Name: measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00
Duration: 8 min 52 s
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इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) और इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम (आईआरपी), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (एनआईए) द्वारा समर्थित किया गया था। एन.बी. दीर्घायु प्रोत्साहन अनुदान, और आहार की खुराक (ओडीएस) विद्वानों के कार्यक्रम के कार्यालय द्वारा समर्थित था। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

लेखकों के पास कोई खुलासा नहीं है।

सेनेसेंस को पहली बार रेप्लिकेटिव थकावट1 तक पहुंचने के बाद सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित अनिश्चितकालीन विकास गिरफ्तारी की स्थिति के रूप में पहचाना गया था। तब से यह दिखाया गया है कि सेनेसेंस कई सेलुलर अपमानों के जवाब में उत्पन्न हो सकता है, जिसमें जीनोटॉक्सिक, माइटोकॉन्ड्रियल और ऑन्कोजेनिक तनाव शामिल हैं, दूसरोंके बीच 2। जबकि सीनेसेंस में कई शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण भूमिकाएं हैं, जैसे कि ट्यूमर दमन और घाव भरने, उम्र बढ़ने के दौरान सेनेसेंट कोशिकाओं का संचय स्वास्थ्य3 पर हानिकारक प्रभावों के एक मेजबान के साथ जुड़ा हुआ है, जिसमें कई न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियां 4,5,6 शामिल हैं। सेलुलर सेनेसेंस कई मस्तिष्क कोशिका प्रकारों में होता है, जिसमें न्यूरॉन्स 7,8,9,10, एस्ट्रोसाइट्स11, माइक्रोग्लिया12, और ओलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत13 शामिल हैं, और न्यूरोडीजेनेरेशन और संज्ञानात्मक शिथिलता में योगदान देता है। एमिलॉइड बीटा ओलिगोमर्स, अल्जाइमर रोग 14 के हॉलमार्क में से एक, न्यूरोनल सेनेसेंस13,15,16 में तेजी लाने के लिए दिखाया गया है। सेनेसेंट कोशिकाओं की एक बढ़ी हुई व्यापकता को पार्किंसंस रोग17 के साथ भी जोड़ा गया है, विशेष रूप से पर्यावरणीय तनाव11,18 से उत्पन्न होता है। महत्वपूर्ण रूप से, पूर्व-नैदानिक मॉडल में सेनेसेंट कोशिकाओं का चयनात्मक उन्मूलन जीवनकाल का विस्तार करता है और उम्र से संबंधित बीमारियों की एक भीड़ को कम करता है 3,5,12 और संज्ञानात्मक घाटे में सुधार करताहै 8,11,12,13। सेनेसेंट कोशिकाएं इस प्रकार कई उम्र से संबंधित स्थितियों के उपचार के लिए आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में उभरी हैं।
सेनेसेंट कोशिकाओं का अधिकांश हानिकारक प्रभाव सेनेसेंस-संबद्ध स्रावी फेनोटाइप (एसएएसपी) के कारण होता है, जो सेनेसेंट कोशिकाओं द्वारा स्रावित बायोएक्टिव अणुओं का एक जटिल मिश्रण है जो स्थानीय सूजन, एंजियोजेनेसिस, एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के विनाश और आसपास के ऊतकों में सेनेसेंस का प्रसार कर सकता है 19,20,21 . एसएएसपी सेनेसेंस की एक दिलचस्प जैविक घटना का भी प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि इसे सेल चक्र गिरफ्तारी की स्थिति के दौरान काफी ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल प्रयास की आवश्यकता होती है। वास्तव में, सेनेसेंट कोशिकाओं को राइबोसोम बायोजेनेसिस22,23,24 में कमी का प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है जो प्रोटीन संश्लेषण को कम करना चाहिए। इसके बजाय, सेनेसेंट कोशिकाएं कुछ प्रोटीनों, विशेष रूप से एसएएसपी कारकों का दृढ़ता से अनुवाद करती हैं, और आसपास के ऊतक25 के चयापचय को प्रभावित करती हैं। इस प्रकार, यह समझने में काफी रुचि है कि कैसे एक स्थायी सेल चक्र गिरफ्तारी से गुजरने वाली सेनेसेंट कोशिकाएं प्रोटीन होमोस्टैसिस को बनाए रखना जारी रखती हैं, जबकि एक ही समय में एसएएसपी कारकों और अन्य चुनिंदा प्रोटीनों को मजबूती से व्यक्त करती हैं।
