Name: measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وبرنامج البحوث الداخلية (IRP) ، المعهد الوطني للشيخوخة (NIA). تم دعم ملاحظة من قبل منح زخم طول العمر ، وبرنامج علماء مكتب المكملات الغذائية (ODS). تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com.

ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات.

pSILAC هي تقنية قوية تمكن من القياس الكمي العالمي لمعدلات دوران البروتين عبر ظروف خلوية متعددة. تفصل هذه الورقة استخدام pSILAC لمقارنة نصف عمر البروتين العالمي بين الخلايا الشائخة والهادئة ، بما في ذلك تعليمات لإعداد الخلايا الشائخة والهادئة ، ووضع العلامات على SILAC وحصادها ، وفي النهاية التحليل باستخدام الطيف الكتلي DDA. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف اختبار من خطوتين للتحقق من صحة النمط الظاهري للشيخوخة باستخدام تحليل SA-βGal و RT-qPCR لمجموعة من mRNAs التي تشفر البروتينات المرتبطة بالشيخوخة. بالإضافة إلى التحقق من صحة الشيخوخة باستخدام النهجين الموصوفين ، يمكن إجراء فحص ثالث للشيخوخة بعد تحليل الطيف الكتلي من خلال البحث عن التغيرات في علامات الشيخوخة المعروفة بين الخلايا الشائخة والهدوء على المستوى البروتيني. تشمل البروتينات المرتبطة بالشيخوخة التي من المتوقع أن تكون مرتفعة p16 و p21 و BCL2 ، من بين أمور أخرى ، موصوفة في مكان آخر44,45. في البروتوكول الموصوف أعلاه ، تم استخدام الإشعاع المؤين لتحريض الشيخوخة وتجويع المصل للخلايا الهادئة. لتحريض الشيخوخة ، هناك خيارات متعددة متاحة وهناك عدم تجانس كبير فيما بينها 41،42،46. حاليا ، لا توجد طريقة للشيخوخة تعتبر "الأكثر فسيولوجية" ، لذلك يعتمد اختيار محفز الشيخوخة إلى حد كبير على سياق التجربة. ومع ذلك ، يوصى بإجراء تجارب بهدف تحديد ظاهرة عامة حول الشيخوخة لاستخدام اثنين على الأقل من محفزات الشيخوخة المختلفة. إن مناقشة مجموعة نماذج الشيخوخة خارج نطاق هذه الورقة ، ولكن بعض الطرق الشائعة للحث على الشيخوخة تشمل إثارة تلف الحمض النووي (الأشعة تحت الحمراء ، دوكسوروبيسين ، استنفاد النسخ التكراري) ، والتعبير عن البروتينات السرطانية (HRAS ، BRAF) ، وتعطيل وظيفة الميتوكوندريا2.
بالإضافة إلى اختيار محفز الشيخوخة ، فإن اختيار خلايا التحكم هو اعتبار مهم بنفس القدر. الخلايا الشائخة ، بحكم تعريفها ، تحت توقف النمو إلى أجل غير مسمى ، لذلك غالبا ما يتم اختيار مقارنة مع الخلايا الأخرى الموقوفة عن النمو. بالنسبة ل pSILAC ، تكون الخلايا الموقوفة عن دورة الخلية مفضلة بشكل عام لأنها لا تتكاثر وبالتالي يسهل استخدامها في حسابات نصف عمر البروتين47. ومع ذلك ، نظرا لأن الخلايا المستزرعة غالبا ما تحتفظ ببعض الخلايا المنقسمة ، فمن المهم أن الطرق المستخدمة للحث على إيقاف دورة الخلية تنتج استجابة متجانسة قدر الإمكان لتقليل الخطأ من الخلايا التي لا تزال تتكاثر. لحساب معدلات تحلل البروتين لخلايا ركوب الدراجات باستخدام pSILAC يتطلب حسابات إضافية للتعويض عن المعدل الذي يتم فيه تخفيف البروتين إلى خلايا ابنة27. ومع ذلك ، فإن توقف النمو الهادئ نفسه لا يخلو من المضاعفات. هناك طريقتان عامتان لاعتقال دورة الخلية: الحرمان من المصل وتثبيط الاتصال48. لا يمكن جعل جميع الخلايا هادئة من خلال تثبيط الاتصال ، على الرغم من أن بعض الخلايا الليفية قد ثبت أنها تظهر الهدوء بعد عدة أيام من زراعة49. استخدمت هذه الطريقة الحرمان من المصل لأنه يستخدم بشكل أكثر شيوعا لمقارنات الخلايا الشائخة ، على الرغم من أنه يتطلب أن تكون الخلية الشائخة محرومة من المصل بشكل مماثل لإجراء مقارنات دقيقة. ينشط المصل مجمع mTOR ، وبالتالي فإن الحرمان من المصل له العديد من التأثيرات النهائية على الخلية بالإضافة إلى إيقاف دورة الخلية50. والجدير بالذكر أن الخلايا الشائخة أظهرت انخفاضا في SASP عند الحرمان من المصل أو تثبيط mTOR51,52.
