Name: measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) og Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). NB blev støttet af Longevity Impetus Grants og Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.

Forfatterne har ingen afsløringer.

pSILAC er en kraftfuld teknik, der muliggør global kvantificering af proteinomsætningshastigheder på tværs af flere cellulære forhold. Dette papir beskriver brugen af pSILAC til at sammenligne globale proteinhaleringstider mellem senescerende og stillestående celler, herunder instruktioner til fremstilling af senescerende og stillestående celler, SILAC-mærkning og høst og i sidste ende analyse ved hjælp af DDA-massespektrometri. Derudover beskrives en totrinstest til validering af ældningsfænotypen ved hjælp af SA-βGal- og RT-qPCR-analyse af et panel af mRNA'er, der koder for ældningsrelaterede proteiner. Ud over validering af ældning med de to beskrevne tilgange kan en tredje validering af ældning udføres efter massespektrometrianalyse ved at lede efter ændringer i kendte ældningsmarkører mellem senescerende og hvilende celler på proteomisk niveau. Senescens-associerede proteiner, der forventes at være forhøjede, omfatter blandt andet p16, p21 og BCL2, beskrevet andetsteds44,45. I den ovenfor beskrevne protokol blev ioniserende stråling anvendt til induktion af ældning og serumsult for stillestående celler. Til induktion af ældning er der flere muligheder til rådighed, og der er betydelig heterogenitet blandt dem 41,42,46. I øjeblikket er der ingen senescerende metode, der betragtes som den "mest fysiologiske", så valget af senescerende inducer er i vid udstrækning baseret på eksperimentets kontekst. Eksperimenter med det formål at angive et generelt fænomen om ældning anbefales dog at anvende mindst to forskellige senescerende inducere. At diskutere rækkevidden af ældningsparadigmer ligger uden for dette papirs anvendelsesområde, men nogle almindelige metoder til at inducere ældning omfatter udløsning af DNA-skade (IR, doxorubicin, replikativ udmattelse), ekspression af onkogene proteiner (HRAS, BRAF) og forstyrrelse af mitokondrierfunktion2.
Ud over valget af senescerende inducer er valget af kontrolceller en lige så vigtig overvejelse. Senescerende celler er per definition under ubestemt vækstarremme, så en sammenligning med andre vækstanholdte celler vælges ofte. For pSILAC er cellecyklusanholdte celler generelt at foretrække, fordi de ikke replikerer og dermed er lettere at bruge til proteinhaleringstidsberegninger47. Men da dyrkede celler ofte vil beholde nogle delende celler, er det vigtigt, at de metoder, der bruges til at inducere cellecyklusstop, producerer så homogent et svar som muligt for at minimere fejl fra celler, der stadig formerer sig. For at beregne proteinnedbrydningshastigheder for cykelceller ved hjælp af pSILAC kræves yderligere beregninger for at kompensere for den hastighed, hvormed protein fortyndes i datterceller27. Imidlertid er quiescent vækst arrest i sig selv ikke uden komplikationer. Der er to generelle metoder til cellecyklusarrest: serummangel og kontakthæmning48. Ikke alle celler kan gøres stillestående gennem kontakthæmning, selvom nogle fibroblaster har vist sig at demonstrere quiescens efter flere dages dyrkning49. Denne metode brugte serummangel, fordi den er mere almindeligt anvendt til sammenligninger af senescerende celler, selvom det kræver, at den senescerende celle på samme måde serumberøves for nøjagtige sammenligninger. Serum aktiverer mTOR-komplekset, og serumberøvelse har således flere nedstrømsvirkninger på cellen ud over cellecyklusstop50. Især har senescerende celler vist sig at vise en reduceret SASP ved serummangel eller mTOR-hæmning51,52.
Et andet vigtigt punkt at overveje i pSILAC er, hvor mange tidspunkter der skal testes. Denne protokol indsamlede celler på et enkelt tidspunkt (3 dages let eller tung mærkning), hvilket i væsentlig grad forenkler den resulterende analyse. Valget af tidspunkt bør baseres på eksperimentets mål. Til global analyse forventes 3 dage at fange et flertal af proteiner, selvom halveringstider for kortlivede proteiner, der fuldstændigt omsættes inden for 3 dage (alt lyssignal går tabt), ikke kan måles på dette tidspunkt. Omvendt er langlivede proteiner med meget lille omsætning på 3 dage også vanskelige at kvantificere og fremstår ofte som havende ekstremt store halveringstider (i rækkefølgen af uger), der typisk kun er en konsekvens af meget lidt tung signalakkumulering. På grund af det ikke-lineære forhold i forholdet mellem tunge og lette peptidsignaler versus procentdelen af nysyntetiseret protein på kortere og længere tidspunkter kunne kvantiteten af halveringstider forbedres ved at tilføje yderligere mærkningstider. For relative sammenligninger mellem to celletilstande, som i denne protokol, kan en omtrentlig halveringstid være tilstrækkelig, men yderligere tidspunkter kan bruges til at forbedre kvantitativ nøjagtighed.