यह विधि वर्णन करती है कि सेल कल्चर (पीएसआईएलएसी) में अमीनो एसिड द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री और स्पंदित-स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग कैसे किया जाए ताकि विश्व स्तर पर प्रोटिओम-वाइड स्केल पर सेनेसेंट कोशिकाओं में प्रोटीन के आधे जीवन को मापा जा सके। पारंपरिक SILAC में, सुसंस्कृत कोशिकाओं को प्रोटीन बहुतायत के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अमीनो एसिड के भारी और हल्के गैर-रेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ पूरी तरह से चयापचय रूप से लेबल किया जाता है। इस विधि को पहले सुसंस्कृतफाइब्रोब्लास्ट्स 26 के एसएएसपी में व्यापक और मात्रात्मक रूप से बहुतायत परिवर्तनों का आकलन करने के लिए लागू किया गया है। पीएसआईएलएसी में, कोशिकाओं को इसी तरह भारी आइसोटोप की नाड़ी के साथ चयापचय रूप से लेबल किया जाता है जो प्रकाश आइसोटोप के साथ पूर्व-लेबलिंग का अनुसरण करता है, और फिर एक या एक से अधिक समय अंतराल पर काटा जाता है। पहले से मौजूद प्रकाश आइसोटोप के संदर्भ में भारी आइसोटोप को शामिल करने की दरों का उपयोग तब सापेक्ष प्रोटीन टर्नओवर दरों की गणना करने के लिए किया जाता है। आम तौर पर, आर्जिनिन और लाइसिन के आइसोटोप का उपयोग किया जाता है क्योंकि ट्रिप्सिन उन अवशेषों पर क्लीव्स करता है; इस प्रकार, मानक पाचन से सभी पेप्टाइड्स में संभावित रूप से भारी लेबल होगा। पेप्टाइड्स के जोड़े जो केवल भारी लाइसिन या आर्जिनिन की उपस्थिति या अनुपस्थिति से भिन्न होते हैं, रासायनिक रूप से समान होते हैं और एक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा विभेदित और परिमाणित किए जा सकते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद, पेप्टाइड्स को परिणामी पेप्टाइड पहचान में आइसोटोपिक लेबल की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर नए संश्लेषित या पूर्व-मौजूदा के रूप में पहचाना जा सकता है। प्रोटीन टर्नओवर दरों को तब प्रकाश (12सी -14एन) पेप्टाइड्स पर भारी (13सी -15एन) के अनुपात को घातीय विकास या क्षय27,28 के लिए गतिज मॉडल के लिए दिए गए प्रोटीन के लिए फिट करके निर्धारित किया जा सकता है। pSILAC का उपयोग प्रोटीन टर्नओवर दरों29,30,31,32 की कई तुलनाओं में किया गया है और वर्तमान में प्रोटीन आधे जीवन के माप के लिए सबसे व्यापक और उच्च-थ्रूपुट विधि है।
यह प्रोटोकॉल संस्कृति में इसी तरह के विकास-गिरफ्तार क्विसेंट कोशिकाओं के साथ समानांतर में सेनेसेंट कोशिकाओं की तैयारी का विवरण देता है, जिसके बाद पीएसएलसी के साथ चयापचय लेबलिंग होती है। कोशिकाओं को तब काटा जाता है, लिसेट में homogenized, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए संसाधित किया जाता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री से प्राप्त डेटा का उपयोग तब एक सरलीकृत मात्रात्मक विधि का उपयोग करके प्रोटीन के आधे जीवन को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जिसमें एक एकल समय बिंदु और एक स्प्रेडशीट में किए गए आधे जीवन की गणना को नियोजित किया जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, प्रोटीन आधे जीवन के अनुमानों को एक व्यापक और मात्रात्मक तरीके से मापा जा सकता है जो प्रोटीन संश्लेषण या टर्नओवर के अवरोधकों का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल की तुलना में अनियंत्रित सेलुलर स्थितियों के लिए अधिक प्रामाणिक है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammacel 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td></td>
			<td>Cesium Irradiator for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-90 primary lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iRT Kit (indexed retention time)</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td>Indexed Retention Time Peptide Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>423835000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Mascot Daemon 2.8</td>
			<td>Proteomic database searching software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q Exactive HF Orbitrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>327110025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline</td>
			<td>University of Washington</td>
			<td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td>
			<td>Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator waterbath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-516R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Referred to as phenol in text; hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPle Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (sequencing grade)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry

बढ़ते सबूतों से पता चला है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सेनेसेंट कोशिकाओं का संचय अल्जाइमर और पार्किंसंस रोगों जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में योगदान देता है। सेलुलर सेनेसेंस स्थायी सेल चक्र गिरफ्तारी की एक स्थिति है जो आमतौर पर उप-घातक तनावों के संपर्क में आने के जवाब में होती है। हालांकि, अन्य गैर-विभाजित कोशिकाओं की तरह, सेनेसेंट कोशिकाएं चयापचय रूप से सक्रिय रहती हैं और कई कार्यों को पूरा करती हैं जिनके लिए अद्वितीय ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल मांगों और इंट्रासेल्युलर और स्रावित प्रोटिओम में व्यापक परिवर्तन की आवश्यकता होती है। यह समझना कि सेनेसेंस के दौरान प्रोटीन संश्लेषण और क्षय दर कैसे बदलती है, सेलुलर सेनेसेंस के अंतर्निहित तंत्र को रोशन कर सकती है और सेनेसेंट कोशिकाओं द्वारा बढ़ी हुई बीमारियों के लिए संभावित चिकित्सीय रास्ते पा सकती है। यह पेपर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में सेल संस्कृति (पीएसएलसी) में अमीनो एसिड द्वारा स्पंदित स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग करके गैर-विभाजित कोशिकाओं में प्रोटीन आधे जीवन के प्रोटीन के आधे जीवन के प्रोटिओम-स्केल मूल्यांकन के लिए एक विधि का वर्णन करता है। pSILAC में अमीनो एसिड के स्थिर भारी आइसोटोप युक्त संस्करणों के साथ कोशिकाओं का चयापचय लेबलिंग शामिल है। आधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण के साथ युग्मित, pSILAC जटिल मिश्रण में सैकड़ों या हजारों प्रोटीन के प्रोटीन टर्नओवर के माप को सक्षम बनाता है। चयापचय लेबलिंग के बाद, प्रोटीन की टर्नओवर गतिशीलता को मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाए गए पेप्टाइड्स में भारी आइसोटोप के सापेक्ष संवर्धन के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, एक वर्कफ़्लो को सेनेसेंट फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए वर्णित किया गया है और इसी तरह गिरफ्तार quiescent fibroblasts, साथ ही साथ एक सरलीकृत, एकल-समय बिंदु pSILAC लेबलिंग समय-पाठ्यक्रम जो प्रत्याशित प्रोटीन टर्नओवर दरों के कवरेज को अधिकतम करता है। इसके अलावा, एक पाइपलाइन pSILAC मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा के विश्लेषण और स्प्रेडशीट का उपयोग करके प्रोटीन गिरावट दरों की उपयोगकर्ता के अनुकूल गणना के लिए प्रस्तुत की जाती है। इस प्रोटोकॉल के आवेदन को सेनेसेंट कोशिकाओं से परे किसी भी गैर-विभाजित सुसंस्कृत कोशिकाओं जैसे न्यूरॉन्स तक बढ़ाया जा सकता है।

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Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

यह प्रोटोकॉल स्पंदित SILAC, untargeted मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण, और प्रोटीन आधे जीवन की एक सुव्यवस्थित गणना के साथ senescent और गैर-विभाजित कोशिकाओं के चयापचय लेबलिंग के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है।

मेटाबोलिक लेबलिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ सेनेसेंट और गैर-विभाजित सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रोटीन टर्नओवर दरों का मापन

