Name: isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

Мыши 129S4 были подарком от доктора Филиппа Сориано, Медицинской школы Икана на горе Синай. Эта работа была поддержана средствами Национальных институтов здравоохранения (NIH)/Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (NIDCR) R01 DE027689 и K02 DE028572 для K.A.F., F31 DE029976 для M.A.R. и F31 DE029364 для B.J.C.D.

Все процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского кампуса Университета Колорадо Аншутц и выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами и правилами. Для сбора эмбрионов испо?...

Протокол, описанный здесь, позволяет исследователям исследовать критические сигнальные события, зависящие от фосфорилирования, во время черепно-лицевого развития надежным и воспроизводимым образом. В этом протоколе есть несколько важных шагов, которые обеспечивают надлежащий сбор д...

Черепно-лицевое развитие млекопитающих представляет собой сложный морфологический процесс, в ходе которого несколько клеточных популяций координируются для создания фронтоназального скелета. У мышей этот процесс начинается в эмбриональный день (Е) 9,5 с образования фронтоназального протуберанца и пар верхнечелюстного и нижнечелюстного отростков, каждый из которых содержит постмигрирующие черепно-нервные гребневые клетки. Боковые и медиальные носовые процессы возникают из фронтоназального протуберанца с появлением носовых ямок и в конечном итоге сливаются с образованием ноздрей. Кроме того, медиальные носовые процессы и верхнечелюстные процессы сливаются с образованием верхней губы. Одновременно начинается палатогенез с образованием отчетливых выростов — вторичных небных полок — с ротовой стороны верхнечелюстных отростков при Е11,5. Со временем небные полки растут вниз по обе стороны языка, поднимаются в противоположное положение над языком и в конечном итоге сливаются на средней линии, образуя непрерывное небо, которое разделяет носовую и ротовую полости E16.51.
Эти морфологические изменения на протяжении всего черепно-лицевого развития инициируются и поддерживаются посредством различных сигнальных взаимодействий, которые часто включают фосфорилирование белка киназами. Например, рецепторы клеточной мембраны, такие как подсемейства трансформирующего фактора роста (TGF)-β рецепторов, включая костные морфогенетические белковые рецепторы (BMPR), и различные семейства рецепторов тирозинкиназы (RTK), автофосфорилируются при связывании лигандов и активации в клетках нервного гребня черепа 2,3,4 . Кроме того, Сглаженный трансмембранный рецептор, связанный с G-белком, фосфорилируется в клетках черепного нервного гребня и черепно-лицевой эктодерме после связывания лиганда Sonic hedgehog (SHH) с рецептором Patched1, что приводит к сглаженному накоплению на цилиарной мембране и активации пути SHH5. Такие лиганд-рецепторные взаимодействия могут происходить через аутокринную, паракринную и/или юкстакринную передачу сигналов в черепно-лицевом контексте. Например, известно, что BMP6 сигнализирует аутокринным способом во время дифференцировки хондроцитов6, тогда как фактор роста фибробластов (FGF) 8 экспрессируется в эктодерме глоточной дуги и связывается с членами семейства FGF RTK, выраженными в мезенхиме глоточной дуги паракринным образом, чтобы инициировать паттернирование и рост глоточных дуг7, 8,9,10. Кроме того, передача сигналов Notch активируется как в хондроцитах, так и в остеобластах во время развития черепно-лицевого скелета посредством юкстакринной сигнализации, когда трансмембранные дельта и/или зубчатые лиганды связываются с трансмембранными рецепторами Notch на соседних клетках, которые впоследствии расщепляются и фосфорилируются11. Тем не менее, существуют и другие пары лигандов и рецепторов, важные для черепно-лицевого развития, которые обладают гибкостью для функционирования как в аутокринной, так и в паракринной сигнализации. Например, во время морфогенеза зуба мышей было продемонстрировано, что тромбоцитарный фактор роста (PDGF)-AA лиганд сигнализирует аутокринным способом для активации RTK PDGFRα в эпителии12 эмалированного органа. Напротив, в мышиных лицевых процессах в середине беременности транскрипты, кодирующие лиганды PDGF-AA и PDGF-CC, экспрессируются в черепно-лицевой эктодерме, в то время как рецептор PDGFRα экспрессируется в подлежащей мезенхиме, полученной из черепного нервного гребня, в результате чего паракрин сигнализирует 13,14,15,16,17 . Независимо от сигнального механизма, эти события фосфорилирования рецепторов часто приводят к набору адапторных белков и/или сигнальных молекул, которые часто фосфорилируются сами по себе, чтобы инициировать каскады внутриклеточной киназы, такие как митоген-активированный протеинкиназный путь (MAPK)18,19.
Концевые внутриклеточные эффекторы этих каскадов могут затем фосфорилировать массив субстратов, таких как факторы транскрипции, РНК-связывающие, цитоскелетные и внеклеточные матриксные белки. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 и Sox926 относятся к числу факторов транскрипции, фосфорилированных в контексте черепно-лицевого развития. Эта посттрансляционная модификация (PTM) может непосредственно влиять на восприимчивость к альтернативным PTM, димеризацию, стабильность, расщепление и/или сродство связывания ДНК, среди других видов деятельности 20,21,25,26. Кроме того, РНК-связывающий белок Srsf3 фосфорилируется в контексте черепно-лицевого развития, что приводит к его ядерной транслокации27. В целом, было показано, что фосфорилирование РНК-связывающих белков влияет на их субклеточную локализацию, белково-белковые взаимодействия, связывание РНК и/или специфичность последовательности28. Кроме того, фосфорилирование актомиозина может привести к цитоскелетным перестройкам на протяжении всего черепно-лицевого развития29,30, а фосфорилирование белков внеклеточного матрикса, таких как небольшие интегрин-связывающие лиганд N-связанные гликопротеины, способствует биоминерализации во время развития скелета31. Из приведенных выше и многих других примеров очевидно, что существуют широкие последствия для фосфорилирования белка во время черепно-лицевого развития. Добавляя дополнительный уровень регуляции, фосфорилирование белка дополнительно модулируется фосфатазами, которые противодействуют киназам, удаляя фосфатные группы.
