Name: measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ותוכנית המחקר התוך-גופית (IRP), המכון הלאומי להזדקנות (NIA). נ.ב. נתמך על ידי מענקי דחף אריכות ימים, ותוכנית החוקרים של המשרד לתוספי תזונה (ODS). איור 1 נוצר עם BioRender.com.

למחברים אין גילויים.

pSILAC היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת כימות גלובלי של שיעורי תחלופת חלבונים על פני מצבים תאיים מרובים. מאמר זה מפרט את השימוש ב-pSILAC כדי להשוות את זמן מחצית החיים של חלבונים גלובליים בין תאים סנסנטיים וקוויזנטיים, כולל הוראות להכנת תאים סנסנטיים וקוויזנטיים, תיוג וקצירה של SILAC, ובסופו של דבר ניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסה של DDA. בנוסף, בדיקה דו-שלבית מתוארת לאימות של פנוטיפ הסנסנציה באמצעות ניתוח SA-βGal ו-RT-qPCR של פאנל של mRNA המקודד חלבונים הקשורים לסנסנציה. בנוסף לאימות של סנסנציה עם שתי הגישות המתוארות, ניתן לבצע אימות שלישי של סנסנציה לאחר ניתוח ספקטרומטריית מסות על ידי חיפוש שינויים בסמני סנסנציה ידועים בין תאים סנסנטיים וקוויסנטיים ברמה הפרוטאומית. חלבונים הקשורים לסנסנציה שצפויים להיות גבוהים כוללים את p16, p21 ו-BCL2, בין היתר, המתוארים במקומות אחרים44,45. בפרוטוקול שתואר לעיל, קרינה מייננת שימשה להשראת סנסנציה ורעב בסרום עבור תאים שקטים. עבור אינדוקציה של senescence, ישנן אפשרויות מרובות זמינות ויש הטרוגניות משמעותית ביניהן 41,42,46. נכון לעכשיו, אין שיטה senescent כי הוא נחשב "הפיזיולוגי ביותר", ולכן הבחירה של משרה senescent מבוסס במידה רבה על ההקשר של הניסוי. עם זאת, ניסויים שמטרתם לקבוע תופעה כללית על senescence מומלץ להשתמש לפחות שני משרי סנסנט שונים. דיון בטווח הפרדיגמות של סנסנציה הוא מעבר להיקף של מאמר זה, אך כמה שיטות נפוצות להשראת סנסנציה כוללות הפעלת נזק לדנ"א (IR, דוקסורוביצין, תשישות משוכפלת), ביטוי חלבונים אונקוגניים (HRAS, BRAF) ושיבוש תפקוד המיטוכונדריה2.
בנוסף לבחירה של משרה סנסנטי, הבחירה של תאי בקרה היא שיקול חשוב לא פחות. תאים סנסנטיים נמצאים, מעצם הגדרתם, תחת מעצר גדילה בלתי מוגבל בזמן, ולכן לעתים קרובות נבחרת השוואה לתאים אחרים שנעצרו על ידי גדילה. עבור pSILAC, תאים שנעצרו במחזור התאים עדיפים בדרך כלל מכיוון שהם אינם משתכפלים ולכן קל יותר להשתמש בהם לחישובי זמן מחצית חיים של חלבון47. עם זאת, מאחר שתאים בתרבית ישמרו לעתים קרובות על חלק מהתאים המתחלקים, חשוב שהשיטות המשמשות לגרימת עצירת מחזור התאים ייצרו תגובה הומוגנית ככל האפשר כדי למזער את השגיאה של תאים שעדיין מתרבים. כדי לחשב את שיעורי הפירוק של חלבונים עבור תאים מחזוריים באמצעות pSILAC נדרשים חישובים נוספים כדי לפצות על הקצב שבו חלבון מדולל לתאי בת27. עם זאת, מעצר צמיחה שקט עצמו אינו נטול סיבוכים. ישנן שתי שיטות כלליות למעצר מחזור התא: מניעת סרום ועיכוב מגע48. לא כל התאים יכולים להיות שקטים באמצעות עיכוב מגע, אם כי כמה פיברובלסטים הוכחו כמפגינים שקט לאחר מספר ימים של culturing49. שיטה זו השתמשה בחסך סרום מכיוון שהיא משמשת בדרך כלל יותר להשוואות של תאים סנסנטיים, אם כי היא דורשת שהתא הסנסנטי יהיה מקופח באופן דומה בסרום להשוואות מדויקות. הסרום מפעיל את קומפלקס ה-mTOR, ולכן לחסך בסרום יש מספר השפעות במורד הזרם על התא בנוסף למעצר מחזור התא50. יש לציין כי הודגם כי תאים סנסנטיים מציגים SASP מופחת עם מחסור בסרום או עיכוב mTOR51,52.