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører en ikke-målrettet DDA-baseret analyse af proteinomsætning. Proteinomsætningsberegningerne kan dog generelt anvendes på ethvert erhvervelsesskema, der er i stand til at udlede den relative overflod af tunge og lette peptidpar. For eksempel kan MS2-baserede metoder såsom datauafhængig erhvervelse (DIA/SWATH) også anvendes til beregning af omsætningshastigheder med succes53. Derudover kan andre instrumenterings- og softwarerørledninger end dem, der er beskrevet i denne protokol, bruges til at udføre DDA-analyse, proteinidentifikation og proteinkvantificering. Når du bruger proteinkvantificeringssoftwareplatforme som Skyline til at udtrække peptidspidsområder, anbefales det manuelt at inspicere ekstraherede ionkromatogrammer i dokumentarbejdsområdet, identificere toppe, der fejlagtigt var integrerede og ikke-kvantitative toppe, og kuratere dokumentet i overensstemmelse hermed. En omfattende samling af tutorials er tilgængelig online for Skyline (skyline.ms).
pSILAC repræsenterer en af de mest ideelle metoder til global kvantificering af proteinhalvingstider i dyrkede celler på grund af overlegen multiplexing (proteomdækning) og gennemstrømning. Mens pSILAC ikke giver direkte syntese- eller nedbrydningshastigheder, da ændringen i let og tungt signal skyldes et sammenløb af faktorer, er pSILAC yderst nyttigt til sammenligninger mellem tilstande og forskellige celletyper. Metoder med lav gennemstrømning falder ofte i to typer: 1) behandling af celler med cyclohexamid for at blokere proteinsyntese og høst med tidsintervaller efter tilsætning for at overvåge henfald, eller 2) behandling af celler med en hæmmer af proteinhenfald og høst med tidsintervaller efter tilsætning for at overvåge akkumuleringen af protein og dermed udlede proteinhenfaldshastigheder. Begrænsningen af begge metoder er, at sådanne behandlinger uundgåeligt vil medføre væsentlige ændringer i cellulær fysiologi. I modsætning hertil kræver pSILAC ingen væsentlig indgriben og har teoretisk ingen påviselige virkninger på cellulær fysiologi, da isotopiske aminosyrer kun adskiller sig med en enkelt neutron fra deres ikke-isotopiske modstykker. Den her beskrevne metode for pSILAC repræsenterer således en simpel protokol til global måling af de mest fysiologiske proteinhaleringstider i ikke-delende celler.
Ændringer i proteinomsætning har et tæt forhold til aldring, aldersrelaterede sygdomme, neurodegeneration og lang levetid54,55. Denne protokol beskriver en metode til at forhøre disse forhold ved at anvende stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur til måling af proteinomsætningshastigheder i ældningsceller. Imidlertid findes der adskillige analoge metoder til at udføre undersøgelser i forbindelse med aldring og neurodegeneration in vivo i hele organismer som mus. Faktisk har disse undersøgelser understreget vigtigheden af at måle proteinomsætningshastigheder i forbindelse med aldersrelaterede sygdomme 56,57,58,59.
I denne undersøgelse skilte ribosomale proteiner og proteiner, der befinder sig i det endoplasmatiske retikulum, sig ud som to kategorier af proteiner med henholdsvis nedsat og øget halveringstid i senescerende celler. Mens yderligere analyse af steady-state niveauer er nødvendig for endelige konklusioner, tyder disse resultater yderligere på, at senescerende celler unikt kan regulere translation gennem nedsat halveringstid for ribosomale proteiner. Fremadrettet vil anvendelse af stabile isotopmærkningsmetoder til at studere forholdet mellem cellulær ældning og neurodegeneration in vivo i musemodeller være en lovende udvidelse af isotopmærkningsmetoden beskrevet i denne protokol.

