Name: isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00
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Los ratones 129S4 fueron un regalo del Dr. Philippe Soriano, de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. Este trabajo fue apoyado con fondos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH)/Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIDCR) R01 DE027689 y K02 DE028572 a K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. y F31 DE029364 a B.J.C.D.

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado y se realizaron de conformidad con las pautas y regulaciones institucionales. Se utilizaron ratones hembra 129S4 a los 1,5-6 meses de edad y alojados a una temperatura subteronetral de 21-23 °C para la recolección de embriones. Un flujo de trabajo esquemático del protocolo se representa en la Figura 1....

El protocolo descrito aquí permite a los investigadores sondear eventos críticos de señalización dependientes de la fosforilación durante el desarrollo craneofacial de una manera robusta y reproducible. Hay varios pasos críticos en este protocolo que aseguran la recopilación adecuada de datos y el análisis de los resultados. Ya sea aislando fosfoproteínas de procesos faciales de ratón y / o células mesenquimas palatales cultivadas, es imperativo moverse de manera rápida y eficiente mientras se mantienen todos...

El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. En el ratón, este proceso comienza en el día embrionario (E) 9.5 con la formación de la prominencia frontonasal y pares de procesos maxilares y mandibulares, cada uno de los cuales contiene células de la cresta neural craneal post-migratorias. Los procesos nasales laterales y mediales surgen de la prominencia frontonasal con la aparición de las fosas nasales y eventualmente se fusionan para formar las fosas nasales. Además, los procesos nasales mediales y los procesos maxilares se fusionan para generar el labio superior. Al mismo tiempo, la palatogénesis se inicia con la formación de distintas excrecencias, los estantes palatinos secundarios, desde el lado oral de los procesos maxilares en E11.5. Con el tiempo, los estantes palatinos crecen hacia abajo a ambos lados de la lengua, se elevan a una posición opuesta por encima de la lengua y, finalmente, se fusionan en la línea media para formar un paladar continuo que separa las cavidades nasales y orales por E16.51.
Estos cambios morfológicos a lo largo del desarrollo craneofacial se inician y mantienen a través de diversas interacciones de señalización, que a menudo incluyen la fosforilación de proteínas por quinasas. Por ejemplo, los receptores de la membrana celular, como las subfamilias de receptores β del factor de crecimiento transformador (TGF), incluidos los receptores de proteínas morfogenéticas óseas (BMPR) y varias familias de receptores tirosina quinasa (RTK), se autofosforilan al unirse y activarse en las células de la cresta neural craneal 2,3,4 . Además, el receptor transmembrana acoplado a la proteína G Smoothened se fosforila en las células de la cresta neural craneal y el ectodermo craneofacial aguas abajo del ligando Sonic Hedgehog (SHH) que se une al receptor Patched1, lo que resulta en una acumulación suavizada en la membrana ciliar y la activación de la vía SHH5. Tales interacciones ligando-receptor pueden ocurrir a través de la señalización autocrina, paracrina y / o yuxtacrina en contextos craneofaciales. Por ejemplo, se sabe que BMP6 señala de manera autocrina durante la diferenciación de condrocitos6, mientras que el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 8 se expresa en el ectodermo del arco faríngeo y se une a los miembros de la familia FGF de RTK expresados en el mesénquima del arco faríngeo de manera paracrina para iniciar el modelado y el crecimiento de los arcos faríngeos7, 8,9,10. Además, la señalización de Notch se activa tanto en condrocitos como en osteoblastos durante el desarrollo esquelético craneofacial a través de la señalización de yuxtacrina cuando los ligandos Transmembrana Delta y/o Jagged se unen a los receptores de Notch transmembrana en las células vecinas, que posteriormente se escindieron y fosforilan11. Sin embargo, hay otros pares de ligandos y receptores importantes para el desarrollo craneofacial que tienen la flexibilidad para funcionar tanto en la señalización autocrina como en la paracrina. Como ejemplo, durante la morfogénesis de los dientes murinos, se ha demostrado que el ligando del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-AA indica de manera autocrina para activar el RTK PDGFRα en el epitelio12 del órgano del esmalte. Por el contrario, en los procesos faciales murinos durante la mitad de la gestación, las transcripciones que codifican los ligandos PDGF-AA y PDGF-CC se expresan en el ectodermo craneofacial, mientras que el receptor PDGFRα se expresa en el mesénquima subyacente derivado de la cresta neural craneal, lo que resulta en una señalización paracrina 13,14,15,16,17 . Independientemente del mecanismo de señalización, estos eventos de fosforilación del receptor a menudo resultan en el reclutamiento de proteínas adaptadoras y / o moléculas de señalización, que con frecuencia se fosforilan para iniciar cascadas de quinasa intracelular, como la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK)18,19.
Los efectores intracelulares terminales de estas cascadas pueden fosforilar una serie de sustratos, como factores de transcripción, unión a ARN, proteínas citoesqueléticas y de matriz extracelular. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 y Sox9 26 se encuentran entre los factores de transcripción fosforilados en el contexto del desarrollo craneofacial. Esta modificación post-traduccional (PTM) puede afectar directamente la susceptibilidad a ptM alternativos, dimerización, estabilidad, escisión y/o afinidad de unión al ADN, entre otras actividades 20,21,25,26. Además, la proteína de unión al ARN Srsf3 se fosforila en el contexto del desarrollo craneofacial, lo que lleva a su translocación nuclear27. En general, se ha demostrado que la fosforilación de las proteínas de unión al ARN afecta su localización subcelular, las interacciones proteína-proteína, la unión al ARN y/o la especificidad de la secuencia28. Además, la fosforilación de la actomiosina puede conducir a reordenamientos citoesqueléticos a lo largo del desarrollo craneofacial29,30, y la fosforilación de proteínas de la matriz extracelular, como las pequeñas glicoproteínas ligadas al ligando a la ligando a integrinas N, contribuye a la biomineralización durante el desarrollo esquelético31. A través de lo anterior y muchos otros ejemplos, es evidente que hay amplias implicaciones para la fosforilación de proteínas durante el desarrollo craneofacial. Añadiendo un nivel adicional de regulación, la fosforilación de proteínas es modulada aún más por las fosfatasas, que contrarrestan las quinasas mediante la eliminación de grupos fosfato.