נקודה חשובה נוספת שיש לקחת בחשבון ב- pSILAC היא כמה נקודות זמן לבדוק. פרוטוקול זה אסף תאים בנקודת זמן אחת (3 ימים של תיוג קל או כבד), מה שמפשט באופן משמעותי את הניתוח המתקבל. בחירת נקודת הזמן צריכה להתבסס על מטרת הניסוי. לצורך ניתוח גלובלי, 3 ימים צפויים ללכוד את רוב החלבונים, אם כי בנקודת זמן זו לא ניתן למדוד את זמן מחצית החיים של חלבונים קצרי מועד שמתחלפים לחלוטין תוך 3 ימים (כל אות האור הולך לאיבוד). לעומת זאת, חלבונים בעלי תוחלת חיים ארוכה עם תחלופה מועטה מאוד ב-3 ימים גם הם קשים לכימות ולעתים קרובות מופיעים כבעלי זמן מחצית חיים גדול במיוחד (לפי סדר השבועות) שהם בדרך כלל רק תוצאה של הצטברות אותות כבדה קטנה מאוד. בשל הקשר הלא ליניארי ביחס בין אותות פפטידים כבדים וקלים לעומת אחוז החלבון המסונתז החדש בנקודות זמן קצרות וארוכות יותר, ניתן לשפר את כמות מחצית החיים על ידי הוספת נקודות זמן תיוג נוספות. עבור השוואות יחסיות בין שני מצבי תאים, כמו בפרוטוקול זה, ייתכן שזמן מחצית חיים משוער יספיק, אך ניתן להשתמש בנקודות זמן נוספות כדי לשפר את הדיוק הכמותי.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניתוח מבוסס DDA לא ממוקד של תחלופת חלבונים. עם זאת, חישובי תחלופת החלבונים יכולים להיות מיושמים באופן כללי על כל ערכת רכישה המסוגלת להפיק את השפע היחסי של זוגות פפטידים כבדים וקלים. לדוגמה, שיטות מבוססות MS2 כגון רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA/SWATH) יכולות להיות מיושמות גם לחישוב שיעורי תחלופה בהצלחה53. בנוסף, ניתן להשתמש במכשור ובצינורות תוכנה שאינם אלה המתוארים בפרוטוקול זה כדי לבצע ניתוח DDA, זיהוי חלבונים וכימות חלבונים. בעת שימוש בפלטפורמות תוכנה לכימות חלבונים כגון Skyline כדי לחלץ אזורי שיא פפטידיים, מומלץ לבדוק ידנית כרומטוגרמות יונים שחולצו בסביבת העבודה של המסמך, לזהות פסגות ששולבו בטעות ופסגות לא כמותיות, ולאצור את המסמך בהתאם. אוסף נרחב של הדרכות זמין באינטרנט עבור Skyline (skyline.ms).
pSILAC מייצג את אחת השיטות האידיאליות ביותר לכימות גלובלי של זמן מחצית חיים של חלבון בתאים בתרבית עקב ריבוב מעולה (כיסוי פרוטאום) ותפוקה. בעוד ש- pSILAC אינו מספק שיעורים ישירים של סינתזה או השפלה, מכיוון שהשינוי באות קל וכבד נובע ממפגש של גורמים, pSILAC שימושי מאוד להשוואות בין תנאים וסוגי תאים שונים. שיטות בעלות תפוקה נמוכה מתחלקות לעתים קרובות לשני סוגים: 1) טיפול בתאים עם ציקלוהקסימיד כדי לחסום סינתזה וקציר של חלבונים במרווחי זמן לאחר תוספת לניטור ריקבון, או 2) טיפול בתאים עם מעכב של ריקבון חלבונים וקציר במרווחי זמן לאחר תוספת כדי לעקוב אחר הצטברות החלבון, ובכך להסיק את שיעורי דעיכת החלבון. המגבלה של שתי השיטות היא שטיפולים כאלה יגרמו בהכרח לשינויים מהותיים בפיזיולוגיה התאית. לעומת זאת, pSILAC אינו דורש התערבות משמעותית ובאופן תיאורטי אין לו השפעות ניתנות לזיהוי על הפיזיולוגיה התאית מכיוון שחומצות אמינו איזוטופיות נבדלות בנייטרון יחיד בלבד ממקבילותיהן הלא איזוטופיות. לפיכך, השיטה המתוארת כאן עבור pSILAC מייצגת פרוטוקול פשוט למדידה גלובלית של זמן מחצית החיים של החלבון הפיזיולוגי ביותר בתאים שאינם מתחלקים.
לשינויים בתחלופת חלבונים יש קשר הדוק להזדקנות, למחלות הקשורות לגיל, לניוון עצבי ולאריכות ימים 54,55. פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקור את הקשרים האלה באמצעות תיוג איזוטופים יציב של חומצות אמינו בתרבית תאים כדי למדוד את שיעורי תחלופת החלופה של חלבונים בתאי סנסנציה. עם זאת, קיימות שיטות מקבילות רבות לביצוע מחקרים בהקשר של הזדקנות וניוון עצבי in vivo באורגניזמים שלמים כגון עכברים. ואכן, מחקרים אלה הדגישו את החשיבות של מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בהקשר של מחלות הקשורות לגיל 56,57,58,59.
במחקר זה, חלבונים ריבוזומליים וחלבונים המתגוררים ברשתית האנדופלסמית בלטו כשתי קטגוריות של חלבונים עם ירידה ועלייה במחצית החיים בתאי הסנסציה, בהתאמה. בעוד שניתוח נוסף של רמות מצב יציב נדרש למסקנות סופיות, תוצאות אלה מצביעות עוד יותר על כך שתאים סנסנטיים עשויים לווסת באופן ייחודי את התרגום באמצעות ירידה בחצי החיים של חלבונים ריבוזומליים. בהמשך, יישום גישות יציבות לתיוג איזוטופים כדי לחקור את הקשר בין סנסנציה תאית לניוון עצבי in vivo במודלים של עכברים יהיה הרחבה מבטיחה של גישת תיוג האיזוטופים המתוארת על ידי פרוטוקול זה.