Senescens blev først identificeret som en tilstand af ubestemt vækstarrest udstillet af dyrkede primære celler efter at have nået replikativ udmattelse1. Det har siden vist sig, at ældning kan opstå som reaktion på adskillige cellulære fornærmelser, herunder genotoksiske, mitokondrielle og onkogene belastninger, blandt andre2. Mens ældning har flere fysiologisk vigtige roller, såsom tumorundertrykkelse og sårheling, er akkumuleringen af senescerende celler under aldring forbundet med en lang række skadelige virkninger på helbredet3, herunder flere neurodegenerative tilstande 4,5,6. Cellulær ældning forekommer i flere hjernecelletyper, herunder neuroner 7,8,9,10, astrocytter11, microglia 12 og oligodendrocytprækursorer13, og bidrager til neurodegeneration og kognitiv dysfunktion. Amyloid beta-oligomerer, et af kendetegnene ved Alzheimers sygdom14, har vist sig at fremskynde neuronal ældning 13,15,16. En øget forekomst af senescerende celler har også været forbundet med Parkinsons sygdom17, især som følge af miljømæssige stressfaktorer11,18. Det er vigtigt, at den selektive eliminering af senescerende celler i prækliniske modeller forlænger levetiden og afbøder en lang række aldersrelaterede sygdomme 3,5,12 og forbedrer kognitive underskud 8,11,12,13. Senescerende celler har således vist sig som lovende terapeutiske mål for behandling af mange aldersrelaterede tilstande.
Meget af den skadelige virkning af senescerende celler er forårsaget af den ældningsrelaterede sekretoriske fænotype (SASP), en kompleks blanding af bioaktive molekyler udskilt af senescerende celler, der kan forårsage lokal inflammation, angiogenese, ødelæggelse af den ekstracellulære matrix og udbredelse af ældning i omgivende væv 19,20,21 . SASP repræsenterer også et interessant biologisk fænomen af ældning, fordi det kræver en betydelig transkriptionel og translationel indsats under en tilstand af cellecyklusarrest. Faktisk har senescerende celler vist sig at udvise fald i ribosombiogenese 22,23,24, der skulle reducere proteinsyntesen. I stedet oversætter senescerende celler robust nogle proteiner, især SASP-faktorer, og påvirker metabolismen af omgivende væv25. Der er således stor interesse for at forstå, hvordan senescerende celler, der gennemgår en permanent cellecyklusstop, fortsætter med at opretholde proteinhomeostase, samtidig med at de robust udtrykker SASP-faktorer og andre udvalgte proteiner.
Denne metode beskriver, hvordan man bruger massespektrometri og pulserende stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur (pSILAC) til globalt at måle halveringstiderne for proteiner i senescerende celler i en proteom-bred skala. I traditionel SILAC er dyrkede celler fuldstændigt metabolisk mærket med tunge og lette ikke-radioaktive isotoper af aminosyrer til nedstrøms analyse af proteinoverflod. Denne metode er tidligere blevet anvendt til at vurdere overflodsændringer omfattende og kvantitativt i SASP af dyrkede fibroblaster26. I pSILAC er celler ligeledes metabolisk mærket med en puls af tung isotop, der følger formærkning med let isotop og derefter høstes med et eller flere tidsintervaller. Inkorporeringshastighederne for tung isotop i forhold til allerede eksisterende lysisotop bruges derefter til at beregne relative proteinomsætningshastigheder. Generelt anvendes isotoper af arginin og lysin, fordi trypsin spalter ved disse rester; således vil alle peptider fra standard fordøjelse potentielt indeholde den tunge etiket. Par af peptider, der kun adskiller sig ved tilstedeværelsen eller fraværet af tung lysin eller arginin, er kemisk identiske og kan differentieres og kvantificeres ved hjælp af et massespektrometer. Efter massespektrometrianalyse kan peptider identificeres som nyligt syntetiserede eller allerede eksisterende baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af isotopetiketten i de resulterende peptididentifikationer. Proteinomsætningshastigheder kan derefter bestemmes ved at tilpasse forholdet mellem tunge (13 C-15N) over lette (12 C-14N) peptider for et givet protein til kinetiske modeller for eksponentiel vækst eller henfald27,28. pSILAC er blevet anvendt i flere sammenligninger af proteinomsætningshastigheder 29,30,31,32 og er i øjeblikket den mest omfattende metode med høj gennemstrømning til måling af proteinhalvingstider.