Estos eventos de fosforilación tanto a nivel de molécula receptora como efectora son críticos para la propagación de las vías de señalización y, en última instancia, dan lugar a cambios en la expresión génica en el núcleo, impulsando actividades celulares específicas, como la migración, la proliferación, la supervivencia y la diferenciación, que resultan en la formación adecuada de la cara del mamífero. Dada la especificidad del contexto de las interacciones de las proteínas con las quinasas y las fosfatasas, los cambios resultantes en los PTM y sus efectos sobre la actividad celular, es fundamental que estos parámetros se estudien en un entorno fisiológicamente relevante para obtener una comprensión completa de la contribución de los eventos de fosforilación al desarrollo craneofacial. Aquí, se proporcionan ejemplos de dos contextos en los que estudiar la fosforilación de proteínas y, por lo tanto, la activación de las vías de señalización durante el desarrollo craneofacial de mamíferos: los procesos faciales de ratón, en particular los procesos maxilares E11.5, y las células mesenquimas palatinas embrionarias de ratón cultivadas derivadas de E13.5 estantes palatinos secundarios, tanto primarios32 como inmortalizados33 . En E11.5, los procesos maxilares están en proceso de fusión con los procesos nasales laterales y mediales1, lo que representa un punto de tiempo crítico durante el desarrollo craneofacial del ratón. Además, los procesos maxilares y las células derivadas de los estantes palatinos se eligieron aquí porque las últimas estructuras son derivadas de las primeras, lo que brinda a los investigadores la oportunidad de interrogar la fosforilación de proteínas in vivo e in vitro en contextos relacionados. Sin embargo, este protocolo también es aplicable a procesos faciales alternativos y puntos de tiempo de desarrollo.
Un problema crítico en el estudio de las proteínas fosforiladas es que son fácilmente desfosforiladas durante el aislamiento de proteínas por abundantes fosfatasas ambientales. Para superar esta barrera, se discuten las adaptaciones y modificaciones a los métodos de laboratorio estándar que permiten el aislamiento de proteínas fosforiladas. Además, se proporcionan las mejores prácticas para el análisis y la cuantificación adecuados de las proteínas fosforiladas. Estas técnicas, particularmente en combinación con inhibidores farmacológicos y / o modelos genéticos murinos, se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de varias vías de señalización activas durante el desarrollo craneofacial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block for mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>chemiluminescence imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, air jacket</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board, 11 x 13 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09 002 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95003001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z604062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for SDS-PAGE</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular ice pan, maxi 9 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350649020000000</td>
			<td>dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11 676 341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02 215 414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9358182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 6 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, polypropylene, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 9&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pouches, transparent, polyethylene lining</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small latex bulb, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 25 mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with luer tip, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot cassette opening lever</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4560000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann 3MM chr chromatography paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5422-25G</td>
			<td>stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC403140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>stock concentration 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>E7</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI32106</td>
			<td>low picogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-302B</td>
			<td>low femtogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610772</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2705HC</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 6N (certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56-500</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal Ca - 630 non-ionic detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19859650</td>
			<td>Nonidet P-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>stock concentration 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9102S</td>
			<td>1:1,000; anti-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB recombinant ligand, rat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>520BB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3169S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>stock concentration 100 U/mL, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC215740100</td>
			<td>PMSF; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9101S</td>
			<td>1:1,000, anti-phospho-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PDGF Receptor &#945; /PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3170S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution, 10%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (crystalline/biological,certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205330500</td>
			<td>Na3VO4; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610771</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioWorld</td>
			<td>21560033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot molecular weight marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female 129S4 mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis

El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. Estos cambios morfológicos se inician y mantienen a través de diversas interacciones de señalización, que a menudo incluyen la fosforilación de proteínas por quinasas. Aquí, se proporcionan dos ejemplos de contextos fisiológicamente relevantes en los que estudiar la fosforilación de proteínas durante el desarrollo craneofacial de mamíferos: procesos faciales de ratón, en particular procesos maxilares E11.5, y células mesenquimas palatinas embrionarias de ratón cultivadas derivadas de estantes palatinos secundarios E13.5. Para superar la barrera común de la desfosforilación durante el aislamiento de proteínas, se discuten las adaptaciones y modificaciones a los métodos de laboratorio estándar que permiten el aislamiento de fosfoproteínas. Además, se proporcionan las mejores prácticas para el análisis y la cuantificación adecuados de las fosfoproteínas después de la eliminación occidental de lisados de proteínas de células enteras. Estas técnicas, particularmente en combinación con inhibidores farmacológicos y / o modelos genéticos murinos, se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de varias fosfoproteínas activas durante el desarrollo craneofacial.

Al intentar caracterizar la fosforilación de proteínas aisladas de procesos faciales de ratón y/o células mesenquimas palatales cultivadas, los resultados representativos idealmente revelarán una banda distinta y reproducible después de Western Blotting con un anticuerpo antifosfoproteína que corre a la altura o cerca de la altura de la banda de proteína total correspondiente (Figura 3 ). Sin embargo, si se produce una fosforilación extensa de la proteína, puede haber un ligero des...

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Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

El protocolo presenta un método para aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de embriones de ratón disecados o células mesenquimas palatales embrionarias de ratón cultivadas y realizar posterior western blotting para evaluar los niveles de proteína fosforilada.

Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Este protocolo se puede utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de las fosfoproteínas activas durante el desarrollo craneofacial de los mamíferos. Este protocolo supera la barrera común de la desfosforilación durante el aislamiento de proteínas de dos contextos fisiológicamente relevantes, los procesos faciales de ratón y las células de mesénquima palatal embrionarias de ratón cultivadas. Es imperativo moverse rápidamente mientras se mantienen todos los reactivos y materiales en hielo y usar inhibidores de la fosfatasa en todos los tampones de lisis para mantener la integridad de las proteínas fosforiladas.Para comenzar, coloque el cuerpo del ratón en una tabla de disección con el lado ventral hacia arriba y rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70%. Luego abra la cavidad abdominal pellizcando y levantando la piel anterior a la abertura vaginal con pinzas Semken rectas. A continuación, corte la piel levantada en las capas subyacentes con tijeras quirúrgicas de hoja recta en un ángulo de 45 grados a cada lado para generar una forma de V que se extienda a cada superficie lateral aproximadamente a medio camino entre las cuatro extremidades y las extremidades posteriores.Usando las pinzas Semken, agarre uno de los cuernos uterinos y corte debajo del oviducto y por encima del cuello uterino con tijeras quirúrgicas. Para permitir la extirpación completa del cuerno uterino, corte el mesometrio, luego transfiera el cuerno uterino diseccionado a 10 mililitros de histología PBS en una placa de Petri de 10 centímetros. Del mismo modo, retire el segundo cuerno uterino en el lado opuesto de la cavidad abdominal.Después, coloque la placa de Petri de 10 centímetros que contiene ambos cuernos uterinos sobre hielo. Bajo un microscopio estereoscópico de disección, diseccione cuidadosamente cada embrión de los cuernos uterinos con Dumont 5 fórceps finos. Luego retire lentamente el miometrio, la decidua y el corion.A continuación, rasgue y elimine el amnios relativamente transparente que rodea al embrión y corte el cordón umbilical que conecta el embrión con la placenta. Luego transfiera cada embrión diseccionado a 2.5 mililitros de PBS histológico en un pozo individual de una placa de cultivo celular de 12 pocillos en hielo usando una pipeta de transferencia de plástico cortada. Preparar tres placas de Petri de 10 centímetros que contengan 10 mililitros de HISTOLOGÍA PBS y mantenerlas en hielo para ser utilizadas en rotación entre embriones.Luego transfiera un embrión de un pozo individual de la placa de cultivo celular de 12 pocillos a una de las placas de Petri de 10 centímetros con PBS histológico en hielo utilizando una pipeta de transferencia de plástico cortado. Bajo el microscopio de disección, separe cada proceso maxilar de la cara usando los fórceps finos haciendo primero un corte en el lado anterior de un proceso maxilar a lo largo de la hendidura natural que separa el proceso nasal lateral en el proceso maxilar. A continuación, corte el lado posterior del proceso maxilar a lo largo de la hendidura natural que separa el proceso maxilar y el proceso mandibular.Luego, separe completamente el proceso maxilar haciendo un corte vertical de los lados anterior a posterior del proceso maxilar en el lado del ojo del proceso maxilar donde terminan las hendiduras naturales a las que se hace referencia anteriormente. Usando una pipeta Pasteur de nueve pulgadas con un bulbo de látex pequeño de dos mililitros, transfiera el par diseccionado de procesos maxilares en una pequeña gota de aproximadamente 30 microlitros de HISTOLOGÍA PBS a una placa de Petri de 35 milímetros etiquetada en hielo. Luego transfiera el par de tejidos de proceso maxilar a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros marcado en hielo utilizando la pipeta Pasteur, minimizando la transferencia de PBS histológico.Además, elimine cualquier exceso de PBS histológico en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con la pipeta Pasteur. Agregue 0.1 mililitro de tampón de lisis NP40 helado con inhibidores de proteasa y fosfatasa agregados inmediatamente antes de usarlos en hielo. Luego pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces con un PIPETMAN de 200 microlitros.A continuación, vórtice durante 10 segundos, y luego pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces con un PIPETMAN de 200 microlitros, evitando la generación de burbujas. Incuba a cuatro grados centígrados durante dos horas mientras giras de extremo a extremo usando una paleta de 1,5 mililitros o dos mililitros con un revólver de tubo. Luego centrifugue las muestras a 13, 500 x g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius y recoja el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros en hielo con un PIPETMAN de 200 mililitros.Primero, aspire el medio de las células del mesénquima palatino embrionario de ratón utilizando una pipeta Pasteur de 5,75 pulgadas unida a un sistema de vacío. Luego lave las células dos veces con PBS de cultivo de tejido helado y utilice la placa hacia un lado durante el último lavado para asegurarse de que todo el cultivo de tejido PBS se aspire. A continuación, agregue el tampón de lisis NP40 helado con inhibidores de proteasa y fosfatasa agregados inmediatamente antes de usarlos en hielo para lisar las células.Incubar la placa en hielo durante cinco minutos con rotación aproximadamente cada minuto para garantizar una cobertura completa de la placa. Luego raspe las células de la placa usando un elevador de células preenfriado y transfiera la suspensión de la celda a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros preenfriado en hielo. Después, incuba la suspensión celular a cuatro grados centígrados durante 30 minutos mientras giras de extremo a extremo con una paleta de 1,5 mililitros o dos mililitros con un revólver de tubo.Luego centrifugue las muestras a 13, 500 x g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius y recoja el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros en hielo con un PIPETMAN de 200 mililitros. El análisis de Western blot de lisados de células enteras de células embrionarias de ratón inmortalizadas en células del mesénquima palatal después de la estimulación con ligando PDFG-B de 2 a 15 minutos reveló distintas bandas reproducibles para las fosfoproteínas que se ejecutan a la altura o cerca de la altura de la banda de proteína total correspondiente. Se observó un aumento en las intensidades de la banda de fosfoproteínas en el tratamiento con un factor de crecimiento en comparación con las de las células no tratadas, mientras que las intensidades totales de la banda de proteínas fueron relativamente iguales entre las muestras.Este protocolo se puede utilizar para sondear cómo las perturbaciones y la fosforilación influyen directamente en la señalización intercelular, la expresión génica y la actividad celular en contextos craneofaciales.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Aislar y analizar células del páncreas mesénquima por Citometría de Flujo

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Grabaciones de parche de sujeción de células enteras de células epiteliales primarias aisladas del epidídimo

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Infección por el Virus Zika de células madre neurales de cerebro Fetal humano cultivadas para análisis de Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Aislamiento y tinción de queratinocitos de piel de ratón para el análisis específico del ciclo celular de la expresión de proteínacelular espora

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...