סנסנציה זוהתה לראשונה כמצב של עצירת גדילה בלתי מוגבלת שהוצגה על ידי תאים ראשוניים בתרבית לאחר שהגיעו לתשישותמשוכפלת 1. מאז הוכח כי סנסנציה יכולה להיווצר בתגובה לעלבונות תאיים רבים, כולל לחצים גנוטוקסיים, מיטוכונדריאליים ואונקוגניים, בין היתר2. בעוד של-senescence יש מספר תפקידים חשובים מבחינה פיזיולוגית, כגון דיכוי גידולים וריפוי פצעים, הצטברות של תאים סנסנטיים במהלך ההזדקנות קשורה לשורה של השפעות מזיקות על הבריאות3, כולל מספר מצבים נוירודגנרטיביים 4,5,6. סנסנציה תאית מתרחשת במספר סוגי תאי מוח, כולל תאי עצב 7,8,9,10, אסטרוציטים11, מיקרוגליה12 ומבשרי אוליגודנדרוציטים13, ותורמת לניוון עצבי ולתפקוד קוגניטיבי לקוי. אוליגומרים עמילואידים בטא, אחד מסימני ההיכר של מחלת האלצהיימר14, הוכחו כמאיצים את הסנסנציה העצבית 13,15,16. שכיחות מוגברת של תאים סנסנטיים נקשרה גם למחלת פרקינסון17, במיוחד כתוצאה מגורמי עקה סביבתיים11,18. חשוב לציין כי חיסול סלקטיבי של תאים סנסנטיים במודלים פרה-קליניים מאריך את תוחלת החיים וממתן מספר רב של מחלות הקשורות לגיל 3,5,12 ומשפר ליקויים קוגניטיביים 8,11,12,13. תאי סנסנט התגלו אפוא כמטרות טיפוליות מבטיחות לטיפול במצבים רבים הקשורים לגיל.
חלק גדול מההשפעה המזיקה של תאים סנסנטיים נגרם על ידי הפנוטיפ המפריש הקשור לסנסנציה (SASP), תערובת מורכבת של מולקולות ביו-אקטיביות המופרשות על ידי תאים סנסנטיים שיכולים לגרום לדלקת מקומית, אנגיוגנזה, הרס המטריצה החוץ-תאית והתפשטות הסנסנציה ברקמה הסובבת 19,20,21 . ה-SASP מייצג גם תופעה ביולוגית מעניינת של סנסנציה משום שהיא דורשת מאמץ שעתוק ותרגום ניכר במהלך מצב של עצירת מחזור התא. למעשה, הודגם כי תאים סנסנטיים מראים ירידה בביוגנזה של ריבוזומים22,23,24 שאמורה להפחית את סינתזת החלבון. במקום זאת, תאים סנסנטיים מתרגמים בחוזקה חלבונים מסוימים, במיוחד גורמי SASP, ומשפיעים על חילוף החומרים של הרקמה הסובבת25. לפיכך, יש עניין רב בהבנת האופן שבו תאים סנסנטיים העוברים עצירה קבועה של מחזור התא ממשיכים לשמור על הומאוסטזיס של חלבונים ובמקביל מבטאים בחוזקה גורמי SASP וחלבונים נבחרים אחרים.
שיטה זו מתארת כיצד להשתמש בספקטרומטריית מסות ובתיוג איזוטופים יציבים על ידי חומצות אמינו בתרבית תאים (pSILAC) כדי למדוד באופן גלובלי את זמן מחצית החיים של חלבונים בתאים סנסנטיים בקנה מידה רחב של פרוטאום. ב-SILAC המסורתית, תאים בתרבית מסומנים לחלוטין מבחינה מטבולית באיזוטופים כבדים וקלים שאינם רדיואקטיביים של חומצות אמינו לניתוח במורד הזרם של שפע חלבונים. שיטה זו יושמה בעבר כדי להעריך שינויים בשפע באופן מקיף וכמותי ב- SASP של פיברובלסטים מתורבתים26. ב-pSILAC, התאים מסומנים באופן דומה מבחינה מטבולית עם פולס של איזוטופ כבד העוקב אחר תיוג מראש עם איזוטופ קל, ולאחר מכן נקטפים במרווחי זמן אחד או יותר. קצבי השילוב של איזוטופים כבדים בהתייחס לאיזוטופים קלים קיימים משמשים לאחר מכן לחישוב קצבי תחלופת חלבונים יחסיים. באופן כללי, איזוטופים של ארגינין וליזין משמשים מכיוון שטריפסין מבקע את השאריות האלה; לפיכך, כל הפפטידים מעיכול סטנדרטי יכילו באופן פוטנציאלי את התווית הכבדה. זוגות של פפטידים הנבדלים זה מזה רק על ידי נוכחות או היעדרות של ליזין כבד או ארגינין זהים מבחינה כימית וניתן להבדיל ביניהם ולכמת אותם על ידי ספקטרומטר מסה. לאחר ניתוח ספקטרומטריית מסות, ניתן לזהות פפטידים כסינתזה חדשה או כקיימים מראש בהתבסס על נוכחות או היעדר התווית האיזוטופית בזיהויי הפפטידים המתקבלים. לאחר מכן ניתן לקבוע את שיעורי תחלופת החלבון על ידי התאמת היחס בין פפטידים כבדים (13 C-15N) על פני פפטידים קלים (12 C-14N) עבור חלבון נתון למודלים קינטיים לצמיחה מעריכית או דעיכהשל 27,28. pSILAC שימשה במספר השוואות של שיעורי תחלופת חלבונים 29,30,31,32 והיא כיום השיטה המקיפה ביותר ובעלת התפוקה הגבוהה ביותר למדידת זמן מחצית חיים של חלבונים.