نقطة أخرى مهمة يجب مراعاتها في pSILAC هي عدد النقاط الزمنية للاختبار. جمع هذا البروتوكول الخلايا في نقطة زمنية واحدة (3 أيام من وضع العلامات الخفيفة أو الثقيلة) ، مما يبسط التحليل الناتج بشكل كبير. يجب أن يعتمد اختيار النقطة الزمنية على الهدف من التجربة. بالنسبة للتحليل العالمي ، من المتوقع أن تلتقط 3 أيام غالبية البروتينات ، على الرغم من أنه لا يمكن قياس نصف العمر للبروتينات قصيرة العمر التي تتحول بالكامل في غضون 3 أيام (يتم فقدان جميع الإشارات الضوئية) في هذه المرحلة الزمنية. على العكس من ذلك ، من الصعب أيضا تحديد كمية البروتينات طويلة العمر ذات الدوران القليل جدا في 3 أيام وغالبا ما تظهر على أنها ذات عمر نصف كبير للغاية (في ترتيب أسابيع) والتي عادة ما تكون مجرد نتيجة لتراكم إشارات ثقيلة قليلة جدا. نظرا للعلاقة غير الخطية في نسبة إشارات الببتيد الثقيلة والخفيفة مقابل النسبة المئوية للبروتين الذي تم تصنيعه حديثا في نقاط زمنية أقصر وأطول ، يمكن تحسين كمية نصف العمر عن طريق إضافة نقاط زمنية إضافية لوضع العلامات. بالنسبة للمقارنات النسبية بين حالتين خليتين ، كما هو الحال في هذا البروتوكول ، قد يكون عمر النصف التقريبي كافيا ، ولكن يمكن استخدام نقاط زمنية إضافية لتحسين الدقة الكمية.
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحليل غير مستهدف يستند إلى DDA لدوران البروتين. ومع ذلك ، يمكن تطبيق حسابات دوران البروتين بشكل عام على أي مخطط اقتناء قادر على اشتقاق الوفرة النسبية لأزواج الببتيد الثقيلة والخفيفة. على سبيل المثال ، يمكن أيضا تطبيق الأساليب المستندة إلى MS2 مثل الاستحواذ المستقل عن البيانات (DIA / SWATH) لحساب معدلات دوران بنجاح53. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام أجهزة وخطوط أنابيب البرامج بخلاف تلك الموضحة في هذا البروتوكول لإجراء تحليل DDA وتحديد البروتين وتحديد كمية البروتين. عند استخدام منصات برامج قياس كمية البروتين مثل Skyline لاستخراج مناطق ذروة الببتيد ، ينصح بفحص كروماتوغرام الأيونات المستخرجة يدويا في مساحة عمل المستند ، وتحديد القمم التي تم دمجها بشكل خاطئ والقمم غير الكمية ، وتنظيم المستند وفقا لذلك. تتوفر مجموعة واسعة من البرامج التعليمية عبر الإنترنت ل Skyline (skyline.ms).