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

कोशिकाएं प्रोटीन होमियोस्टैसिस को कैसे बनाए रखती हैं, यह सेलुलर तनाव और सेनेसेंस के संदर्भ में अच्छी तरह से समझा नहीं जाता है। इस प्रोटोकॉल में, हम प्रोटीन टर्नओवर की गणना करने का एक सरल और सटीक तरीका प्रदान करते हैं, जो जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन होमियोस्टैसिस का एक प्रमुख घटक है। पल्स SILAC एक प्रयोगकर्ता को व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए प्रोटीन टर्नओवर को मापने की क्षमता देता है और पूरे proteome को एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से मापता है जो अन्य तरीकों की तुलना में जैविक प्रणालियों के लिए भी अधिक प्रामाणिक है।इस विधि के सिद्धांतों को किसी भी प्रणाली पर लागू किया जा सकता है जिसे चयापचय रूप से लेबल किया जा सकता है, जिसमें पूरे जीव शामिल हैं। यह विधि सेलुलर सीनेसेंस, उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में अंतर्दृष्टि का कारण भी बन सकती है। मास-स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण कुछ रासायनिक संदूषकों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, जैसे कि डिटर्जेंट।उच्च गुणवत्ता वाले डेटा संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया के दौरान एलसी-एमएस-ग्रेड अभिकर्मकों का उपयोग करें। कोशिकाओं के चयापचय लेबलिंग शुरू करने के लिए, SILAC लाइट मीडिया के 30 मिलीलीटर के साथ सेनेसेंट और क्विसेंट कोशिकाओं में से प्रत्येक में से प्रत्येक तीन प्लेटों के लिए मीडिया को बदलें। अलग से, SILAC भारी के 30 मिलीलीटर के साथ तीन senescent और तीन quiescent प्लेटों के लिए माध्यम को बदलें।माध्यम को बदलने के बिना तीन दिनों के लिए कोशिकाओं को विकसित करें। संस्कृति प्लेटों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए, प्रत्येक प्लेट में पूर्व-गर्म ट्रिप्सिन अभिकर्मक के पांच मिलीलीटर जोड़ें और प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। बाद में, संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही मीडिया के पांच मिलीलीटर में अलग कोशिकाओं को 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा में फिर से निलंबित कर दिया।इसके बाद, कोशिकाओं को बर्फ में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को चार डिग्री सेल्सियस पर 300 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। गोली को दो बार धोने के बाद, कोशिकाओं को फिर से स्पिन करें और ताजा तैयार आठ-दाढ़ यूरिया और 50-मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट लाइसिस बफर के 150 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करने से पहले supernatant को हटा दें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ट्यूब की सामग्री मिश्रण.एक नई ट्यूब में प्रोटीन के नमूने के 50 माइक्रोग्राम ऐलीकोट करें और लाइसिस बफर के साथ समान मात्रा तक नमूनों को लाता है। फिर ट्यूब में 20-मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता में डाइथिओथ्रिटोल जोड़ें और मिलाते हुए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें। नमूने को 40-मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता में आयोडोएसीटामाइड जोड़ने और 30 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने से पहले 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दें।फिर नमूने को 50-मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर के साथ एक-दाढ़ यूरिया से नीचे तक पतला करें। शुरुआती प्रोटीन के 50 माइक्रोग्राम के लिए ट्रिप्सिन का एक माइक्रोग्राम जोड़ें या नमूने के लिए प्रोटीन अनुपात में 1:50 ट्रिप्सिन पर जोड़ें। पेप्टाइड्स में प्रोटीन को पचाने के लिए मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने को इनक्यूबेट करें।अगले दिन, प्रोटीन पाचन को बुझाने के लिए नमूने की मात्रा से 1% तक फॉर्मिक एसिड जोड़ें। नमूना सफाई के लिए, निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार, प्रत्येक नमूने के लिए एक निष्कर्षण कारतूस का उपयोग करके, एक वैक्यूम मैनिफोल्ड पर एक ठोस-चरण निष्कर्षण कारतूस रखें। निष्कर्षण के बाद, वैक्यूम कई गुना से पेप्टाइड नमूनों को हटा दें और उन्हें पूरी तरह से वैक्यूम कंसंट्रेटर में सुखा लें।सूखने में लगभग तीन घंटे लगते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री, या एमएस विश्लेषण के लिए, पेप्टाइड नमूने को 0.2% फॉर्मिक एसिड बफर में 400 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की एकाग्रता पर फिर से निलंबित कर दिया। पेप्टाइड्स को फिर से स्थिर करने के लिए, पांच मिनट के लिए नमूने को मिलाएं।