פרוטוקול זה מפרט את הכנתם של תאים סנסנטיים במקביל לתאים קשים שנעצרו באופן דומה בתרבית, ולאחר מכן תיוג מטבולי עם pSILAC. לאחר מכן נקטפים תאים, הופכים להומוגניים לליסאטים ומעובדים לצורך רכישה וניתוח של ספקטרומטריית מסות. הנתונים המתקבלים מספקטרומטריית מסות משמשים לאחר מכן לקביעת זמן מחצית החיים של חלבונים באמצעות שיטה כמותית פשוטה המשתמשת בנקודת זמן אחת ובחישובי זמן מחצית חיים המבוצעים בגיליון אלקטרוני. באמצעות גישה זו, ניתן למדוד הערכות של זמן מחצית חיים של חלבונים באופן מקיף וכמותי, אותנטי יותר לתנאים תאיים לא מופרכים מאשר פרוטוקולים המשתמשים בחוסמים של סינתזה או תחלופה של חלבונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammacel 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td></td>
			<td>Cesium Irradiator for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-90 primary lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iRT Kit (indexed retention time)</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td>Indexed Retention Time Peptide Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>423835000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Mascot Daemon 2.8</td>
			<td>Proteomic database searching software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q Exactive HF Orbitrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>327110025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline</td>
			<td>University of Washington</td>
			<td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td>
			<td>Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator waterbath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-516R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Referred to as phenol in text; hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPle Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (sequencing grade)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry

עדויות הולכות וגוברות הראו כי הצטברות של תאים סנסנטיים במערכת העצבים המרכזית תורמת להפרעות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר ומחלות פרקינסון. סנסנציה תאית היא מצב של עצירת מחזור תאים קבועה המתרחשת בדרך כלל בתגובה לחשיפה ללחצים תת-קטלניים. עם זאת, כמו תאים אחרים שאינם מתחלקים, תאים סנסנטיים נשארים פעילים מבחינה מטבולית ומבצעים פונקציות רבות הדורשות דרישות שעתוק ותרגום ייחודיות ושינויים נרחבים בפרוטאום התוך תאי והמופרש. הבנת האופן שבו סינתזת חלבונים וקצבי דעיכה משתנים במהלך הסנסנציה יכולה להאיר את המנגנונים הבסיסיים של סנסנציה תאית ולמצוא דרכים טיפוליות פוטנציאליות למחלות שהוחמרו על ידי תאים סנסנטיים. מאמר זה מתאר שיטה להערכה בקנה מידה של פרוטאום של זמן מחצית חיים של חלבונים בתאים שאינם מתחלקים באמצעות תיוג איזוטופים יציב בפולסים על ידי חומצות אמינו בתרבית תאים (pSILAC) בשילוב עם ספקטרומטריית מסה. pSILAC כולל תיוג מטבולי של תאים עם גרסאות יציבות המכילות איזוטופים כבדים של חומצות אמינו. יחד עם גישות מודרניות של ספקטרומטריית מסות, pSILAC מאפשר מדידה של תחלופת חלבונים של מאות או אלפי חלבונים בתערובות מורכבות. לאחר תיוג מטבולי, ניתן לקבוע את דינמיקת התחלופה של חלבונים על סמך העשרה יחסית של איזוטופים כבדים בפפטידים שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסות. בפרוטוקול זה, מתוארת זרימת עבודה עבור יצירת תרביות פיברובלסטים סנסנטיות ופיברובלסטים רזיסטיים שנעצרו באופן דומה, כמו גם pSILAC פשוט ונקודתי חד פעמי המתייג מהלך זמן הממקסם את הכיסוי של שיעורי תחלופת החלבון הצפויים. יתר על כן, מוצג צינור לניתוח נתוני ספקטרומטריית מסה pSILAC וחישוב ידידותי למשתמש של שיעורי פירוק חלבונים באמצעות גיליונות אלקטרוניים. ניתן להרחיב את היישום של פרוטוקול זה מעבר לתאים סנסנטיים לכל תאי תרבית שאינם מתחלקים כגון נוירונים.

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשוואה גלובלית של זמן מחצית החיים של חלבונים בין תאי בקרה סנסנטיים לתאי בקרה סנסנטיים ולא מתחלקים, באמצעות pSILAC ונקודות זמן מינימליות. פרוטוקול זה מפרט את יצירתם של תאים סנסנטיים וקוויסנטים בתרבית, תיוג מטבולי של תאים עם איזוטופים יציבים של ארגינין וליזין במשך 3 ימים, כימות השפע היחסי של איזוטופים פפטידיים כבדים וקלים על ידי ספקטרומטריית מסות, וחישוב פשוט ונגיש של זמן מחצית חיים של חלבונים באמצעות נוסחאות גיליון אלקטרוני (איור 1). שיטה זו גמישה מאוד וניתן להתאים אותה לסוגי תאים ותנאים רבים.