يمثل pSILAC واحدة من أكثر الطرق مثالية للقياس الكمي العالمي لنصف عمر البروتين في الخلايا المستزرعة بسبب الإرسال المتعدد المتفوق (تغطية البروتين) والإنتاجية. في حين أن pSILAC لا يوفر معدلات مباشرة للتوليف أو التدهور ، نظرا لأن التغيير في الإشارة الخفيفة والثقيلة يرجع إلى التقاء العوامل ، فإن pSILAC مفيد للغاية للمقارنات بين الظروف وأنواع الخلايا المختلفة. غالبا ما تقع الطرق منخفضة الإنتاجية في نوعين: 1) علاج الخلايا بالسيكلوهيكسيميد لمنع تخليق البروتين وحصاده على فترات زمنية بعد الإضافة إلى مراقبة الاضمحلال ، أو 2) علاج الخلايا بمثبط لاضمحلال البروتين والحصاد على فترات زمنية بعد الإضافة لمراقبة تراكم البروتين ، وبالتالي استنتاج معدلات تحلل البروتين. الحد من كلتا الطريقتين هو أن مثل هذه العلاجات ستسبب حتما تغييرات كبيرة في علم وظائف الأعضاء الخلوية. وعلى النقيض من ذلك، لا يتطلب pSILAC تدخلا كبيرا وليس له نظريا أي آثار يمكن اكتشافها على علم وظائف الأعضاء الخلوية لأن الأحماض الأمينية النظيرية تختلف بمقدار نيوترون واحد فقط عن نظيراتها غير النظيرية. وبالتالي ، فإن الطريقة الموصوفة هنا ل pSILAC تمثل بروتوكولا بسيطا للقياس العالمي لنصف عمر البروتين الأكثر فسيولوجية في الخلايا غير المنقسمة.
التغيرات في دوران البروتين لها علاقة وثيقة بالشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر والتنكس العصبي وطول العمر54,55. يصف هذا البروتوكول طريقة لاستجواب هذه العلاقات باستخدام وسم النظائر المستقرة للأحماض الأمينية في زراعة الخلايا لقياس معدلات دوران البروتين في خلايا الشيخوخة. ومع ذلك ، توجد العديد من الطرق المماثلة لإجراء دراسات في سياق الشيخوخة والتنكس العصبي في الجسم الحي في الكائنات الحية بأكملها مثل الفئران. في الواقع ، أكدت هذه الدراسات على أهمية قياس معدلات دوران البروتين في سياق الأمراض المرتبطة بالعمر56،57،58،59.
في هذه الدراسة ، برزت البروتينات الريبوسومية والبروتينات الموجودة في الشبكة الإندوبلازمية كفئتين من البروتينات مع انخفاض وزيادة عمر النصف في الخلايا الشائخة ، على التوالي. في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من التحليل لمستويات الحالة الثابتة للحصول على استنتاجات نهائية ، فإن هذه النتائج تشير أيضا إلى أن الخلايا الشائخة قد تنظم الترجمة بشكل فريد من خلال انخفاض عمر النصف للبروتينات الريبوسومية. ومن الآن فصاعدا، فإن تطبيق نهج وضع العلامات المستقرة على النظائر لدراسة العلاقة بين الشيخوخة الخلوية والتنكس العصبي في الجسم الحي في نماذج الفئران سيكون امتدادا واعدا لنهج وسم النظائر الموصوفة في هذا البروتوكول.

تم تحديد الشيخوخة لأول مرة على أنها حالة من توقف النمو إلى أجل غير مسمى أظهرتها الخلايا الأولية المستزرعة بعد الوصول إلى الإرهاق التكراري1. وقد تبين منذ ذلك الحين أن الشيخوخة يمكن أن تنشأ استجابة للعديد من الإهانات الخلوية ، بما في ذلك الضغوط السامة والميتوكوندريا والأورام ، من بين أمور أخرى2. في حين أن الشيخوخة لها العديد من الأدوار المهمة من الناحية الفسيولوجية ، مثل قمع الورم والتئام الجروح ، فإن تراكم الخلايا الشائخة أثناء الشيخوخة يرتبط بمجموعة من الآثار الضارة على الصحة3 ، بما في ذلك العديد من الحالات العصبية التنكسية4،5،6. يحدث الشيخوخة الخلوية في أنواع متعددة من خلايا الدماغ ، بما في ذلك الخلايا العصبية7،8،9،10 ، والخلايا النجمية 11 ، والخلايا الدبقية الصغيرة 12 ، وسلائف الخلايا قليلة التغصن 13 ، وتساهم في التنكس العصبي والخلل المعرفي. وقد ثبت أن قلة الأميلويد بيتا ، وهي واحدة من السمات المميزة لمرض الزهايمر14 ، تسرع الشيخوخة العصبية13،15،16. كما ارتبط الانتشار المتزايد للخلايا الشائخة بمرض باركنسون17 ، وخاصة الناشئة عن الضغوطات البيئية11,18. الأهم من ذلك ، أن القضاء الانتقائي على الخلايا الشائخة في النماذج قبل السريرية يطيل العمر ويخفف من العديد من الأمراض المرتبطة بالعمر3،5،12 ويحسن العجز المعرفي8،11،12،13. وهكذا برزت الخلايا الشائخة كأهداف علاجية واعدة لعلاج العديد من الحالات المرتبطة بالعمر.
