 microlitres.Ensuite, vortexez pendant 10 secondes, puis pipetez de haut en bas 10 fois avec un PIPETMAN de 200 microlitres, tout en évitant la génération de bulles. Incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures tout en tournant bout à bout à l’aide d’une palette de 1,5 millilitre ou de deux millilitres avec un revolver à tube. Ensuite, centrifugez les échantillons à 13 500 x g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et collectez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sur glace avec un PIPETMAN de 200 millilitres.Tout d’abord, aspirez le milieu des cellules de mésenchyme palatal embryonnaire de souris à l’aide d’une pipette Pasteur de 5,75 pouces fixée à un système de vide. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS de culture tissulaire glacé et inclinez la plaque sur le côté lors du dernier lavage pour vous assurer que tout le PBS de culture tissulaire est aspiré. Ensuite, ajoutez un tampon de lyse NP40 glacé avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase ajoutés immédiatement avant l’utilisation sur la glace pour lyser les cellules.Incuber la plaque sur de la glace pendant cinq minutes avec une rotation d’environ toutes les minutes pour assurer une couverture complète de la plaque. Ensuite, grattez les cellules de la plaque à l’aide d’un élévateur de cellules pré-refroidi et transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifuge pré-refroidi de 1,5 millilitre sur de la glace. Ensuite, incuber la suspension cellulaire à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes tout en tournant bout à bout à l’aide d’une palette de 1,5 millilitre ou de deux millilitres avec un revolver à tube.Ensuite, centrifugez les échantillons à 13 500 x g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et collectez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sur glace avec un PIPETMAN de 200 millilitres. L’analyse par transfert western de lysats de cellules entières provenant de cellules palatines embryonnaires immortalisées de souris après stimulation par ligand PDFG-B de 2 à 15 minutes a révélé des bandes reproductibles distinctes pour les phosphoprotéines qui courent à la hauteur ou près de la hauteur de la bande protéique totale correspondante. Une augmentation de l’intensité de la bande des phosphoprotéines a été observée lors du traitement avec un facteur de croissance par rapport à celles des cellules non traitées, tandis que les intensités totales de la bande protéique étaient relativement égales entre les échantillons.Ce protocole peut être utilisé pour sonder comment les perturbations et la phosphorylation influencent directement la signalisation intercellulaire, l’expression des gènes et l’activité cellulaire dans des contextes craniofaciaux.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Recherche

Biologie du développement

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isoler et analyse des cellules du pancréas Mesenchyme par cytométrie de flux

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Enregistrements de puces et de cellules entières de cellules épithéliales primaires isolées de l&#39;épididyme

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus Infection du cerveau foetal humain cultivé des cellules souches neurales pour analyse immunocytochimique

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Toute monture Immunofluorescence et Quantification de follicule de souris cultivées ovaires

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

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In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

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