Name: isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

129S4 möss var en gåva från Dr Philippe Soriano, Icahn School of Medicine vid Mount Sinai. Detta arbete stöddes med medel från National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 och K02 DE028572 till K.A.F., F31 DE029976 till M.A.R. och F31 DE029364 till B.J.C.D.

Alla procedurer som involverar djur godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Colorado Anschutz Medical Campus och utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och föreskrifter. Kvinnliga 129S4-möss vid 1,5-6 månaders ålder och inrymda vid en sub-termoneutral temperatur på 21-23 ° C användes för embryoskördar. Ett schematiskt arbetsflöde för protokollet visas i bild 1. Se materialförteckningen för detaljer om allt...

Protokollet som beskrivs här gör det möjligt för forskare att undersöka kritiska fosforyleringsberoende signalhändelser under kraniofacial utveckling på ett robust och reproducerbart sätt. Det finns flera kritiska steg i detta protokoll som säkerställer korrekt insamling av data och analys av resultat. Oavsett om det isolerar fosfoproteiner från musens ansiktsprocesser och / eller odlade palatala mesenkymceller, är det absolut nödvändigt att röra sig snabbt och effektivt samtidigt som alla reagenser och ma...

Däggdjurs kraniofacial utveckling är en komplex morfologisk process under vilken flera cellpopulationer koordineras för att generera det frontonasala skelettet. I musen börjar denna process vid embryonal dag (E) 9,5 med bildandet av frontonasal framträdande och par av maxillära och mandibulära processer, som var och en innehåller post-migrerande kranial neurala vapenceller. De laterala och mediala nasala processerna härrör från frontonasal framträdande med utseendet på näsgroparna och så småningom smälter samman för att bilda näsborrarna. Vidare smälter de mediala nasala processerna och maxillära processer samman för att generera överläppen. Samtidigt initieras palatogenes med bildandet av distinkta utväxter - de sekundära palatala hyllorna - från den orala sidan av maxillära processer vid E11.5. Med tiden växer de palatala hyllorna nedåt på vardera sidan av tungan, lyfter till en motsatt position ovanför tungan och smälter så småningom samman vid mittlinjen för att bilda en kontinuerlig gom som skiljer näs- och munhålan med E16.51.
Dessa morfologiska förändringar under hela kraniofacial utveckling initieras och upprätthålls genom olika signalinteraktioner, som ofta inkluderar proteinfosforylering av kinaser. Till exempel är cellmembranreceptorer, såsom underfamiljer av transformerande tillväxtfaktor (TGF) -β receptorer, inklusive benmorfogenetiska proteinreceptorer (BMPR) och olika receptortyrosinkinas (RTK) -familjer, autofosforylerade vid ligandbindning och aktivering i kranial neurala vapenceller 2,3,4 . Dessutom blir den G-proteinkopplade transmembranreceptorn Smoothened fosforylerad i kranial neurala vapenceller och kraniofacial ektoderm nedströms Sonic hedgehog (SHH) ligandbindning till Patched1-receptorn, vilket resulterar i utjämnad ackumulering vid ciliary membranet och SHH-vägaktivering5. Sådana ligand-receptorinteraktioner kan ske genom autokrin, parakrin och/eller juxtacrinsignalering i kraniofaciala sammanhang. Till exempel är BMP6 känt för att signalera på ett autokrint sätt under kondrocytdifferentiering6, medan fibroblasttillväxtfaktor (FGF) 8 uttrycks i faryngealbågens ektoderm och binder till medlemmar av FGF-familjen av RTK uttryckt i faryngebågens mesenkym på ett parakrint sätt för att initiera mönstring och utväxt av faryngeala bågar7, 8,9,10. Dessutom aktiveras Notch-signalering i både kondrocyter och osteoblaster under kraniofacial skelettutveckling genom juxtacrinsignalering när transmembran delta och / eller Jagged ligander binder till transmembrana Notch-receptorer på angränsande celler, som därefter klyvs och fosforyleras11. Det finns dock andra ligand- och receptorpar som är viktiga för kraniofacial utveckling som har flexibiliteten att fungera i både autokrin och parakrin signalering. Som ett exempel, under murin tandmorfogenes, har trombocyt-härledd tillväxtfaktor (PDGF) -AA-ligand visat sig signalera på ett autokrint sätt för att aktivera RTK PDGFRα i emaljorganepitelet12. Däremot, i murina ansiktsprocesser under mitten av graviditeten, uttrycks transkript som kodar för liganderna PDGF-AA och PDGF-CC i kraniofacial ektoderm, medan PDGFRα-receptorn uttrycks i det underliggande kraniala neurala crest-härledda mesenkymet, vilket resulterar i parakrinsignalering 13,14,15,16,17 . Oavsett signalmekanism resulterar dessa receptorfosforyleringshändelser ofta i rekrytering av adapterproteiner och / eller signalmolekyler, som ofta fosforyleras själva för att initiera intracellulära kinaskaskader såsom den mitogenaktiverade proteinkinasvägen (MAPK)18,19.
De terminala intracellulära effektorerna för dessa kaskader kan sedan fosforylera en rad substrat, såsom transkriptionsfaktorer, RNA-bindande, cytoskelettala och extracellulära matrisproteiner. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 och Sox926 är bland transkriptionsfaktorerna fosforylerade i samband med kraniofacial utveckling. Denna post-translationella modifiering (PTM) kan direkt påverka mottagligheten för alternativa PTM, dimerisering, stabilitet, klyvning och / eller DNA-bindande affinitet, bland andra aktiviteter 20,21,25,26. Dessutom fosforyleras det RNA-bindande proteinet Srsf3 i samband med kraniofacial utveckling, vilket leder till dess kärntranslokation27. I allmänhet har fosforylering av RNA-bindande proteiner visat sig påverka deras subcellulära lokalisering, protein-proteininteraktioner, RNA-bindning och / eller sekvensspecificitet28. Vidare kan fosforylering av aktomyosin leda till cytoskelettomläggningar under hela kraniofacial utveckling29,30, och fosforylering av extracellulära matrisproteiner, såsom små integrinbindande ligand N-länkade glykoproteiner, bidrar till biomineralisering under skelettutveckling31. Genom ovanstående och många andra exempel är det uppenbart att det finns stora konsekvenser för proteinfosforylering under kraniofacial utveckling. Genom att lägga till en ytterligare regleringsnivå moduleras proteinfosforylering ytterligare av fosfataser, vilket motverkar kinaser genom att avlägsna fosfatgrupper.