Эти события фосфорилирования как на уровне рецептора, так и на уровне эффекторной молекулы имеют решающее значение для распространения сигнальных путей и в конечном итоге приводят к изменениям в экспрессии генов в ядре, стимулируя специфические клеточные активности, такие как миграция, пролиферация, выживание и дифференцировка, которые приводят к правильному формированию лица млекопитающих. Учитывая контекстную специфичность белковых взаимодействий с киназами и фосфатазами, результирующие изменения в ПТМ и их влияние на активность клеток, крайне важно, чтобы эти параметры были изучены в физиологически значимых условиях, чтобы получить полное представление о вкладе событий фосфорилирования в черепно-лицевое развитие. Здесь приведены примеры двух контекстов, в которых изучаются фосфорилирование белков и, таким образом, активация сигнальных путей во время черепно-лицевого развития млекопитающих: лицевые процессы мыши, в частности верхнечелюстные процессы E11.5, и культивируемые эмбриональные клетки небной мезенхимы мыши, полученные из вторичных небных полок E13.5 - как первичных32 , так и увековеченных33 . При E11.5 верхнечелюстные отростки находятся в процессе слияния с боковыми и медиальными носовыми отростками1, тем самым представляя собой критическую временную точку во время черепно-лицевого развития мыши. Кроме того, здесь были выбраны верхнечелюстные процессы и клетки, полученные из небных полок, потому что последние структуры являются производными первых, тем самым предоставляя исследователям возможность исследовать фосфорилирование белка in vivo и in vitro в смежных контекстах. Однако этот протокол также применим к альтернативным процесскам лица и временным точкам развития.
Критическая проблема в изучении фосфорилированных белков заключается в том, что они легко дефосфорилируются во время выделения белка обильными фосфатазами окружающей среды. Для преодоления этого барьера обсуждаются адаптации и модификации стандартных лабораторных методов, позволяющих выделять фосфорилированные белки. Кроме того, предоставляется передовая практика для надлежащего анализа и количественной оценки фосфорилированных белков. Эти методы, особенно в сочетании с фармакологическими ингибиторами и/или мышиными генетическими моделями, могут быть использованы для получения более глубокого представления о динамике и роли различных сигнальных путей, активных во время черепно-лицевого развития.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block for mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>chemiluminescence imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, air jacket</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board, 11 x 13 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09 002 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95003001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z604062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for SDS-PAGE</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular ice pan, maxi 9 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350649020000000</td>
			<td>dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11 676 341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02 215 414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9358182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 6 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, polypropylene, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 9&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pouches, transparent, polyethylene lining</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small latex bulb, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 25 mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with luer tip, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot cassette opening lever</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4560000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann 3MM chr chromatography paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5422-25G</td>
			<td>stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC403140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>stock concentration 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>E7</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI32106</td>
			<td>low picogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-302B</td>
			<td>low femtogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610772</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2705HC</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 6N (certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56-500</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal Ca - 630 non-ionic detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19859650</td>
			<td>Nonidet P-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>stock concentration 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9102S</td>
			<td>1:1,000; anti-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB recombinant ligand, rat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>520BB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3169S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>stock concentration 100 U/mL, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC215740100</td>
			<td>PMSF; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9101S</td>
			<td>1:1,000, anti-phospho-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PDGF Receptor &#945; /PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3170S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution, 10%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (crystalline/biological,certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205330500</td>
			<td>Na3VO4; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610771</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioWorld</td>
			<td>21560033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot molecular weight marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female 129S4 mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis

Черепно-лицевое развитие млекопитающих представляет собой сложный морфологический процесс, в ходе которого несколько клеточных популяций координируются для создания фронтоназального скелета. Эти морфологические изменения инициируются и поддерживаются посредством различных сигнальных взаимодействий, которые часто включают фосфорилирование белка киназами. Здесь приведены два примера физиологически значимых контекстов, в которых можно изучать фосфорилирование белков во время черепно-лицевого развития млекопитающих: лицевые процессы мыши, в частности верхнечелюстные процессы E11.5, и культивируемые эмбриональные клетки небного мезенхима мыши, полученные из вторичных небных полок E13.5. Для преодоления общего барьера дефосфорилирования при выделении белка обсуждаются адаптации и модификации к стандартным лабораторным методам, позволяющим выделять фосфопротеины. Кроме того, предоставляются лучшие практики для надлежащего анализа и количественной оценки фосфопротеинов после западного блоттирования лизатов цельноклеточного белка. Эти методы, особенно в сочетании с фармакологическими ингибиторами и/или мышиными генетическими моделями, могут быть использованы для получения более глубокого понимания динамики и роли различных фосфопротеинов, активных во время черепно-лицевого развития.

При попытке охарактеризовать фосфорилирование белков, выделенных из лицевых процессов мыши и / или культивируемых клеток небной мезенхимы, репрезентативные результаты в идеале выявят отчетливую, воспроизводимую полосу после западного блоттинга антифосфопротеиновым антителом, кото?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

В протоколе представлен метод выделения лизатов цельноклеточного белка из рассеченных лицевых процессов эмбриона мыши или культивируемых эмбриональных клеток мезенхимы неба мыши и выполнения последующего вестерн-блоттинга для оценки уровней фосфорилированного белка.

Выделение лизатов цельноклеточного белка из процессов лица мыши и культивируемых клеток небной мезенхимы для анализа фосфопротеинов

