Name: isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

129S4 mus var en gave fra Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine ved Mount Sinai. Dette arbeidet ble støttet med midler fra National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 og K02 DE028572 til K.A.F., F31 DE029976 til M.A.R. og F31 DE029364 til B.J.C.D.

Alle prosedyrene som involverte dyr ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Colorado Anschutz Medical Campus og utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og forskrifter. Kvinnelige 129S4 mus ved 1,5-6 måneders alder og plassert ved en subterminutral temperatur på 21-23 °C ble brukt til embryohøsting. En skjematisk arbeidsflyt for protokollen er representert i figur 1. Se materialtabellen for detaljer om alt materia...

Protokollen beskrevet her gjør det mulig for forskere å granske kritiske fosforyleringsavhengige signalhendelser under kraniofacial utvikling på en robust og reproduserbar måte. Det er flere kritiske trinn i denne protokollen som sikrer riktig innsamling av data og analyse av resultater. Enten du isolerer fosfoproteiner fra muse ansiktsprosesser og / eller dyrket palatal mesenchyme celler, er det viktig å bevege seg raskt og effektivt mens du holder alle reagenser og materialer på is når det er angitt. Den lave te...

Pattedyr kraniofacial utvikling er en kompleks morfologisk prosess der flere cellepopulasjoner koordinerer for å generere frontonasal skjelettet. I musen begynner denne prosessen på embryonal dag (E) 9,5 med dannelsen av frontonasal prominens og par av maksillære og mandibulære prosesser, som hver inneholder postmigrerende kraniale nevrale kamceller. De laterale og mediale neseprosessene oppstår fra frontonasal prominens med utseendet på nesegravene og til slutt smelter sammen for å danne neseborene. Videre smelter mediale neseprosesser og maksillære prosesser sammen for å generere overleppen. Samtidig initieres palatogenesis med dannelsen av forskjellige utvekster - de sekundære palatalhyllene - fra den muntlige siden av maksillære prosesser på E11,5. Over tid vokser palasshyllene nedover på hver side av tungen, løfter seg til en motsatt posisjon over tungen, og til slutt smelter de sammen ved midtlinjen for å danne en kontinuerlig gane som skiller nese- og munnhulene med E16,51.
Disse morfologiske endringene gjennom kraniofacial utvikling er initiert og opprettholdt gjennom ulike signalinteraksjoner, som ofte inkluderer proteinfosforylering av kinases. For eksempel er cellemembranreseptorer, som underfamilier av transformerende vekstfaktor (TGF)-β reseptorer, inkludert benmorfogenetiske proteinreseptorer (BMPRs) og ulike reseptor tyrosinkinasefamilier (RTK), autofosforylert ved ligandbinding og aktivering i kranial nevrale kamceller 2,3,4 . I tillegg blir G protein-koblet transmembranreseptor Smoothened fosforylert i kranial nevrale kamceller og kraniofacial ektoderm nedstrøms for Sonic pinnsvin (SHH) ligandbinding til Patched1-reseptoren, noe som resulterer i glattet akkumulering ved ciliary membranen og SHH-baneaktivering5. Slike ligandreseptorinteraksjoner kan forekomme gjennom autokriminelle, parakrine- og/eller jukstakrinsignalering i kraniofaciale sammenhenger. For eksempel er BMP6 kjent for å signalisere på en autocrine måte under kondrocyttdifferensiering6, mens fibroblast vekstfaktor (FGF) 8 uttrykkes i pharyngeal arch ectoderm og binder seg til medlemmer av FGF-familien av RTK uttrykt i pharyngeal arch mesenchyme på en paracrine måte for å initiere mønster og utvekst av pharyngeal buer7, 8,9,10. Videre aktiveres Notch-signalering i både kondrocytter og osteoblaster under kraniofacial skjelettutvikling gjennom jukstakrinsignalering når transmembrane Delta og/eller Taggete ligander binder seg til transmembrane Notch-reseptorer på nærliggende celler, som senere spaltes og fosforyllatert11. Imidlertid er det andre ligand- og reseptorpar som er viktige for kraniofacial utvikling som har fleksibilitet til å fungere i både autocrine og paracrine signalering. Som et eksempel, under murin tannmorfogenese, har blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF)-AA ligand vist seg å signalisere på en autocrine måte å aktivere RTK PDGFRα i emaljeorganet epitel12. I murine ansiktsbehandlingsprosesser under midten av svangerskapet uttrykkes transkripsjoner som koder ligandene PDGF-AA og PDGF-CC i kraniofacial etoderm, mens PDGFRα-reseptoren uttrykkes i den underliggende kranial nevrale kam-avledede mesenchymen, noe som resulterer iparakrinesignalering 13,14,15,16,17 . Uavhengig av signalmekanismen resulterer disse reseptorfosforyleringshendelsene ofte i rekruttering av adapterproteiner og / eller signalmolekyler, som ofte blir fosforylert selv for å initiere intracellulære kinasekaskader som mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) sti18,19.
Terminalens intracellulære effektorer av disse kaskadene kan deretter fosforylere en rekke substrater, for eksempel transkripsjonsfaktorer, RNA-bindende, cytoskeletale og ekstracellulære matriseproteiner. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 og Sox926 er blant transkripsjonsfaktorene fosforylert i sammenheng med kraniofacial utvikling. Denne postoversettelsesendringen (PTM) kan direkte påvirke følsomheten for alternative PTMer, dimerisering, stabilitet, spalting og/eller DNA-bindende affinitet, blant annetaktiviteter på 20,21,25,26. I tillegg er det RNA-bindende proteinet Srsf3 fosforylert i sammenheng med kraniofacial utvikling, noe som fører til kjernefysisk translokasjon27. Generelt har fosforylering av RNA-bindende proteiner vist seg å påvirke deres subcellulære lokalisering, proteinproteininteraksjoner, RNA-binding og / eller sekvensspesifikkitet28. Videre kan fosforylering av actomyosin føre til cytoskeletale omorganiseringer gjennom kraniofacial utvikling29,30, og fosforylering av ekstracellulære matriseproteiner, som små integrinbindende ligand N-koblede glykoproteiner, bidrar til biomineralisering under skjelettutvikling31. Gjennom ovennevnte og mange andre eksempler er det tydelig at det er store implikasjoner for proteinfosforylering under kraniofacial utvikling. Ved å legge til et ekstra reguleringsnivå, moduleres proteinfosforylering ytterligere av fosfater, som motvirker kinaser ved å fjerne fosfatgrupper.