Dessa fosforyleringshändelser på både receptor- och effektormolekylnivåer är avgörande för utbredningen av signalvägar och resulterar i slutändan i förändringar i genuttryck i kärnan, vilket driver specifika cellaktiviteter, såsom migration, proliferation, överlevnad och differentiering, vilket resulterar i korrekt bildning av däggdjurets ansikte. Med tanke på kontextspecificiteten hos proteininteraktioner med kinaser och fosfataser, de resulterande förändringarna i PTM och deras effekter på cellaktivitet är det viktigt att dessa parametrar studeras i en fysiologiskt relevant miljö för att få fullständig förståelse för bidraget från fosforyleringshändelser till kraniofacial utveckling. Här ges exempel på två sammanhang för att studera fosforylering av proteiner och därmed aktivering av signalvägar under däggdjurs kraniofacial utveckling: mus ansiktsprocesser, i synnerhet E11.5 maxillära processer, och odlade musembryonala palatala mesenkymceller härledda från E13.5 sekundära palatala hyllor - både primära32 och odödliga33 . Vid E11.5 håller maxillära processer på att smälta samman med de laterala och mediala nasala processerna1, vilket representerar en kritisk tidpunkt under musens kraniofaciala utveckling. Vidare valdes maxillära processer och celler härledda från palatala hyllor här eftersom de senare strukturerna är derivat av den förra, vilket ger forskare möjlighet att förhöra proteinfosforylering in vivo och in vitro i relaterade sammanhang. Detta protokoll är dock också tillämpligt på alternativa ansiktsprocesser och utvecklingstider.
Ett kritiskt problem med att studera fosforylerade proteiner är att de lätt defosforyleras under proteinisolering av rikliga miljöfosfataser. För att övervinna denna barriär diskuteras anpassningar och modifieringar av standardlaboratoriemetoder som möjliggör isolering av fosforylerade proteiner. Dessutom tillhandahålls bästa praxis för korrekt analys och kvantifiering av fosforylerade proteiner. Dessa tekniker, särskilt i kombination med farmakologiska hämmare och/eller murina genetiska modeller, kan användas för att få större insikt i dynamiken och rollerna hos olika signalvägar som är aktiva under kraniofacial utveckling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block for mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>chemiluminescence imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, air jacket</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board, 11 x 13 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09 002 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95003001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z604062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for SDS-PAGE</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular ice pan, maxi 9 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350649020000000</td>
			<td>dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11 676 341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02 215 414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9358182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 6 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, polypropylene, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 9&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pouches, transparent, polyethylene lining</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small latex bulb, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 25 mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with luer tip, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot cassette opening lever</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4560000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann 3MM chr chromatography paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5422-25G</td>
			<td>stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC403140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>stock concentration 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>E7</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI32106</td>
			<td>low picogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-302B</td>
			<td>low femtogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610772</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2705HC</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 6N (certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56-500</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal Ca - 630 non-ionic detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19859650</td>
			<td>Nonidet P-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>stock concentration 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9102S</td>
			<td>1:1,000; anti-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB recombinant ligand, rat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>520BB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3169S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>stock concentration 100 U/mL, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC215740100</td>
			<td>PMSF; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9101S</td>
			<td>1:1,000, anti-phospho-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PDGF Receptor &#945; /PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3170S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution, 10%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (crystalline/biological,certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205330500</td>
			<td>Na3VO4; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610771</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioWorld</td>
			<td>21560033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot molecular weight marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female 129S4 mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis

Däggdjurs kraniofacial utveckling är en komplex morfologisk process under vilken flera cellpopulationer koordineras för att generera det frontonasala skelettet. Dessa morfologiska förändringar initieras och upprätthålls genom olika signalinteraktioner, som ofta inkluderar proteinfosforylering av kinaser. Här ges två exempel på fysiologiskt relevanta sammanhang för att studera fosforylering av proteiner under däggdjurs kraniofacial utveckling: musens ansiktsprocesser, särskilt E11.5 maxillära processer, och odlade musembryonala palatala mesenkymceller härledda från E13.5 sekundära palatala hyllor. För att övervinna den gemensamma barriären för defosforylering under proteinisolering diskuteras anpassningar och modifieringar av standardlaboratoriemetoder som möjliggör isolering av fosfoproteiner. Dessutom tillhandahålls bästa praxis för korrekt analys och kvantifiering av fosfoproteiner efter western blotting av helcellsproteinlysater. Dessa tekniker, särskilt i kombination med farmakologiska hämmare och/eller murina genetiska modeller, kan användas för att få större insikt i dynamiken och rollerna hos olika fosfoproteiner som är aktiva under kraniofacial utveckling.

När man försöker karakterisera fosforyleringen av proteiner isolerade från musens ansiktsprocesser och /eller odlade palatala mesenkymceller, kommer de representativa resultaten idealiskt att avslöja ett distinkt, reproducerbart band efter western blotting med en antifosfoproteinantikropp som löper på eller nära höjden av motsvarande totala proteinband (figur 3 ). Om emellertid omfattande fosforylering av proteinet inträffar kan det finnas en liten uppåtgående förskjutning av fo...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Protokollet presenterar en metod för att isolera helcellsproteinlysater från dissekerade ansiktsprocesser för musembryon eller odlade musembryonala palatala mesenkymceller och utföra efterföljande western blotting för att bedöma fosforylerade proteinnivåer.

Isolering av helcellsproteinlysater från musens ansiktsprocesser och odlade palatala mesenkymceller för fosfoproteinanalys