כחלק מהדור של תאים סנסנטיים עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בשתי שיטות לאימות סנסנציה: SA-β תאים חיוביים-גל שהומחשו על ידי מיקרוסקופיה ורמות מוגברות של סמנים סנסנטיים המכומתים באמצעות ניתוח RT-qPCR. המדידה של סמנים סנסנטיים אמורה להניב הבחנות ברורות בין תאים קוויסנטיים וסנסנטיים כדי שהשוואות בין שתי אוכלוסיות התאים ייחשבו תקפות. עבור פעילות SA-βGal, תאים סנסנטיים צריכים להיראות כחולים בעוד שלתאי בקרה קוויזנטיים אין צבע או מעט מאוד צבע (איור 2A). ניתן לכמת בדיקה זו על ידי ספירת התאים החיוביים, המוכתמים בכחול כאחוז ממספר התאים הכולל, ולאחר מכן השוואת שיעור החיוביות באחוזים בין שליטה קוויזנטית לתאים סנסנטיים. חשוב שפרוטוקול זה יבוצע בו זמנית לצורך השוואה בין שני מצבי התא; פעילות SA-βGal מסתמכת על ה-pH של תמיסת הכתם, כך שהתוצאות יכולות להשתנות באופן משמעותי בין הבדיקות ויש לראות בהן מדד איכותי.
ניתוח RT-qPCR של סמנים סנסנטיים יראה רמות גבוהות של mRNA המקודדים גורמי SASP (IL6, CXCL8, IL1B) ומעכבי מחזור התא (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) ברוב המודלים הסנסנטיים. אף על פי ששונות מסוימת צפויה בהתבסס על סוג התא, מצב התרבית והמשרה הסנסנטי41,42, רוב התאים הסנסנטיים מציגים יותר מפי חמישה רמות גבוהות יותר של IL6, CXCL8 ו-CDKN1A/p21 mRNA בהשוואה לתאי בקרה קוויסנטיים בהשוואה לתאי בקרה קוויסנטיים; לעומת זאת, הרמות של LMNB1 ו-PCNA mRNA, המקודדות סמני התפשטות, צריכות להיות נמוכות או נעדרות בתאים סנסנטיים בהשוואה לתאים שקטים (איור 2B). יחד, אחוז משמעותי של חיוביות SA-βGal והביטוי הצפוי של פאנל של סמני mRNA הקשורים לסנסנציה מספיקים כדי לאשר את האינדוקציה של סנסנציה בניסוי.
עיבוד דגימות חלבון לניתוח ספקטרומטריית מסות מורכב מעיכול בתמיסה (2 ימים) ומיצוי בפאזה מוצקה (4-6 שעות). כדי לבצע ניתוח פרוטאומי לא ממוקד, הפפטידים המתקבלים נשלחים לניתוח LC-MS/MS באמצעות רכישה תלוית נתונים (DDA). במכשירי Orbitrap, ניתן לציין שיטת DDA בעורך התוכנה של מכשיר ספקטרומטריית המסה. הגדרות ספקטרומטר המסה שבהן נעשה שימוש במחקר זה מוצגות באיור 3A. ניתן לציין גם הגדרות כרומטוגרפיה נוזלית בתוך עורך השיטה. לצורך מחקר זה נעשה שימוש בשיפוע ליניארי של 90 דקות עם פאזה אורגנית גוברת (אצטוניטריל) (איור 3B). לאחר רכישה מוצלחת, זרם היונים הכולל (TIC) אמור להכיל אות אינטנסיבי במהלך חלק השיפוע הליניארי של השיטה (איור 3C). פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול לדוגמה במכשיר Orbitrap, אך ניתן לבצע את חישוב זמן מחצית החיים של החלבון על נתונים המתקבלים מכל ספקטרומטר מסה שנאסף במצב DDA, הזמין במספר סוגים של מכשירים (למשל, Orbitraps ומכשירים לזמן טיסה) וספקים. הגדרות הרכישה יהיו ייחודיות לסוג ולתצורה של המכשיר בו נעשה שימוש, ומומלץ להשתמש בהגדרות המוצעות על ידי מתקן ספקטרומטריית המסה. שיטה זו תואמת גם לשיטות שאינן DDA (SRM, PRM, DIA), כל עוד ניתן לחלץ אזורי שיא כרומטוגרפיים כמותיים עבור פסגות כבדות וקלות מקבצי הנתונים הגולמיים ולהזין אותם לנוסחאות הגיליון האלקטרוני.
חיפוש בקבצי ספקטרומטריית מסות גולמיות מתבצע באמצעות אחד מכלי החיפוש הרבים הזמינים במאגרי מידע פרוטאומיים כדי לזהות פפטידים וחלבונים. לדוגמה, מחקר זה השתמש במנוע החיפוש Mascot43. כדי להשיג אזורי שיא כרומטוגרפיים לכימות של פפטידים כבדים וקלים, תוצאות החיפוש של מסד הנתונים מיובאות לתוכנה פרוטאומית המסוגלת לאזורי שיא כרומטוגרפיים כגון Skyline39,40. בדיקה של כרומטוגרמות היונים המופקות של פפטידים (איור 4) תגלה את היחס היחסי של אותות פפטידים כבדים וקלים. שיעור נמוך יותר של אות פפטיד כבד ביחס לאות פפטידי קל בתאי סנסנט מצביע על קצב תחלופה איטי יותר של חלבונים (איור 4A), ואות פפטיד כבד יותר ביחס לאור מצביע על קצב תחלופת חלבונים מהיר יותר (איור 4B). הדגימות ללא תווית אמורות להראות מעט אות פפטידי כבד, אם בכלל. כל אות פפטיד כבד לכאורה בדגימות ללא תווית נחשב לרעשי רקע ויופחת במהלך החישובים הסופיים. יש לייצא כימות של אזורי שיא כרומטוגרפיים עבור פפטידים קלים וכבדים לכל תנאי הטיפול והתיוג לצורך חישוב מאוחר יותר של שיעורי תחלופת חלבונים וניתוח סטטיסטי.