يحدث الكثير من التأثير الضار للخلايا الشائخة بسبب النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) ، وهو خليط معقد من الجزيئات النشطة بيولوجيا التي تفرزها الخلايا الشائخة التي يمكن أن تسبب التهابا موضعيا ، وتولد الأوعية الدموية ، وتدمير المصفوفة خارج الخلية ، وانتشار الشيخوخة في الأنسجة المحيطة19،20،21 . يمثل SASP أيضا ظاهرة بيولوجية مثيرة للاهتمام للشيخوخة لأنه يتطلب جهدا كبيرا في النسخ والترجمة أثناء حالة توقف دورة الخلية. في الواقع ، ثبت أن الخلايا الشائخة تظهر انخفاضا في التكوين الحيوي للريبوسوم 22،23،24 التي يجب أن تقلل من تخليق البروتين. بدلا من ذلك ، تترجم الخلايا الشائخة بقوة بعض البروتينات ، وخاصة عوامل SASP ، وتؤثر على عملية التمثيل الغذائي للأنسجة المحيطة25. وبالتالي ، هناك اهتمام كبير بفهم كيف تستمر الخلايا الشائخة التي تخضع لتوقف دائم في دورة الخلية في الحفاظ على توازن البروتين بينما تعبر في الوقت نفسه بقوة عن عوامل SASP وغيرها من البروتينات المختارة.
تصف هذه الطريقة كيفية استخدام قياس الطيف الكتلي ووضع العلامات على النظائر المستقرة نبضيا بواسطة الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (pSILAC) لقياس نصف عمر البروتينات في الخلايا الشائخة على نطاق واسع من البروتيوم على نطاق واسع من البروتينات. في SILAC التقليدي ، يتم تصنيف الخلايا المستزرعة بالكامل بشكل استقلابي مع نظائر ثقيلة وخفيفة غير مشعة من الأحماض الأمينية للتحليل النهائي لوفرة البروتين. تم تطبيق هذه الطريقة سابقا لتقييم تغيرات الوفرة بشكل شامل وكمي في SASP للخلايا الليفية المستزرعة26. في pSILAC ، يتم تصنيف الخلايا بشكل مماثل على التمثيل الغذائي مع نبضة من النظائر الثقيلة التي تتبع وضع العلامات مسبقا مع النظير الخفيف ، ثم يتم حصادها على فترات زمنية واحدة أو أكثر. ثم تستخدم معدلات دمج النظائر الثقيلة في إشارة إلى النظائر الخفيفة الموجودة مسبقا لحساب معدلات دوران البروتين النسبية. بشكل عام ، يتم استخدام نظائر الأرجينين والليسين لأن التربسين يشق في تلك المخلفات. وبالتالي ، فإن جميع الببتيدات من الهضم القياسي من المحتمل أن تحتوي على التسمية الثقيلة. أزواج الببتيدات التي تختلف فقط عن طريق وجود أو عدم وجود ليسين ثقيل أو أرجينين متطابقة كيميائيا ويمكن تمييزها وتحديدها كميا بواسطة مطياف الكتلة. وبعد تحليل قياس الطيف الكتلي، يمكن تحديد الببتيدات على أنها مركبة حديثا أو موجودة مسبقا استنادا إلى وجود أو عدم وجود الملصق النظيري في عمليات تحديد الببتيد الناتجة. يمكن بعد ذلك تحديد معدلات دوران البروتين عن طريق تركيب نسبة الببتيدات الثقيلة (13 C-15 N) على الببتيدات الخفيفة (12 C-14N) لبروتين معين إلى النماذج الحركية للنمو الأسي أو الاضمحلال27,28. تم استخدام pSILAC في عدة مقارنات لمعدلات دوران البروتين29،30،31،32 وهي حاليا الطريقة الأكثر شمولا وعالية الإنتاجية لقياس عمر نصف البروتين .