Disse fosforyleringshendelsene på både reseptor- og effektormolekylnivåene er avgjørende for forplantning av signalveier og resulterer til slutt i endringer i genuttrykk i kjernen, som driver spesifikke celleaktiviteter, for eksempel migrasjon, spredning, overlevelse og differensiering, noe som resulterer i riktig dannelse av pattedyrets ansikt. Gitt kontekstspesifisiteten av proteininteraksjoner med kinaser og fosfater, de resulterende endringene i PTMer, og deres effekter på celleaktivitet, er det avgjørende at disse parametrene studeres i en fysiologisk relevant setting for å få full forståelse av bidraget av fosforyleringshendelser til kraniofacial utvikling. Her gis eksempler på to sammenhenger for å studere fosforylering av proteiner og dermed aktivering av signalveier under pattedyr kraniofacial utvikling: muse ansiktsbehandlingsprosesser, spesielt E11.5 maksillære prosesser, og kultivert mus embryonale palatalmesenchymeceller avledet fra E13.5 sekundære palatalhyller - både primær32 og udødeliggjort33. . På E11.5 er de maksillære prosessene i ferd med å fusjonere med laterale og mediale neseprosesser1, og representerer dermed et kritisk tidspunkt under musekraniofacial utvikling. Videre ble maksillære prosesser og celler avledet fra palatalhyllene valgt her fordi de sistnevnte strukturene er derivater av førstnevnte, og dermed gir forskerne muligheten til å forhøre proteinfosforylering in vivo og in vitro i relaterte sammenhenger. Denne protokollen gjelder imidlertid også for alternative ansiktsprosesser og utviklingstidspunkter.
Et kritisk problem med å studere fosforylaterte proteiner er at de lett defosforeres under proteinisolasjon ved rikelig miljøfosfatase. For å overvinne denne barrieren diskuteres tilpasninger og modifikasjoner til standard laboratoriemetoder som muliggjør isolering av fosforylaterte proteiner. I tillegg er beste praksis gitt for riktig analyse og kvantifisering av fosforylaterte proteiner. Disse teknikkene, spesielt i kombinasjon med farmakologiske hemmere og/eller murine genetiske modeller, kan brukes til å få større innsikt i dynamikken og rollene til ulike signalveier som er aktive under kraniofacial utvikling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block for mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>chemiluminescence imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, air jacket</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board, 11 x 13 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09 002 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95003001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z604062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for SDS-PAGE</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular ice pan, maxi 9 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350649020000000</td>
			<td>dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11 676 341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02 215 414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9358182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 6 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, polypropylene, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 9&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pouches, transparent, polyethylene lining</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small latex bulb, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 25 mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with luer tip, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot cassette opening lever</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4560000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann 3MM chr chromatography paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5422-25G</td>
			<td>stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC403140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>stock concentration 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>E7</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI32106</td>
			<td>low picogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-302B</td>
			<td>low femtogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610772</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2705HC</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 6N (certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56-500</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal Ca - 630 non-ionic detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19859650</td>
			<td>Nonidet P-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>stock concentration 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9102S</td>
			<td>1:1,000; anti-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB recombinant ligand, rat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>520BB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3169S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>stock concentration 100 U/mL, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC215740100</td>
			<td>PMSF; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9101S</td>
			<td>1:1,000, anti-phospho-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PDGF Receptor &#945; /PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3170S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution, 10%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (crystalline/biological,certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205330500</td>
			<td>Na3VO4; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610771</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioWorld</td>
			<td>21560033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot molecular weight marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female 129S4 mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis

Pattedyr kraniofacial utvikling er en kompleks morfologisk prosess der flere cellepopulasjoner koordinerer for å generere frontonasal skjelettet. Disse morfologiske endringene initieres og opprettholdes gjennom ulike signalinteraksjoner, som ofte inkluderer proteinfosforylering av kinaser. Her gis to eksempler på fysiologisk relevante sammenhenger for å studere fosforylering av proteiner under pattedyr kraniofacial utvikling: muse ansiktsbehandlingsprosesser, spesielt E11,5 maksillære prosesser, og kultivert mus embryonale palatalmesenchyme celler avledet fra E13,5 sekundære palatalhyller. For å overvinne den vanlige barrieren for defosforylering under proteinisolasjon, diskuteres tilpasninger og modifikasjoner til standard laboratoriemetoder som muliggjør isolering av fosfoproteiner. I tillegg er beste praksis gitt for riktig analyse og kvantifisering av fosfoproteiner etter vestlig blotting av hele celleproteinlysater. Disse teknikkene, spesielt i kombinasjon med farmakologiske hemmere og/eller muringenetiske modeller, kan brukes til å få større innsikt i dynamikken og rollene til ulike fosfoproteiner som er aktive under kraniofacial utvikling.

Når du prøver å karakterisere fosforylering av proteiner isolert fra muse ansiktsbehandlingsprosesser og / eller kultivert palatal mesenchyme celler, vil de representative resultatene ideelt sett avsløre et tydelig, reproduserbart bånd etter vestlig blotting med et anti-fosfoprotein antistoff som går på eller nær høyden på det tilsvarende totale proteinbåndet (figur 3 ). Men hvis omfattende fosforylering av proteinet oppstår, kan det være et lite oppadgående skifte av fosfoprot...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Protokollen presenterer en metode for å isolere hele celleprotein lysater fra dissekerte museembryo ansiktsprosesser eller dyrket mus embryonale palatal mesenchyme celler og utføre påfølgende vestlig blotting for å vurdere fosforylatert protein nivåer.

Isolering av hele celleprotein lysater fra mus ansiktsprosesser og kultivert palatal mesenchyme celler for fosfoprotein analyse