Denne protokol beskriver forberedelsen af senescerende celler parallelt med tilsvarende væksthæmmede hvilende celler i kultur efterfulgt af metabolisk mærkning med pSILAC. Celler høstes derefter, homogeniseres til lysater og behandles til massespektrometri erhvervelse og analyse. De data, der opnås fra massespektrometri, bruges derefter til at bestemme proteinhalvingstider ved hjælp af en forenklet kvantitativ metode, der anvender et enkelt tidspunkt og halveringstidsberegninger udført i et regneark. Ved hjælp af denne tilgang kan estimater af proteinhalvingstider måles på en omfattende og kvantitativ måde, der er mere autentisk for uforstyrrede cellulære forhold end protokoller, der bruger blokkere af proteinsyntese eller omsætning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammacel 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td></td>
			<td>Cesium Irradiator for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-90 primary lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iRT Kit (indexed retention time)</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td>Indexed Retention Time Peptide Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>423835000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Mascot Daemon 2.8</td>
			<td>Proteomic database searching software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q Exactive HF Orbitrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>327110025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline</td>
			<td>University of Washington</td>
			<td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td>
			<td>Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator waterbath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-516R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Referred to as phenol in text; hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPle Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (sequencing grade)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry

Stigende beviser har vist, at akkumuleringen af senescerende celler i centralnervesystemet bidrager til neurodegenerative lidelser som Alzheimers og Parkinsons sygdomme. Cellulær ældning er en tilstand af permanent cellecyklusarrest, der typisk opstår som reaktion på udsættelse for subdødelige belastninger. Ligesom andre ikke-delende celler forbliver senescerende celler imidlertid metabolisk aktive og udfører mange funktioner, der kræver unikke transkriptionelle og translationelle krav og udbredte ændringer i de intracellulære og udskillede proteomer. At forstå, hvordan proteinsyntese og henfaldshastigheder ændres under ældning, kan belyse de underliggende mekanismer for cellulær ældning og finde potentielle terapeutiske veje til sygdomme, der forværres af senescerende celler. Dette papir beskriver en metode til proteomskala evaluering af proteinhalvingstider i ikke-delende celler ved hjælp af pulserende stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur (pSILAC) i kombination med massespektrometri. pSILAC involverer metabolisk mærkning af celler med stabile tunge isotopholdige versioner af aminosyrer. Sammen med moderne massespektrometrimetoder muliggør pSILAC måling af proteinomsætning af hundreder eller tusinder af proteiner i komplekse blandinger. Efter metabolisk mærkning kan proteinernes omsætningsdynamik bestemmes ud fra den relative berigelse af tunge isotoper i peptider detekteret ved massespektrometri. I denne protokol beskrives en arbejdsgang til generering af senescerende fibroblastkulturer og tilsvarende arresterede quiescent fibroblaster samt et forenklet, enkeltpunkt pSILAC-mærkningstidsforløb, der maksimerer dækningen af forventede proteinomsætningshastigheder. Endvidere præsenteres en pipeline til analyse af pSILAC-massespektrometridata og brugervenlig beregning af proteinnedbrydningshastigheder ved hjælp af regneark. Anvendelsen af denne protokol kan udvides ud over senescerende celler til alle ikke-delende dyrkede celler, såsom neuroner.

Denne protokol beskriver en metode til globalt at sammenligne proteinhalvingstider mellem senescerende og ikke-delende, hvilende kontrolceller ved hjælp af pSILAC og minimale tidspunkter. Denne protokol beskriver generering af senescerende og stillestående celler i kultur, metabolisk mærkning af celler med stabile isotoper af arginin og lysin over 3 dage, kvantificering af de relative mængder af tunge og lette peptidisotoper ved massespektrometri og en ligetil og tilgængelig beregning af proteinhaleringstider ved hjælp af regnearksformler (figur 1). Denne metode er meget fleksibel og kan tilpasses mange celletyper og tilstande.
Som en del af genereringen af senescerende celler til denne protokol anvendes to metoder til ældningsvalidering: SA-βGal-positive celler visualiseret ved mikroskopi og øgede niveauer af senescerende markører kvantificeret ved hjælp af RT-qPCR-analyse. Målingen af senescerende markører bør give klare sondringer mellem hvilende og senescerende celler, for at sammenligninger af de to cellepopulationer kan betragtes som gyldige. For SA-βGal-aktivitet skal senescerende celler fremstå blå, mens stillestående kontrolceller ikke har nogen eller meget lidt farve (figur 2A). Dette assay kan kvantificeres ved at tælle de positive, blåfarvede celler som en procentdel af det samlede antal celler og derefter sammenligne den procentvise positivitetshastighed mellem stillestående kontrol og senescerende celler. Det er vigtigt, at denne protokol udføres på samme tid til sammenligning af begge celletilstande; SA-βGal-aktivitet er afhængig af farvningsopløsningens pH-værdi, så resultaterne kan variere betydeligt mellem assays og bør betragtes som et kvalitativt mål.