फिर, एक पानी स्नान sonicator में पांच मिनट के लिए sonicate. फिर, अघुलनशील सामग्री को गोली मारने और एमएस शीशियों में पेप्टाइड supernatants हस्तांतरण करने के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। तरल क्रोमैटोग्राफी टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री, या एलसी-एमएस-एमएस का उपयोग करके प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए नमूने सबमिट करें।मास स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा द्वारा अनलक्षित विश्लेषण के लिए अनुशंसित सेटिंग्स का उपयोग करें। कार्बनिक और अकार्बनिक सॉल्वैंट्स के मिश्रण का उपयोग करके 90 मिनट के रैखिक ढाल पर पेप्टाइड्स को समाप्त करने के लिए प्रति मिनट 400 नैनोलीटर की प्रवाह दर के साथ एक विश्लेषणात्मक स्तंभ पर नमूनों को लोड करें, जिसमें कार्बनिक विलायक 5 से 35% तक होता है डेटा-निर्भर मोड में मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा प्राप्त करें, एमएस 1 सर्वेक्षण स्कैन के एक निरंतर चक्र के साथ एचसीडी विखंडन के साथ 20 डेटा-निर्भर एमएस 2 स्कैन के बाद। Proteome मात्रा सॉफ्टवेयर उपकरण में भारी और हल्के पेप्टाइड्स के लिए पेप्टाइड पीक क्षेत्रों की मात्रा निर्धारित करें।फिर, भारी और हल्के पेप्टाइड पीक क्षेत्रों का निर्यात करें। प्रोटीन आधे जीवन की गणना के लिए, SILAC विश्लेषण कार्यपुस्तिका को कच्चे डेटा नामक पहले पत्रक पर खोलें और UniProt Id, जीन नाम, भारी और हल्के शिखर क्षेत्रों में इंगित स्तंभों में चिपकाएँ. फिर, विश्लेषण नामक चौथा पत्रक खोलें और उन पंक्तियों को निकालें जहाँ स्तंभ G और H इंगित करते हैं कि नमूना श्रेणी से बाहर है और श्रेणी के भीतर पढ़ने वाली पंक्तियों को रखें.सेनेसेंट फेनोटाइप को सेनेसेंस-संबद्ध बीटा-गैलेक्टोसिडेज़ गतिविधि और आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण का उपयोग करके मान्य किया गया था। बीटा-गैलेक्टोसिडेज़ गतिविधि के लिए, सेनेसेंट कोशिकाएं नीली दिखाई देती हैं, जबकि क्विसेंट नियंत्रण कोशिकाओं में कोई या न्यूनतम रंग नहीं था। RT-qPCR विश्लेषण में, senescent कोशिकाओं ने quiescent कोशिकाओं की तुलना में उच्च इंटरल्यूकिन -6, CXCL8, और CDKN1A-P21 mRNA प्रदर्शित किया।इसके विपरीत, प्रसार मार्कर के लिए लैमिन बी 1 एन्कोडिंग का स्तर सेनेसेंट कोशिकाओं में कम या अनुपस्थित था। पेप्टाइड्स के निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम ने भारी और हल्के पेप्टाइड संकेतों के सापेक्ष अनुपात का खुलासा किया। हल्के सेनेसेंट कोशिकाओं के सापेक्ष भारी पेप्टाइड संकेतों के कम अनुपात ने धीमी प्रोटीन टर्नओवर दर का संकेत दिया, और प्रकाश के सापेक्ष एक उच्च भारी पेप्टाइड सिग्नल ने तेजी से प्रोटीन टर्नओवर दर का संकेत दिया।बिना लेबल वाले नमूनों ने बहुत कम या कोई भारी पेप्टाइड संकेत नहीं दिखाया। मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहचाने गए 695 प्रोटीनों के लिए आधे जीवन की गणना की गई थी। आधे जीवन को क्विसेंट कोशिकाओं पर सेनेसेंट के लॉग-टू अनुपात के रूप में रिपोर्ट किया गया है और ज्वालामुखी प्लॉट में प्लॉट किया गया है।सेनेसेंट कोशिकाओं में प्रोटीन टर्नओवर दरों की गणना के बाद, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण उम्मीदवार जैविक मार्गों को प्रकट कर सकता है जो प्रोटियोस्टैसिस तंत्र द्वारा विनियमित होते हैं। पल्स एसआईएलएसी ने शोधकर्ताओं के लिए अभूतपूर्व ग्रैन्युलैरिटी और थ्रूपुट के साथ प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन करने का मार्ग प्रशस्त किया, जिससे हमें कई व्यक्तिगत प्रोटीनों में प्रोटीन होमियोस्टैसिस में परिवर्तन का अध्ययन करने में सक्षम बनाया गया।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless केशिका वैद्युतकणसंचलन मास जैविक नमूने मेटाबोलिक रूपरेखा के लिए स्पेक्ट्रोमेट्री

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

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Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

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The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

मापने और पूरे मक्खी प्रमुख क्षेत्रों में ऑक्सीजन की खपत दर की व्याख्या

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

पेप्टाइड संवर्धन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाना

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...