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Denne protokollen kan brukes til å få større innsikt i dynamikken og rollene til fosfoproteiner som er aktive under pattedyrkraniofacial utvikling. Denne protokollen overvinner den vanlige barrieren for defosforylering under proteinisolasjon fra to fysiologisk relevante kontekst, muse ansiktsbehandlingsprosesser og kultivert mus embryonale palatalmesenchyme celler. Det er viktig å bevege seg raskt mens du holder alle reagenser og materialer på is og bruker fosfatasehemmere i alle lysisbuffere for å opprettholde integriteten til fosforylaterte proteiner.Til å begynne med legger du musekroppen på et dissekeringsbrett med ventralsiden vendt opp, og spray muselivet med 70% etanol. Åpne deretter bukhulen ved å klemme og løfte huden fremre til vaginalåpningen med rette Semken-tang. Deretter kutter du den løftede huden i underliggende lag med rett bladkirurgisk saks i en 45 graders vinkel på hver side for å generere en V-form som strekker seg til hver sideflate omtrent halvveis mellom de fire lemmer og bakre lemmer.Bruk Semken tang, grip en av livmor horn og kutt under ovidukten og over livmorhalsen med kirurgisk saks. For å tillate fullstendig fjerning av livmorhornet, kutt bort mesometriumet, og overfør deretter det dissekerte livmorhornet til 10 milliliter histologi PBS i en 10 centimeter Petri-tallerken. På samme måte fjerner du det andre livmorhornet på motsatt side av bukhulen.Etterpå legger du den 10 centimeter petriske retten som inneholder begge livmorhornene på isen. Under et dissekerende stereomikroskop, disseker forsiktig ut hvert embryo fra livmorhornene med Dumont 5 fine tang. Deretter sakte trekke bort myometrium, decidua, og chorion.Deretter rive og fjerne den relativt gjennomsiktige amnion rundt embryoet og kutte navlestrengen som forbinder embryoet til morkaken. Overfør deretter hvert dissekerte embryo til 2,5 milliliter histologi PBS i en individuell brønn av en 12-brønns cellekulturplate på is ved hjelp av en kuttet plastoverføringspipet. Forbered tre 10 centimeter Petri retter som inneholder 10 milliliter histologi PBS og hold dem på is som skal brukes i rotasjon mellom embryoer.Overfør deretter ett embryo fra en individuell brønn av den 12-brønns cellekulturplaten til en av de 10 centimeter Petri-rettene med histologi PBS på is ved hjelp av en kuttet plastoverføringspipette. Under dissekeringsmikroskopet skiller du hver maksillærprosess fra ansiktet ved hjelp av de fine tangene ved først å lage et kutt på den fremre siden av en maksillær prosess langs den naturlige innrykket som skiller den laterale neseprosessen i maksillærprosessen. Deretter kutter du den bakre siden av maksillærprosessen langs den naturlige innrykket som skiller maksillærprosessen og mandibulærprosessen.Deretter skiller du maksillærprosessen helt ved å lage et vertikalt kutt fra fremre til bakre sider av maksillærprosessen på øyesiden av maksillærprosessen der de naturlige innrykkene nevnt ovenfor. Bruk en ni tommers Pasteur pipette med en to milliliter liten latexpære, overfør det dissekerte paret med maksillære prosesser i en liten dråpe på omtrent 30 mikroliter histologi PBS til en merket 35 millimeter Petri-tallerken på is. Overfør deretter paret med maksillær prosessvev til et merket 1,5 milliliter mikrosentermikrosenterrør på is ved hjelp av Pasteur-pipetten, og minimer overføringen av histologi PBS.Fjern videre overflødig histologi PBS i 1,5 milliliter mikrosenterrør med Pasteur pipette. Tilsett 0,1 milliliter iskald NP40 lysisbuffer