يفصل هذا البروتوكول إعداد الخلايا الشائخة بالتوازي مع الخلايا الهادئة المماثلة التي يتم إيقافها للنمو في المزرعة ، تليها العلامات الأيضية باستخدام pSILAC. ثم يتم حصاد الخلايا وتجانسها إلى ليزات ومعالجتها للحصول على مطياف الكتلة وتحليلها. ثم تستخدم البيانات التي تم الحصول عليها من قياس الطيف الكتلي لتحديد نصف عمر البروتين باستخدام طريقة كمية مبسطة تستخدم نقطة زمنية واحدة وحسابات نصف العمر التي يتم إجراؤها في جدول بيانات. باستخدام هذا النهج ، يمكن قياس تقديرات نصف عمر البروتين بطريقة شاملة وكمية أكثر أصالة للظروف الخلوية غير المضطربة من البروتوكولات التي تستخدم حاصرات تخليق البروتين أو دورانه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammacel 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td></td>
			<td>Cesium Irradiator for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-90 primary lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iRT Kit (indexed retention time)</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td>Indexed Retention Time Peptide Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>423835000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Mascot Daemon 2.8</td>
			<td>Proteomic database searching software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q Exactive HF Orbitrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>327110025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline</td>
			<td>University of Washington</td>
			<td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td>
			<td>Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator waterbath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-516R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Referred to as phenol in text; hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPle Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (sequencing grade)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry

أظهرت الأدلة المتزايدة أن تراكم الخلايا الشائخة في الجهاز العصبي المركزي يساهم في الاضطرابات العصبية التنكسية مثل مرض الزهايمر وأمراض باركنسون. الشيخوخة الخلوية هي حالة من توقف دورة الخلية الدائمة التي تحدث عادة استجابة للتعرض لضغوط شبه مميتة. ومع ذلك ، مثل الخلايا الأخرى غير المنقسمة ، تظل الخلايا الشائخة نشطة استقلابيا وتؤدي العديد من الوظائف التي تتطلب متطلبات نسخ وانتقالية فريدة وتغييرات واسعة النطاق في البروتينات داخل الخلايا والمفرزة. إن فهم كيفية تغير تخليق البروتين ومعدلات الاضمحلال أثناء الشيخوخة يمكن أن يسلط الضوء على الآليات الأساسية للشيخوخة الخلوية وإيجاد طرق علاجية محتملة للأمراض التي تتفاقم بسبب الخلايا الشائخة. تصف هذه الورقة طريقة لتقييم نصف عمر البروتين على نطاق البروتين في الخلايا غير المنقسمة باستخدام وسم النظائر المستقرة النبضية بواسطة الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (pSILAC) بالاشتراك مع قياس الطيف الكتلي. يتضمن pSILAC وضع العلامات الأيضية للخلايا ذات الإصدارات المستقرة المحتوية على النظائر الثقيلة من الأحماض الأمينية. إلى جانب أساليب قياس الطيف الكتلي الحديثة ، تمكن pSILAC من قياس دوران البروتين لمئات أو آلاف البروتينات في مخاليط معقدة. بعد وضع العلامات الأيضية ، يمكن تحديد ديناميكيات دوران البروتينات بناء على الإثراء النسبي للنظائر الثقيلة في الببتيدات المكتشفة بواسطة مطياف الكتلة. في هذا البروتوكول ، يتم وصف سير العمل لتوليد ثقافات الخلايا الليفية الشائخة والخلايا الليفية الهادئة التي تم اعتقالها بشكل مماثل ، بالإضافة إلى مسار زمني مبسط لوسم pSILAC بنقطة واحدة يزيد من تغطية معدلات دوران البروتين المتوقعة. وعلاوة على ذلك، يقدم خط أنابيب لتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي pSILAC وحساب سهل الاستعمال لمعدلات تحلل البروتين باستخدام جداول البيانات. يمكن توسيع تطبيق هذا البروتوكول إلى ما وراء الخلايا الشائخة إلى أي خلايا مستزرعة غير منقسمة مثل الخلايا العصبية.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

يصف هذا البروتوكول سير العمل لوضع العلامات الأيضية للخلايا الشائخة وغير المنقسمة باستخدام SILAC النبضي ، وتحليل مطياف الكتلة غير المستهدف ، وحساب مبسط لعمر نصف البروتين .