RT-qPCR-analysen af senescerende markører vil vise høje niveauer af mRNA'erne, der koder for SASP-faktorer (IL6, CXCL8, IL1B) og cellecyklushæmmere (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21) i de fleste senescerende modeller. Selvom der forventes en vis variation baseret på celletype, dyrkningstilstand og senescerende induktor41,42, viser de fleste senescerende celler mere end fem gange højere niveauer af IL6, CXCL8 og CDKN1A / p21 mRA'er sammenlignet med hvilende kontrolceller; Omvendt bør niveauerne af LMNB1- og PCNA-mRNA'er, der koder for spredningsmarkører, være lave eller fraværende i senescerende celler sammenlignet med hvilende celler (figur 2B). Samlet set er en signifikant procentdel af SA-βGal-positivitet og den forventede ekspression af et panel af ældningsrelaterede mRNA-markører tilstrækkelige til at bekræfte induktionen af ældning i et eksperiment.
Behandling af proteinprøver til massespektrometrianalyse består af fordøjelse i opløsningen (2 dage) og fastfaseekstraktion (4-6 timer). For at udføre ikke-målrettet proteomisk analyse indsendes de resulterende peptider til LC-MS/MS-analyse ved hjælp af dataafhængig erhvervelse (DDA). På Orbitrap-instrumenter kan en DDA-metode specificeres i massespektrometriinstrumentets softwaremetodeeditor. De massespektrometerindstillinger, der anvendes i denne undersøgelse, er vist i figur 3A. Væskekromatografiindstillinger kan også angives i metodeeditoren. Til denne undersøgelse blev der anvendt en 90 minutters lineær gradient med stigende organisk fase (acetonitril) (figur 3B). Efter en vellykket erhvervelse skal den samlede ionstrøm (TIC) indeholde et intenst signal under den lineære gradientdel af metoden (figur 3C). Denne protokol beskriver en eksempelprotokol på et Orbitrap-instrument, men beregningen af proteinhalvingstider kan udføres på data opnået fra ethvert massespektrometer, der blev indsamlet i DDA-tilstand, som er tilgængelig på flere typer instrumenter (f.eks. Orbitraps og time-of-flight-instrumenter) og leverandører. Anskaffelsesindstillingerne vil være unikke for typen og konfigurationen af det anvendte instrument, og det anbefales at bruge de indstillinger, der foreslås af massespektrometrifaciliteten. Denne metode er også kompatibel med ikke-DDA-metoder (SRM, PRM, DIA), så længe kvantitative kromatografiske topområder for tunge og lette toppe kan udtrækkes fra rådatafilerne og indtastes i regnearksformlerne.
Rå massespektrometrifiler søges med et af de mange tilgængelige proteomiske databasesøgningsværktøjer til identifikation af peptider og proteiner. For eksempel brugte denne undersøgelse Mascot43-søgemaskinen. For at opnå kromatografiske topområder til kvantificering af tunge og lette peptider importeres databasesøgeresultater til en proteomisk software, der er i stand til kromatografiske topområder som Skyline39,40. Undersøgelse af de ekstraherede ionkromatogrammer af peptider (figur 4) vil afsløre den relative andel af tunge og lette peptidsignaler. En lavere andel af tungt peptidsignal i forhold til let peptidsignal i senescerende celler indikerer en langsommere proteinomsætningshastighed (figur 4A), og et højere tungt peptidsignal i forhold til lys indikerer en hurtigere proteinomsætningshastighed (figur 4B). De umærkede prøver skal vise ringe eller intet tungt peptidsignal. Ethvert tilsyneladende tungt peptidsignal i de umærkede prøver betragtes som baggrundsstøj og trækkes fra under de endelige beregninger. Kvantificering af kromatografiske spidsområder for lette og tunge peptider til alle behandlings- og mærkningsbetingelser skal eksporteres til efterfølgende beregning af proteinomsætningshastigheder og statistisk analyse.