med protease- og fosfathemmere tilsatt umiddelbart før bruk på is. Deretter pipette opp og ned 10 ganger med en 200 mikroliter PIPETMAN.Deretter virvel i 10 sekunder, og deretter pipette opp og ned 10 ganger med en 200 mikroliter PIPETMAN, samtidig unngå generering av bobler. Inkuber ved fire grader Celsius i to timer mens du roterer ende-over-end ved hjelp av en 1,5 milliliter eller to milliliter padle med en rør revolver. Sentrifuger deretter prøvene ved 13.500 x g i 20 minutter ved fire grader Celsius og samle supernatanten til et nytt mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter på is med en 200 milliliter PIPETMAN.Først aspirerer du mediet fra musens embryonale palatale mesenchyme-celler ved hjelp av en 5,75 tommers Pasteur pipette festet til et vakuumsystem. Vask deretter cellene to ganger med iskald vevskultur PBS og vipp platen til siden under siste vask for å sikre at all vevskulturen PBS aspireres. Deretter tilsetter du iskald NP40 lysisbuffer med protease- og fosfatasehemmere tilsatt umiddelbart før bruk på is for å lyse cellene.Inkuber platen på is i fem minutter med rotasjon omtrent hvert minutt for å sikre fullstendig dekning av platen. Skrap deretter cellene av platen ved hjelp av en ferdigkjølt celleløfter, og overfør cellefjæringen til et forhåndskjølt 1,5 milliliter mikrosenterrør på is. Deretter inkuberer du cellefjæringen ved fire grader Celsius i 30 minutter mens du roterer ende-over-end ved hjelp av en 1,5 milliliter eller to milliliter padle med en rørrevolver.Sentrifuger deretter prøvene ved 13.500 x g i 20 minutter ved fire grader Celsius og samle supernatanten til et nytt mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter på is med en 200 milliliter PIPETMAN. Vestlig blot analyse av hele celle lysater fra udødeliggjort mus embryonale palatal mesenchyme celler etter stimulering med PDFG-B ligand fra 2 til 15 minutter avslørte tydelige reproduserbare bånd for fosfoproteiner som kjører på eller nær høyden av tilsvarende totalt proteinbånd. En økning i fosfoproteinbåndintensiteter ble observert ved behandling med en vekstfaktor sammenlignet med de av ubehandlede celler, mens totale proteinbåndintensiteter var relativt like mellom prøver.Denne protokollen kan brukes til å undersøke hvordan perturbasjoner og fosforylering direkte påvirker intercellulær signalering, genuttrykk og cellulær aktivitet i kraniofaciale sammenhenger.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektiv Isolering av funksjonelle holmer fra Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolere og analysere cellene i bukspyttkjertelen Mesenchyme ved flowcytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Hele-celle Patch-clamp Opptak av isolerte primære epitelceller fra epididymene

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika smitte av kultivert menneskelig fosterets hjerne nevrale stamceller for Immunocytochemical analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount Immunofluorescence og hårsekken kvantifisering av kultivert musen eggstokkene

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolasjon og farging av mus Skin keratinocytter for celle syklus spesifikk analyse av Cellular protein uttrykk ved Mass flowcytometri

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse av Cardiac kammer utvikling under musen Embryogenesis bruke hele Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Utarbeidelse av små RNA biblioteker for sekvensering fra tidlig mus embryoer

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...