قياس معدلات دوران البروتين في الخلايا المستزرعة الشائخة وغير المنقسمة مع وضع العلامات الأيضية وقياس الطيف الكتلي

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

كيف تحافظ الخلايا على توازن البروتين ليست مفهومة جيدا في سياق الإجهاد الخلوي والشيخوخة. في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة بسيطة ودقيقة لحساب دوران البروتين ، وهو عنصر رئيسي في توازن البروتين في الخلايا الحية. يمنح Pulse SILAC المجرب القدرة على قياس دوران البروتين للبروتينات الفردية والبروتيوم بأكمله بطريقة عالية الإنتاجية تكون أيضا أكثر أصالة للأنظمة البيولوجية من الطرق الأخرى.يمكن تطبيق مبادئ هذه الطريقة على أي نظام يمكن تصنيفه استقلابيا ، بما في ذلك الكائنات الحية بأكملها. يمكن أن تؤدي هذه الطريقة أيضا إلى رؤى حول الشيخوخة الخلوية والشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية. تحليل قياس الطيف الكتلي حساس للغاية لبعض الملوثات الكيميائية، مثل المنظفات.استخدم كواشف LC-MS طوال هذا الإجراء لضمان جمع بيانات عالية الجودة. لبدء وضع العلامات الأيضية للخلايا ، استبدل الوسائط بثلاث لوحات لكل من الخلايا الشائخة والهادئة ب 30 ملليلتر من وسائط SILAC Light. بشكل منفصل ، استبدل الوسط بثلاثة ألواح قديمة وثلاث لوحات هادئة ب 30 ملليلتر من SILAC Heavy.تنمو الخلايا لمدة ثلاثة أيام دون تغيير الوسط. لفصل الخلايا عن ألواح الاستزراع ، أضف خمسة ملليلترات من كاشف التربسين المسخن مسبقا إلى كل صفيحة واحتضن الألواح لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. في وقت لاحق ، أعد تعليق الخلايا المنفصلة في خمسة ملليلتر من نفس الوسائط المستخدمة في الزراعة إلى حجم إجمالي قدره 10 ملليلتر.بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى الجليد وقم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 300 مرة G عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الكريات مرتين ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وإزالة supernatant قبل إعادة تعليق الكريات في 150 ميكرولتر من اليوريا الثمانية المولية الطازجة و 50 ملليمولار الأمونيوم بيكربونات العازلة. امزج محتوى الأنبوب عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.Aliquot 50 ميكروغرام من عينة البروتين في أنبوب جديد ويجلب عينات تصل إلى أحجام متساوية مع المخزن المؤقت للتحليل. ثم أضف ثنائي إيثيوثريتول إلى تركيز نهائي قدره 20 ملليمول إلى الأنبوب واحتضن العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز. اترك العينة لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل إضافة يودواسيتاميد إلى تركيز نهائي يبلغ 40 ملليمول واحتضانه في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.ثم قم بتخفيف العينة إلى أقل من اليوريا ذات المولي الواحد باستخدام مخزن مؤقت لبيكربونات الأمونيوم 50 ملليمولار. أضف ميكروغرام واحد من التربسين للحصول على 50 ميكروغرام من بروتين البدء أو بنسبة 1:50 التربسين إلى البروتين إلى العينة. احتضن العينة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لهضم البروتينات إلى ببتيدات.في اليوم التالي ، أضف حمض الفورميك إلى 1٪ من حجم العينة لإخماد هضم البروتين. لتنظيف العينة، ضع خرطوشة استخراج ذات طور صلب على مشعب فراغ، باستخدام خرطوشة استخراج واحدة لكل عينة، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. بعد الاستخراج ، قم بإزالة عينات الببتيد من مشعب الفراغ وجففها تماما في مكثف فراغ.