Ved hjælp af enkelttidspunktsanalyse er kvantificeringen af proteinhalvingstider enkel at udføre og kan udføres bekvemt i regneark. I tabel 3 blev halveringstiderne for 695 proteiner identificeret ud fra massespektrometrianalysen beregnet. Ud fra tunge og lette isotopmængder på proteinniveau for hvert protein i prøverne (input til 1) Rådatabladet ) beregnes en procent tung isotop (nævnt Forholdet, R) derefter automatisk på arket med titlen 2) Forhold H | H + L. På dette trin normaliseres R fra tunge mærkede prøver ved at trække R fra umærkede prøver for at producere en endelig R for de quiescent og senescerende triplikater. Da umærkede prøver ikke bør have nogen eksogent tilsat tung isotop, bruges de til at eliminere baggrundssignalet. Fra R beregnes kdeg (omsætningshastighed) ved hjælp af følgende formel:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
Halveringstiden (H, i dage) bestemmes for hvert protein i den hvilende kontrol og senescerende triplikater (ark med titlen 3) Half-Life (dage)) ved hjælp af følgende formel:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
Disse halveringstider er derefter i gennemsnit blandt de hvilende og senescerende triplikater for at generere en hvilende og senescerende gennemsnitlig halveringstid for hvert protein samt en p-værdi. Beregnede halveringstider filtreres derefter for værdier, der er negative, hvilket opstår, når det tunge signal fra lysmærkede celler (baggrunden) er større end det tunge signal fra tungt mærkede celler. Denne filtrering resulterede i 707 proteiner fra 841 identificeret med gyldige halveringstider for de resultater, der præsenteres her.
Halveringstiden rapporteres derefter som et log2-forhold mellem senescerende over hvilende kontrolceller (log2FC) og afbildes i et vulkanplot (figur 5). For eksempel ved at se på 5) Analysearket kan koagulation II-trombinreceptorproteinet (F2R) ses at have en halveringstid i hvilende celler på 0,51 dage (kolonne B) og en halveringstid i senescerende celler på 1,07 dage (kolonne C), der gav en log2FC på ~ 1,06 (kolonne D) med en p-værdi på 0,001.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> Figur 1: Diagram over pSILAC-arbejdsgangen for senescerende og stillestående kontrolceller. Humane IMR-90 fibroblaster blev anvendt til at forberede quiescent (low-serum) eller senescerende (IR) cellekulturer til sammenligning af proteinhalvingstider. Celler blev derefter mærket med SILAC Light eller SILAC Heavy medier med isotopisk arginin og lysin i 3 dage. Lysater blev ekstraheret fra celler, fordøjet, afsaltet og analyseret ved hjælp af massespektrometri. Tunge og lette peptidisotoptoppe svarer til henholdsvis nysyntetiserete og allerede eksisterende peptider. Halveringstider blev beregnet ved hjælp af en ligning for eksponentielt henfald. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> Figur 2: Validering af senescerende fænotyper ved hjælp af SA-βGal- og RT-qPCR-analyser. (A) Senescerende og stillestående celler ombelægges på høsttidspunktet til en 6-brønds plade og farves til SA-βGal ved hjælp af SA-βGal-farvningssættet. Blå farve i cellekroppen er positiv for ældning. Billeder er taget i brightfield med farve ved 10x forstørrelse, størrelsesmarkør i rødt. (B) RT-qPCR-analyse, der sammenligner senescerende celler (røde) og cykelceller (grå) fra et ikke-relateret eksperiment. Stigninger i niveauerne af CDKN1A / p21, CXCL8 og IL6 mRNA'er er tegn på ældning, ligesom faldet i LMNB1 mRNA-niveauer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> Figur 3: Repræsentative metoder til dataafhængige erhvervelsesscanninger (DDA) og væskekromatografigradient af pSILAC-kulturer på Q-Exactive HF orbitrap-massespektrometeret. (A) Anbefalede instrumentindstillinger i instrumentsoftwaren til dataafhængig analyse af helcellelysater fra et pSILAC-eksperiment. B) Eksempel på indstillinger for væskekromatografiflowgradientmetode. Peptider elueres over en 90 minutters lineær gradient fra 5% til 35% buffer B (0,2% myresyre og 99,8% acetonitril) efterfulgt af en 10 minutters vask med 80% buffer B og 25 minutters ligevægt med 5% buffer B. (C) Et repræsentativt totalt ionkromatogram (TIC) af en massespektrometri erhvervelse af IMR-90 fibroblastpeptider erhvervet med de specificerede indstillinger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> Figur 4: Repræsentative ekstraherede ionkromatogrammer af peptider med ændret omsætning under ældning. (A) Kromatografiske topområder af peptidet FQMTQEVVCDECPNVK ++ fra proteinet DnaJ homolog