על ידי שימוש בניתוח נקודת זמן בודדת, הכימות של זמן מחצית החיים של חלבון הוא פשוט לביצוע וניתן לעשות זאת בנוחות בגיליונות אלקטרוניים. בטבלה 3 חושבו זמן מחצית החיים של 695 חלבונים שזוהו מניתוח ספקטרומטריית המסות. החל משפע איזוטופים כבדים וקלים ברמת החלבון עבור כל חלבון בדגימות (קלט עבור גיליון הנתונים הגולמיים 1), איזוטופ כבד באחוזים (המכונה יחס, R) מחושב באופן אוטומטי על הגיליון שכותרתו 2) יחס H | ח + ל. בשלב זה, ה-R מדגימות כבדות מסומנות מנורמל על ידי חיסור ה-R מדגימות ללא תווית כדי לייצר R סופי עבור המשולשים הקוויזנטיים והסנסנטיים. מכיוון שדגימות ללא תווית לא אמורות לכלול איזוטופ כבד שנוסף באופן אקסוגני, הן משמשות לחיסול אות הרקע. מ- R, kdeg (שיעור מחזור) מחושב באמצעות הנוסחה הבאה:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
זמן מחצית החיים (H, בימים) נקבע עבור כל חלבון בבקרת ה-quiescent וב-senescent trilicates (גיליון שכותרתו 3) Half-Life (ימים)) באמצעות הנוסחה הבאה:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
לאחר מכן, זמן מחצית החיים הזה ממוצע בין המשולשים הקווסנטיים והסנסנטיים כדי ליצור זמן מחצית חיים ממוצע שקט וסנסנטי עבור כל חלבון, כמו גם ערך p. לאחר מכן מסוננים מחצית חיים מחושבים עבור ערכים שליליים, המתרחשים כאשר האות הכבד מתאים המסומנים באור (הרקע) גדול יותר מהאות הכבד מתאים בעלי תווית כבדה. סינון זה הביא ל-707 חלבונים מתוך 841 שזוהו עם זמן מחצית חיים תקף עבור התוצאות שהוצגו כאן.
לאחר מכן מדווחים על זמן מחצית החיים כיחס של לוג2 של סנסציה על פני תאי בקרה שקטים (log2FC) ומתוותים בחלקת הר געש (איור 5). לדוגמה, על-ידי התבוננות בגיליון 5) Analysis, ניתן לראות את החלבון של קולטן תרומבין קרישה II (F2R) כבעל זמן מחצית חיים בתאים שקטים של 0.51 ימים (עמודה B) ומחצית חיים בתאים סנסנטיים של 1.07 ימים (עמודה C) שהניבה יומן2FC של ~1.06 (עמודה D) עם ערך p של 0.001.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> איור 1: דיאגרמה של זרימת העבודה של pSILAC עבור תאי בקרה סנסנטיים וקוויזנטיים. פיברובלסטים אנושיים מסוג IMR-90 שימשו להכנת תרביות תאים שקטות (דלות סרום) או סנסנטיות (IR) לצורך השוואה של זמן מחצית חיים של חלבונים. לאחר מכן סומנו התאים ב-SILAC Light או SILAC מדיה כבדה עם ארגינין איזוטופי וליזין במשך 3 ימים. ליסאטים הוצאו מתאים, עוכלו, הושפלו ונותחו באמצעות ספקטרומטריית מסות. פסגות איזוטופים כבדים וקלים של פפטידים תואמים לפפטידים מסונתזים וקיימים חדשים, בהתאמה. מחצית החיים חושבה באמצעות משוואה לדעיכה מעריכית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> איור 2: אימות של פנוטיפים סנסנטיים באמצעות ניתוחי SA-βGal ו-RT-qPCR. (A) תאים סנסנטיים וקוויזנטיים מצופים מחדש בזמן הקציר לתוך צלחת בעלת 6 בארות ומוכתמים עבור SA-βGal באמצעות ערכת הכתמים SA-βGal. הצבע הכחול בגוף התא חיובי לסנסנציה. התמונות צולמו בשדה בהיר עם צבע בהגדלה של פי 10, סמן גודל באדום. (B) ניתוח RT-qPCR המשווה בין תאים סנסנטיים (אדומים) ותאים מחזוריים (אפורים) מניסוי שאינו קשור. עליות ברמות של CDKN1A/p21, CXCL8 ו-IL6 mRNA מעידות על סנסנציה, כמו גם הירידה ברמות ה-mRNA של LMNB1 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> איור 3: שיטות מייצגות לסריקות רכישה תלויות נתונים (DDA) ולשיפוע כרומטוגרפיה נוזלית של תרביות pSILAC בספקטרומטר המסה Q-Exactive HF orbitrap. (A) הגדרות מכשירים מומלצות בתוכנת המכשירים לניתוח תלוי נתונים של ליזטים של תאים שלמים מניסוי pSILAC. (B) הגדרות לדוגמה של שיטת גרדיאנט זרימת כרומטוגרפיה נוזלית. פפטידים מתחמקים מעל שיפוע ליניארי של 90 דקות הנע בין 5% ל-35% buffer B (0.2% חומצה פורמית ו-99.8% אצטוניטריל), ולאחר מכן שטיפה של 10 דקות עם 80% מאגר B, ו-25 דקות של שיווי משקל עם 5% buffer B. (C) כרומטוגרמה כוללת מייצגת של יונים כוללים (TIC) של רכישת ספקטרומטריית מסה של פפטידים פיברובלסטים IMR-90 שנרכשו עם ההגדרות שצוינו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> איור 4: כרומטוגרמות יונים מופקות מייצגות של פפטידים עם תחלופה משתנה במהלך הסנסנציה. (A) אזורי שיא כרומטוגרפיים של הפפטיד FQMTQEVVCVCDECPNVK++ מתת-המשפחה ההומולוגית DnaJ של החלבון B חבר 11 (DNAJB11) בתאים סנסנטיים ולא סנסנטיים. לאחר 3 ימים של SILAC, תאים סנסנטיים משלבים איזוטופים פחות כבדים בפפטיד זה בהשוואה לתאים ססגוניים (שאינם סנסנטיים), כפי שמעידה ירידה בשטח השיא של פפטיד כבד המכיל איזוטופים (כחול) ביחס לפפטיד האור (אדום), מה שמעיד על כך שפפטיד זה הפחית את התחלופה בתאים הסנסנטיים. (B) אזורי שיא כרומטוגרפיים של הפפטיד VQAQVIQETIVPK++ מגורם שחבור החלבון 3a תת-יחידה 1 (SF3A1) בתאים סנסנטיים ולא סנסנטיים. לאחר 3 ימים של SILAC, תאים סנסנטיים משלבים שיעור גבוה יותר של איזוטופים כבדים לתוך פפטיד זה בהשוואה לתאים שקטים (שאינם סנסנטיים), כפי שמעידה ירידה בשטח השיא של פפטיד כבד המכיל איזוטופים (כחול) ביחס לפפטיד האור (אדום), מה שמעיד על כך שלפפטיד זה יש תחלופה מוגברת בתאי סנסנט. התנאים ללא תווית (יום 0) אינם מראים שילוב של איזוטופים כבדים עבור שני הפפטידים, כצפוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> איור 5: השוואה בין זמן מחצית החיים של חלבונים בתאים סנסנטיים וקוויסנטיים שנקבעה מתיוג pSILAC. (A) תרשים הר געש המציג את יחס היומן2 של סנסנט / בקרה (שקט) עבור כל אחד מ-695 החלבונים שזוהו; בניסוי זה, מדיית תיוג קלה וכבדה לא הכילה גלוקוז ולא פנול אדום. (B) טבלאות המציגות את 10 החלבונים המובילים עם מחצית החיים המוגברת ביותר או המופחתת ביותר בתאים קוויסנטיים לעומת תאים סנסנטיים (שמאל וימין, בהתאמה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה 1: מדיה ובמאגרים המשמשים בפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: פריימרים RT-qPCR המשמשים בפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 3: חוברת עבודה לניתוח SILAC לחישוב זמן מחצית חיים של חלבון, שינויי קיפול ובדיקות t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה לתיוג מטבולי של תאים סניסנטיים ולא מתחלקים עם SILAC פועם, ניתוח ספקטרומטריית מסה לא ממוקדת וחישוב יעיל של זמן מחצית חיים של חלבונים.

מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בתאי תרבית סנסנטיים ולא מתחלקים באמצעות תיוג מטבולי וספקטרומטריית מסה

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

האופן שבו תאים שומרים על הומאוסטזיס של חלבונים אינו מובן היטב בהקשר של לחץ תאי וסנסנציה. בפרוטוקול זה, אנו מספקים דרך פשוטה ומדויקת לחישוב תחלופת חלבונים, שהיא מרכיב מרכזי בהומאוסטזיס של חלבונים בתאים חיים. Pulse SILAC נותן לנסיין את היכולת למדוד תחלופת חלבונים עבור חלבונים בודדים והפרוטאום כולו באופן בעל תפוקה גבוהה שהוא גם אותנטי יותר למערכות ביולוגיות מאשר שיטות אחרות.העקרונות של שיטה זו יכולים להיות מיושמים על כל מערכת שניתן לסמן מטבולית, כולל אורגניזמים שלמים. שיטה זו יכולה גם להוביל לתובנות על סנסנציה תאית, הזדקנות ומחלות נוירודגנרטיביות. ניתוח ספקטרומטריית מסה רגיש מאוד למזהמים כימיים מסוימים, כגון דטרגנטים.השתמש בריאגנטים ברמת LC-MS לאורך כל ההליך הזה כדי להבטיח איסוף נתונים באיכות גבוהה. כדי להתחיל את הסימון המטבולי של התאים, החלף את המדיה עבור שלוש צלחות כל אחת של תאים senescent ו quiescent עם 30 מיליליטרים של SILAC אור מדיה. בנפרד, החלף את המדיום לשלושה לוחות סנסנט ושלושה לוחות קווסנטיים ב-30 מיליליטרים של SILAC Heavy.לגדל את התאים במשך שלושה ימים מבלי לשנות את המדיום. כדי לנתק את התאים מלוחות התרבית, הוסיפו חמישה מיליליטרים של מגיב טריפסין שחומם מראש לכל צלחת ודגרו את הלוחות במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר, החייאת התאים המנותקים בחמישה מיליליטרים של אותה מדיה המשמשת לתרבית לנפח כולל של 10 מיליליטרים.לאחר מכן, העבירו את התאים לקרח וצנטריפוגות התאים ב-300 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הכדור פעמיים, סובבו שוב את התאים והסירו את הסופרנאטנט לפני החייאה של הכדור ב-150 מיקרוליטרים של אוריאה בת שמונה טוחנים שהוכנו זה עתה ו-50 מילימולר אמוניום ביקרבונט ליזה. מערבבים את תכולת הצינור על ידי צנרת למעלה ולמטה.Aliquot 50 מיקרוגרם של דגימת החלבון לתוך צינור חדש ומביא דגימות לנפחים שווים עם מאגר ליזיס. לאחר מכן מוסיפים את dithiothreitol לריכוז סופי של 20 מילימולר לצינור ודגירה של הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם רעידות. אפשרו לדגימה להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני הוספת יודואצטאמיד לריכוז סופי של 40 מילימולאר ודגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות.לאחר מכן דיללו את הדגימה אל מתחת לאוריאה טוחנת אחת עם חיץ אמוניום ביקרבונט של 50 מילימולאר. הוסיפו מיקרוגרם אחד של טריפסין ל-50 מיקרוגרם של חלבון מתחיל או ביחס של 1:50 טריפסין לחלבון לדגימה. דגירו את הדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות לעיכול חלבונים לפפטידים.למחרת, הוסיפו חומצה פורמית ל-1% לפי נפח הדגימה כדי להרוות את עיכול החלבון. לניקוי הדגימה, הניחו מחסנית מיצוי בפאזה מוצקה על סעפת ואקום, באמצעות מחסנית חילוץ אחת לכל דגימה, בהתאם להנחיות היצרן. לאחר המיצוי, הסר את דגימות הפפטידים מסעפת הוואקום וייבש אותן לחלוטין ברכז ואקום.הייבוש אורך כשלוש שעות. עבור ספקטרומטריית המסה, או ניתוח MS, בצעו החייאה של דגימת הפפטיד בריכוז של 400 ננוגרם למיקרוליטר במאגר חומצה פורמית של 0.2%. כדי להרגיע מחדש את הפפטידים, יש לערבב את הדגימה במשך חמש דקות.לאחר מכן, sonicate במשך חמש דקות ב sonicator אמבט מים. לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימה כדי להעיף את החומרים הבלתי מסיסים ולהעביר את הסופרנטנטים הפפטידיים לבקבוקוני MS. שלח את הדגימות לניתוח פרוטאומי באמצעות ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפית נוזלית, או LC-MS-MS.השתמש בהגדרות המומלצות לניתוח לא ממוקד על ידי מתקן ספקטרומטריית המסות. טען את הדגימות על עמודה אנליטית עם קצב זרימה של 400 ננוליטרים לדקה כדי לרתום את הפפטידים על פני גרדיאנט ליניארי של 90 דקות באמצעות תערובת של ממסים אורגניים ואנאורגניים, כאשר הממס האורגני נע בין 5% ל-35% רכישת נתוני ספקטרומטריית מסה במצב תלוי נתונים, עם מחזור רציף של סריקות סקר MS1 ואחריו 20 סריקות MS2 תלויות נתונים עם פיצול HCD. לכמת את אזורי השיא של הפפטידים עבור פפטידים כבדים וקלים בכלי תוכנה לכמות פרוטאום.לאחר מכן, ייצאו את אזורי השיא הפפטידיים הכבדים והקלים. לחישוב זמן מחצית החיים של החלבון, פתח את חוברת העבודה של ניתוח SILAC לגיליון הראשון בשם Raw Data והדבק במזהי UniProt, שמות גנים, אזורי שיא כבדים וקלים בעמודות שצוינו. לאחר מכן, פתח את הגיליון הרביעי בשם Analysis והסר את השורות שבהן העמודות G ו- H מציינות שהמדגם נמצא מחוץ לטווח ושמור שורות הנקראות בטווח.הפנוטיפים הסנסנטיים אומתו באמצעות פעילות בטא-גלקטוזידאז הקשורה לסנסנציה וניתוח RT-qPCR. עבור פעילות הבטא-גלקטוזידאז, התאים הסנסנטיים נראו כחולים, בעוד שלתאי הבקרה הקוויזנטיים לא היה צבע או צבע מינימלי. בניתוח RT-qPCR, התאים הסנסנטיים הציגו אינטרלוקין-6, CXCL8 ו-CDKN1A-P21 mRNA גבוהים יותר בהשוואה לתאים הסוערים.לעומת זאת, רמת הקידוד של lamin B1 עבור סמן התפשטות הייתה נמוכה או נעדרה בתאי הסנסציה. כרומטוגרמות היונים שחולצו של פפטידים חשפו את היחס היחסי של אותות פפטידים כבדים וקלים. שיעור נמוך יותר של אותות פפטידים כבדים ביחס לתאים סנסנטיים קלים הצביע על קצב תחלופה איטי יותר של חלבונים, ואות פפטיד כבד גבוה יותר ביחס לאור הצביע על קצב תחלופת חלבונים מהיר יותר.הדגימות ללא תווית הראו מעט אות פפטידי כבד, אם בכלל. חושבו זמן מחצית החיים של 695 חלבונים שזוהו מניתוח ספקטרומטריית המסות. מחצית החיים מדווחת כיחס של לוג-שתיים של סנסנט על פני תאים שקטים ומתוותת בחלקת הר געש.לאחר חישוב שיעורי תחלופת החלבון בתאים סנסנטיים, ניתוח במורד הזרם עשוי לחשוף מסלולים ביולוגיים מועמדים המווסתים על ידי מנגנוני פרוטאוסטזיס. Pulse SILAC סלל את הדרך לחוקרים לחקור דינמיקה של חלבונים עם גרעיניות ותפוקה חסרות תקדים, מה שאפשר לנו לחקור שינויים בהומאוסטזיס של חלבונים בחלבונים בודדים רבים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

ספקטרומטריית מסה וגישות מבוססי Luminogenic לאפיון שלב I מטבולית כשירות של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא תרבויות

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

מדידת ופרשנות חמצן קצב הצריכה כולה לטוס הראש מקטעים

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...