يستغرق التجفيف حوالي ثلاث ساعات. بالنسبة لقياس الطيف الكتلي ، أو تحليل MS ، أعد تعليق عينة الببتيد بتركيز 400 نانوغرام لكل ميكرولتر في مخزن مؤقت لحمض الفورميك بنسبة 0.2٪. لإعادة إذابة الببتيدات ، اخلط العينة لمدة خمس دقائق.ثم ، سونيك لمدة خمس دقائق في سونيكتور حمام مائي. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان ونقل المواد الفائقة الببتيد إلى قوارير MS. قدم العينات للتحليل البروتيني باستخدام مطياف الكتلة الترادفية الترادفية للكروماتوغرافيا السائلة ، أو LC-MS-MS.استخدم الإعدادات الموصى بها للتحليل غير المستهدف بواسطة مرفق قياس الطيف الكتلي. قم بتحميل العينات على عمود تحليلي بمعدل تدفق يبلغ 400 نانولتر في الدقيقة لتزيل الببتيدات على مدى تدرج خطي مدته 90 دقيقة باستخدام مزيج من المذيبات العضوية وغير العضوية ، مع المذيبات العضوية التي تتراوح من 5 إلى 35٪ الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي في الوضع المعتمد على البيانات ، مع دورة مستمرة من عمليات مسح MS1 تليها 20 عملية مسح MS2 تعتمد على البيانات مع تجزئة HCD. حدد كميا مناطق ذروة الببتيد للببتيدات الثقيلة والخفيفة في أداة برنامج Proteome Quantitation.ثم ، قم بتصدير مناطق ذروة الببتيد الثقيلة والخفيفة. لحساب عمر النصف للبروتين، افتح مصنف تحليل SILAC إلى الورقة الأولى المسماة Raw Data والصقها في معرفات UniProt وأسماء الجينات ومناطق الذروة الثقيلة والخفيفة في الأعمدة المشار إليها. بعد ذلك، افتح الورقة الرابعة المسماة تحليل وأزل الصفوف التي يشير فيها العمودان G وH إلى أن العينة خارج النطاق واحتفظ بالصفوف التي تقرأ داخل النطاق.تم التحقق من صحة الأنماط الظاهرية الشائخة باستخدام نشاط بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة وتحليل RT-qPCR. بالنسبة لنشاط بيتا غالاكتوزيداز ، ظهرت الخلايا الشائخة باللون الأزرق ، في حين أن خلايا التحكم الهادئة لم يكن لها لون أو الحد الأدنى. في تحليل RT-qPCR ، أظهرت الخلايا الشائخة أعلى إنترلوكين-6 ، CXCL8 ، و CDKN1A-P21 mRNAs مقارنة بالخلايا الهادئة.وعلى العكس من ذلك، كان مستوى ترميز اللامين B1 لعلامة الانتشار منخفضا أو غائبا في الخلايا الشائخة. كشفت كروماتوغرام الأيونات المستخرجة من الببتيدات عن النسبة النسبية لإشارات الببتيد الثقيلة والخفيفة. وتشير نسبة أقل من إشارات الببتيد الثقيلة بالنسبة للخلايا الشائخة الخفيفة إلى معدل دوران أبطأ للبروتين، وتشير إشارة الببتيد الثقيلة الأعلى بالنسبة للضوء إلى معدل دوران أسرع للبروتين.أظهرت العينات غير المصنفة إشارة ببتيد ثقيلة قليلة أو معدومة. تم حساب نصف العمر ل 695 بروتينا تم تحديدها من تحليل مطياف الكتلة. تم الإبلاغ عن نصف العمر كنسبة سجل اثنين من الشيخوخة على الخلايا الهادئة ورسمت في مؤامرة بركان.بعد حساب معدلات دوران البروتين في الخلايا الشائخة ، قد يكشف التحليل النهائي عن مسارات بيولوجية مرشحة تنظمها آليات البروتين. مهد Pulse SILAC الطريق للباحثين لدراسة ديناميكيات البروتين بدقة وإنتاجية غير مسبوقة ، مما مكننا من دراسة التغيرات في توازن البروتين في العديد من البروتينات الفردية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless شعري الكهربائي-الطيف الكتلي لالاستقلابية من التنميط العينات البيولوجية

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

الطيف الكتلي والنهج القائم Luminogenic للتميز المرحلة الأولى الاستقلابية الكفاءة من<em&gt; في المختبر</em&gt; الثقافات خلية

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...