underfamilie B medlem 11 (DNAJB11) i senescerende og ikke-senescerende celler. Efter 3 dages SILAC inkorporerer senescerende celler mindre tung isotop i dette peptid sammenlignet med stillestående (ikke-senescerende) celler, som indikeret ved en reduktion i topområdet af tungt isotopholdigt peptid (blåt) i forhold til det lette peptid (rødt), hvilket indikerer, at dette peptid har reduceret omsætningen i senescerende celler. B) Kromatografiske topområder af peptidet VQAQVIQETIVPK++ fra proteinet Splejsningsfaktor 3a-underenhed 1 (SF3A1) i senescerende og ikke-senescerende celler. Efter 3 dages SILAC inkorporerer senescerende celler en højere andel af tung isotop i dette peptid sammenlignet med stillestående (ikke-senescerende) celler, som indikeret ved en reduktion i topområdet af tungt isotopholdigt peptid (blåt) i forhold til det lette peptid (rødt), hvilket indikerer, at dette peptid har øget omsætningen i senescerende celler. De umærkede (dag 0) betingelser viser ingen inkorporering af tung isotop for begge peptider, som forventet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> Figur 5: Sammenligning af proteinhalvingstider i senescerende og stillestående celler bestemt ud fra pSILAC-mærkning. (A) Vulkanplot, der viser log2-forholdet mellem senescerende / kontrol (quiescent) for hvert af de 695 identificerede proteiner; i dette eksperiment indeholdt lette og tunge mærkningsmedier ingen glukose og ingen phenolrød. (B) Tabeller, der viser de 10 bedste proteiner med de mest øgede eller nedsatte halveringstider i hvilende celler versus senescerende celler (henholdsvis venstre og højre). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: Medier og buffere, der anvendes i denne protokol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 2: RT-qPCR-primere, der anvendes i denne protokol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 3: SILAC-analysearbejdsbog til beregning af proteinhalvingstider, foldændringer og t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Denne protokol beskriver arbejdsgangen for metabolisk mærkning af senescerende og ikke-delende celler med pulserende SILAC, ikke-målrettet massespektrometrianalyse og en strømlinet beregning af proteinhalvingstider.

Måling af proteinomsætningshastigheder i senescerende og ikke-delende dyrkede celler med metabolisk mærkning og massespektrometri

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Hvordan celler opretholder proteinhomeostase er ikke godt forstået i forbindelse med cellulær stress og ældning. I denne protokol giver vi en enkel og præcis måde at beregne proteinomsætning på, som er en nøglekomponent i proteinhomeostase i levende celler. Pulse SILAC giver en eksperimentator mulighed for at måle proteinomsætningen for individuelle proteiner og hele proteomet på en high-throughput måde, der også er mere autentisk for biologiske systemer end andre metoder.Principperne for denne metode kan anvendes på ethvert system, der kan mærkes metabolisk, herunder hele organismer. Denne metode kan også føre til indsigt i cellulær ældning, aldring og neurodegenerativ sygdom. Massespektrometrianalyse er meget følsom over for visse kemiske forurenende stoffer, såsom vaskemidler.Brug LC-MS-kvalitetsreagenser i hele denne procedure for at sikre dataindsamling af høj kvalitet. For at starte den metaboliske mærkning af cellerne skal du udskifte mediet for tre plader hver af senescerende og stillestående celler med 30 ml SILAC Light-medier. Udskift mediet separat med tre senescerende og tre hvilende plader med 30 ml SILAC Heavy.Voks cellerne i tre dage uden at ændre mediet. For at løsne cellerne fra dyrkningspladerne tilsættes fem milliliter forvarmet trypsinreagens til hver plade og inkuberer pladerne i fem minutter ved 37 grader Celsius. Senere suspenderes de løsrevne celler i fem milliliter af det samme medie, der anvendes til dyrkning, til et samlet volumen på 10 ml.Overfør derefter cellerne til is og centrifuger cellerne ved 300 gange G ved fire grader Celsius. Efter vask af pelleten to gange, spinde ned cellerne igen og fjerne supernatanten, før du genopliver pelleten i 150 mikroliter frisklavet otte-molært urinstof og 50 millimolær ammoniumbicarbonat lysis buffer. Bland indholdet af røret ved pipettering op og ned.Aliquot 50 mikrogram af proteinprøven i et nyt rør og bringer prøver op til lige store mængder med lysisbuffer. Derefter tilsættes dithiothreitol til en endelig koncentration på 20 millimolær til røret og inkuberer prøven ved 37 grader Celsius i 