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Detta protokoll kan användas för att få större insikt i dynamiken och rollerna hos fosfoproteiner som är aktiva under däggdjurskraniofacial utveckling. Detta protokoll övervinner den vanliga barriären för defosforylering under proteinisolering från två fysiologiskt relevanta sammanhang, mus ansiktsprocesser och odlade musembryonala palatala mesenkymceller. Det är absolut nödvändigt att röra sig snabbt samtidigt som alla reagenser och material hålls på is och att använda fosfatashämmare i alla lysbuffertar för att upprätthålla integriteten hos fosforylerade proteiner.Till att börja med, lägg muskroppen på en dissekeringsbräda med den ventrala sidan uppåt och spraya musens buk med 70% etanol. Öppna sedan bukhålan genom att klämma och lyfta huden främre till vaginalöppningen med raka Semken-pincett. Skär sedan den lyfta huden i underliggande lager med rak bladkirurgisk sax i 45 graders vinkel på vardera sidan för att generera en V-form som sträcker sig till varje sidoyta ungefär halvvägs mellan de fyra lemmarna och bakbenen.Använd Semken-tången, greppa ett av livmoderhornen och skär under äggledaren och ovanför livmoderhalsen med kirurgisk sax. För att möjliggöra fullständigt avlägsnande av livmoderhornet, skär bort mesometrium och överför sedan det dissekerade livmoderhornet till 10 ml histologi PBS i en 10 centimeter petriskål. På samma sätt ta bort det andra livmoderhornet på den motsatta sidan av bukhålan.Lägg sedan den 10 centimeter långa petriskålen som innehåller båda livmoderhornen på is. Under ett dissekerande stereomikroskop dissekerar du försiktigt ut varje embryo från livmoderhornen med Dumont 5 fina pincett. Dra sedan långsamt bort myometrium, decidua och chorion.Riv sedan och ta bort den relativt transparenta amnionen som omger embryot och skär av navelsträngen som förbinder embryot med moderkakan. Överför sedan varje dissekerat embryo till 2,5 ml histologi PBS i en individuell brunn av en 12-brunns cellodlingsplatta på is med hjälp av en skuren plastöverföringspipett. Förbered tre 10 centimeter petriskålar som innehåller 10 ml histologi PBS och håll dem på is för att användas i rotation mellan embryon.Överför sedan ett embryo från en enskild brunn av 12-brunnscellodlingsplattan till en av de 10 centimeter petriskålarna med histologi PBS på is med en skuren plastöverföringspipett. Under dissekeringsmikroskopet separerar du varje maxillär process från ansiktet med hjälp av de fina tångarna genom att först göra ett snitt på den främre sidan av en maxillär process längs den naturliga indragningen som skiljer den laterala nasala processen i maxillärprocessen. Skär sedan den bakre sidan av maxillärprocessen längs den naturliga indragningen som skiljer maxillärprocessen och den mandibulära processen.Separera sedan maxillärprocessen helt genom att göra ett vertikalt snitt från de främre till bakre sidorna av maxillärprocessen på ögonsidan av maxillärprocessen där de naturliga indragningarna som refereras ovan slutar. Använd en nio tums Pasteur-pipett med en två milliliter liten latexlampa, överför det dissekerade paret maxillära processer i en liten droppe på cirka 30 mikroliter av histologi PBS till en märkt 35 millimeter petriskål på is. Överför sedan paret av maxillära processvävnader till ett märkt 1,5 ml mikrocentrifugrör på is med Pasteur-pipetten, vilket minimerar överföringen av histologi PBS.Ta vidare bort eventuellt överskott av histologi PBS i 1,5 ml mikrocentrifugröret med Pasteur-pipetten. Tillsätt 0,1 ml iskall NP40-lysbuffert med proteas och fosfatashämmare tillsatt omedelbart före användning på is. Pipettera sedan upp och ner 10 gånger med en 200 mikroliter PIPETMAN.Därefter virvel i 10 sekunder och pipettera sedan upp och ner 10 gånger med en 200 mikroliter PIPETMAN, samtidigt som man undviker generering av bubblor. Inkubera vid fyra grader Celsius i två timmar medan du roterar ände-över-ände med en 1,5 milliliter eller två milliliter paddel med en rörrevolver. Centrifugera sedan proverna vid 13 500 x g i 20 minuter vid fyra grader Celsius och samla supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör på is med en 200 ml PIPETMAN.Aspirera först mediet från musens embryonala palatala mesenkymceller med hjälp av en 5,75 tums Pasteur-pipett fäst vid ett vakuumsystem. Tvätta sedan cellerna två gånger med iskall vävnadskultur PBS och luta plattan åt sidan under den sista tvätten för att säkerställa att all vävnadsodling PBS aspireras. Tillsätt sedan iskall NP40-lysbuffert med proteas och fosfatashämmare tillsatt omedelbart före användning på is för att lysera cellerna.Inkubera plattan på is i fem minuter med rotation ungefär varje minut för att säkerställa fullständig täckning av plattan. Skrapa sedan cellerna från plattan med en förkyld celllyftare och överför cellsuspensionen till ett förkylt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör på is. Inkubera sedan cellsuspensionen vid fyra grader Celsius i 30 minuter medan du roterar ände-över-ände med en 1,5 milliliter eller två milliliter paddel med en rörrevolver.Centrifugera sedan proverna vid 13 500 x g i 20 minuter vid fyra grader Celsius och samla supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör på is med en 200 ml PIPETMAN. Western blot-analys av helcellslysater från odödliga musembryonala palatala mesenkymceller efter stimulering med PDFG-B-ligand från 2 till 15 minuter avslöjade distinkta reproducerbara band för fosfoproteiner som löper på eller nära höjden av motsvarande totala proteinband. En ökning av fosfoproteinbandintensiteter observerades vid behandling med en tillväxtfaktor jämfört med obehandlade celler, medan totala proteinbandintensiteter var relativt lika mellan proverna.Detta protokoll kan användas för att undersöka hur störningar och fosforylering direkt påverkar intercellulär signalering, genuttryck och cellulär aktivitet i kraniofaciala sammanhang.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektiv isolering av funktionella cellöar från nyfödda mus bukspottkörteln

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolera och analysera celler i bukspottkörteln mesenkym med flödescytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Hela cell Patch-clamp inspelningar av isolerade primära epitelceller från epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus infektion av odlade mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller för Immunocytochemical analys

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hela berget immunofluorescens och follikeln kvantifiering av odlade mus äggstockarna

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolering och färgning av mus hud keratinocyter för cell Cycle specifik analys av cellulära protein uttryck av Masscytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analys av hjärtats kammare utveckling under musen embryogenes använder hela Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Beredning av små RNA-bibliotek för sekvensering från tidiga musembryon

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...