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Этот протокол может быть использован для получения более глубокого понимания динамики и роли фосфопротеинов, активных во время черепно-лицевого развития млекопитающих. Этот протокол преодолевает общий барьер дефосфорилирования во время выделения белка из двух физиологически значимых контекстов, лицевых процессов мыши и культивируемых эмбриональных клеток небной мезенхимы мыши. Крайне важно быстро двигаться, сохраняя все реагенты и материалы на льду, и использовать ингибиторы фосфатазы во всех буферах лизиса для поддержания целостности фосфорилированных белков.Для начала положите тело мыши на рассекательную доску вентральной стороной вверх и опрыскайте брюшко мыши 70% этанолом. Затем откройте брюшную полость, защемляя и поднимая кожу спереди к влагалищному отверстию прямыми щипцами Семкена. Затем разрезайте поднятую кожу на нижележащие слои с помощью хирургических ножниц с прямым лезвием под углом 45 градусов с обеих сторон, чтобы создать V-образную форму, которая распространяется на каждую боковую поверхность примерно на полпути между четырьмя конечностями и задними конечностями.С помощью щипцов Семкена захватите один из рогов матки и срежьте хирургическими ножницами ниже яйцевода и над шейкой матки. Чтобы обеспечить полное удаление рога матки, отрежьте мезометрий, затем переведите рассеченный рог матки до 10 миллилитров гистологического PBS в 10-сантиметровой чашке Петри. Аналогично удаляют второй рог матки на противоположной стороне брюшной полости.После этого положите на лед 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую оба маточных рога. Под рассекающим стереомикроскопом тщательно рассекните каждый эмбрион из маточных рогов с помощью Дюмона 5 тонких щипцов. Затем медленно оттягивайте миометрий, децидууа и хорион.Затем порвите и удалите относительно прозрачный амнион, окружающий эмбрион, и разорвите пуповину, соединяющую эмбрион с плацентой. Затем перенесите каждый рассеченный эмбрион на 2,5 миллилитра гистологии PBS в индивидуальную лунку из 12-луночной клеточной культуральной пластины на льду с помощью разрезанной пластиковой трансферной пипетки. Приготовьте три 10-сантиметровые чашки Петри, содержащие 10 миллилитров гистологии PBS, и держите их на льду для использования во вращении между эмбрионами.Затем перенесите один эмбрион из индивидуального колодца 12-луночной клеточной культуральной пластины в одну из 10-сантиметровых чашек Петри с гистологией PBS на льду с помощью разрезанной пластиковой переносной пипетки. Под рассекающим микроскопом отделите каждый верхнечелюстной отросток от лица с помощью тонких щипцов, сначала сделав разрез на передней стороне одного верхнечелюстного отростка вдоль естественного углубления, отделяющего боковой носовой отросток в верхнечелюстном отростке. Далее разрезаем заднюю сторону верхнечелюстного отростка вдоль естественного углубления, разделяющего верхнечелюстной отросток и нижнечелюстной отросток.Затем полностью отделите верхнечелюстной отросток, сделав вертикальный разрез от передней до задней стороны верхнечелюстного отростка на глазной стороне верхнечелюстного отростка, где естественные углубления упоминаются выше, заканчиваются. Используя девятидюймовую пипетку Пастера с двухмиллилитровой маленькой латексной колбой, перенесите рассеченную пару верхнечелюстных отростков в небольшой капле примерно из 30 микролитров гистологии PBS в меченую 35-миллиметровую чашку Петри на льду. Затем переложите пару тканей верхнечелюстного процесса в меченую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку на льду с помощью пипетки Пастера, минимизируя перенос гистологии PBS.Кроме того, удалите все излишки гистологии PBS в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке с пипеткой Пастера. Добавьте 0,1 миллилитра ледяного буфера лизиса NP40 с ингибиторами протеазы и фосфатазы, добавленными непосредственно перед использованием на льду. Затем пипетка вверх и вниз 10 раз с помощью 200 микролитра PIPETMAN.Затем вихрь в течение 10 секунд, а затем пипетка вверх и вниз 10 раз с помощью 200 микролитра PIPETMAN, избегая при этом образования пузырьков. Инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение двух часов, вращая конец за концом, используя 1,5 миллилитра или два миллилитра весла с трубчатым револьвером. Затем центрифугируйте образцы при 13 500 х г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия и соберите супернатант в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку на льду с 200-миллилитровым PIPETMAN.Во-первых, аспирируйте среду из эмбриональных клеток небной мезенхимы мыши, используя 5,75-дюймовую пипетку Пастера, прикрепленную к вакуумной системе. Затем дважды промыть клетки ледяной культурой тканей PBS и наклонить пластину в сторону во время последней промывки, чтобы убедиться, что вся культура тканей PBS аспирирована. Затем добавьте ледяной буфер лизиса NP40 с ингибиторами протеазы и фосфатазы, добавленными непосредственно перед использованием на льду для лизирования клеток.Высиживайте пластину на льду в течение пяти минут с вращением примерно каждую минуту, чтобы обеспечить полное покрытие пластины. Затем соскоблите ячейки с пластины с помощью предварительно охлажденного подъемника и перенесите клеточную суспензию в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку на льду. После этого инкубируйте клеточную суспензию при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, вращая конец над концом, используя 1,5 миллилитра или два миллилитра весла с трубчатым револьвером.Затем центрифугируйте образцы при 13 500 х г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия и соберите супернатант в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку на льду с 200-миллилитровым PIPETMAN. Западный анализ лизатов целых клеток из увековеченных эмбриональных клеток небной мезенхимы мыши после стимуляции лигандом PDFG-B от 2 до 15 минут выявил отчетливые воспроизводимые полосы для фосфопротеинов, которые работают на высоте или вблизи высоты соответствующей общей белковой полосы. Увеличение интенсивности фосфопротеинового диапазона наблюдалось при лечении фактором роста по сравнению с таковыми у необработанных клеток, в то время как общие интенсивности белковой полосы были относительно равны между образцами.Этот протокол может быть использован для исследования того, как возмущения и фосфорилирование непосредственно влияют на межклеточную сигнализацию, экспрессию генов и клеточную активность в черепно-лицевых контекстах.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Эффективная изоляция функциональных островках из неонатальной мыши Поджелудочная железа

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Разделительный и анализ клеток поджелудочной железы мезенхимы с помощью проточной цитометрии

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Записи цельного клеточного зажима с изолированными первичными эпителиальными клетками от эпидидимиса

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Зика вирусной инфекции культурный человеческий мозг плода нервных стволовых клеток для иммуноцитохимическое анализа

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Вся гора иммунофлюоресценции и количественная оценка фолликула культивировали мыши яичников

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Изоляция и окрашивание мыши кожи кератиноцитов для клеточного цикла Специфический анализ выражения клеточного белка массой цитометрии

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Анализ развития сердечной камеры во время эмбриогенеза мыши с помощью эпифлуоресцентного вся гора

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Подготовка малых РНК-библиотек для секвенирования ранних эмбрионов мыши

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...