30 minutter med omrystning. Prøven afkøles ved stuetemperatur i 10 minutter, inden iodoacetamid tilsættes til en endelig koncentration på 40 millimolær og inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 30 minutter.Fortynd derefter prøven til under en-molært urinstof med en 50 millimolær ammoniumbicarbonatbuffer. Tilsæt et mikrogram trypsin til 50 mikrogram startprotein eller ved 1:50 trypsin til proteinforhold til prøven. Inkuber prøven natten over ved 37 grader Celsius med omrystning for at fordøje proteiner til peptider.Den næste dag tilsættes myresyre til 1% volumen af prøven for at slukke proteinfordøjelsen. Til prøveoprydningen skal du placere en fastfaseekstraktionspatron på en vakuummanifold ved hjælp af en ekstraktionspatron til hver prøve i henhold til producentens retningslinjer. Efter ekstraktionen fjernes peptidprøverne fra vakuummanifolden og tørres helt i en vakuumkoncentrator.Tørring tager cirka tre timer. Til massespektrometri eller MS-analyse resuspender peptidprøven i en koncentration på 400 nanogram pr. Mikroliter i en 0,2% myresyrebuffer. For at resolubilisere peptiderne blandes prøven i fem minutter.Derefter sonikere i fem minutter i et vandbad sonicator. Derefter centrifugeres prøven for at pelletere de uopløselige materialer og overføre peptidsupernatanterne til MS-hætteglas. Indsend prøverne til den proteomiske analyse ved hjælp af væskekromatografi tandemmassespektrometri eller LC-MS-MS.Brug de indstillinger, der anbefales til ikke-målrettet analyse af massespektrometrifaciliteten. Læg prøverne på en analytisk kolonne med en strømningshastighed på 400 nanoliter pr. minut for at eluere peptiderne over en 90-minutters lineær gradient ved hjælp af en blanding af organiske og uorganiske opløsningsmidler, hvor det organiske opløsningsmiddel spænder fra 5 til 35%Indsaml massespektrometridata i dataafhængig tilstand med en kontinuerlig cyklus af MS1-undersøgelsesscanninger efterfulgt af 20 dataafhængige MS2-scanninger med HCD-fragmentering. Kvantificer peptidtopområderne for tunge og lette peptider i softwareværktøjet Proteome Quantitation.Eksporter derefter de tunge og lette peptidtopområder. Til beregning af proteinhalvingstider skal du åbne SILAC Analysis Workbook til det første ark med navnet Raw Data og indsætte UniProt ID'er, gennavne, tunge og lette topområder i de angivne kolonner. Åbn derefter det fjerde ark med navnet Analyse, og fjern de rækker, hvor kolonnerne G og H angiver, at eksemplet er uden for rækkevidde, og hold rækker, der læses, inden for området.De senescerende fænotyper blev valideret ved hjælp af den ældningsrelaterede beta-galactosidaseaktivitet og RT-qPCR-analyse. For beta-galactosidaseaktiviteten syntes de senescerende celler blå, mens de stillestående kontrolceller havde ingen eller minimal farve. I RT-qPCR-analysen viste de senescerende celler højere interleukin-6, CXCL8 og CDKN1A-P21 mRA'er sammenlignet med de hvilende celler.Omvendt var niveauet af lamin B1,kodning for proliferationsmarkør lavt eller fraværende i de senescerende celler. De ekstraherede ionkromatogrammer af peptider afslørede den relative andel af tunge og lette peptidsignaler. En lavere andel af tunge peptidsignaler i forhold til lette senescerende celler indikerede en langsommere proteinomsætningshastighed, og et højere tungt peptidsignal i forhold til lys indikerede en hurtigere proteinomsætningshastighed.De umærkede prøver viste ringe eller intet tungt peptidsignal. Halveringstiderne for 695 proteiner identificeret ud fra massespektrometrianalysen blev beregnet. Halveringstiden rapporteres som et log-to-forhold mellem senescerende over stillestående celler og afbildet i et vulkanplot.Efter beregningen af proteinomsætningshastigheder i senescerende celler kan downstream-analyse afsløre kandidatbiologiske veje, der reguleres af proteostasemekanismer. Pulse SILAC banede vejen for, at forskere kunne studere proteindynamik med hidtil uset granularitet og gennemstrømning, hvilket gjorde det muligt for os at studere ændringer i proteinhomeostase i mange individuelle proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless kapillarelektroforese-massespektrometri for Metabolic profilering biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Massespektrometri og luminogent tilgange til Karakterisere Fase I Metabolisk Kompetenceudvikling af<em&gt; In vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og fortolke ilt forbrug satser helt flyve hoved segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...