Name: measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) e dall'Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). N.B. è stato supportato da Longevity Impetus Grants e dall'Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

Gli autori non hanno divulgazioni.

pSILAC è una tecnica potente che consente la quantificazione globale dei tassi di turnover proteico in più condizioni cellulari. Questo documento descrive in dettaglio l'uso di pSILAC per confrontare le emivite proteiche globali tra cellule senescenti e quiescenti, comprese le istruzioni per la preparazione di cellule senescenti e quiescenti, l'etichettatura e la raccolta SILAC e, infine, l'analisi utilizzando la spettrometria di massa DDA. Inoltre, viene descritto un test in due fasi per la convalida del fenotipo della senescenza utilizzando l'analisi SA-βGal e RT-qPCR di un pannello di mRNA che codificano per proteine associate alla senescenza. Oltre alla validazione della senescenza con i due approcci descritti, una terza validazione della senescenza può essere eseguita a seguito di analisi di spettrometria di massa cercando cambiamenti nei marcatori di senescenza noti tra cellule senescenti e quiescenti a livello proteomico. Le proteine associate alla senescenza che dovrebbero essere elevate includono p16, p21 e BCL2, tra gli altri, descritti altrove44,45. Nel protocollo sopra descritto, le radiazioni ionizzanti sono state utilizzate per l'induzione della senescenza e la fame sierica per le cellule quiescenti. Per l'induzione della senescenza, ci sono più opzioni disponibili e c'è una sostanziale eterogeneità tra loro 41,42,46. Attualmente, non esiste un metodo senescente che sia considerato il "più fisiologico", quindi la scelta dell'induttore senescente è in gran parte basata sul contesto dell'esperimento. Tuttavia, gli esperimenti con l'obiettivo di affermare un fenomeno generale sulla senescenza sono raccomandati per utilizzare almeno due diversi induttori senescenti. Discutere la gamma di paradigmi di senescenza esula dallo scopo di questo articolo, ma alcuni metodi comuni per indurre la senescenza includono l'innesco di danni al DNA (IR, doxorubicina, esaurimento replicativo), l'espressione di proteine oncogeniche (HRAS, BRAF) e l'interruzione della funzione mitocondriale2.
Oltre alla scelta dell'induttore senescente, la scelta delle cellule di controllo è una considerazione altrettanto importante. Le cellule senescenti sono, per definizione, sotto arresto indefinito della crescita, quindi viene spesso scelto un confronto con altre cellule arrestate dalla crescita. Per pSILAC, le cellule arrestate dal ciclo cellulare sono generalmente preferibili perché non si replicano e sono quindi più facili da usare per i calcoli dell'emivita proteica47. Tuttavia, poiché le cellule coltivate spesso conservano alcune cellule in divisione, è importante che i metodi utilizzati per indurre l'arresto del ciclo cellulare producano una risposta il più omogenea possibile per ridurre al minimo l'errore delle cellule che stanno ancora proliferando. Per calcolare i tassi di degradazione delle proteine per le cellule cicliche utilizzando pSILAC sono necessari calcoli aggiuntivi per compensare la velocità con cui la proteina viene diluita nelle cellule figlie27. Tuttavia, l'arresto della crescita quiescente in sé non è privo di complicazioni. Esistono due metodi generali per l'arresto del ciclo cellulare: la privazione del siero e l'inibizione del contatto48. Non tutte le cellule possono essere rese quiescenti attraverso l'inibizione del contatto, anche se alcuni fibroblasti hanno dimostrato di dimostrare la quiescenza dopo diversi giorni di coltura49. Questo metodo ha usato la privazione del siero perché è più comunemente usato per i confronti di cellule senescenti, anche se richiede che la cellula senescente sia similmente priva di siero per confronti accurati. Il siero attiva il complesso mTOR, e quindi la privazione del siero ha diversi effetti a valle sulla cellula oltre all'arresto del ciclo cellulare50. In particolare, le cellule senescenti hanno dimostrato di mostrare un SASP ridotto in caso di privazione sierica o inibizione di mTOR51,52.
Un altro punto importante da considerare in pSILAC è il numero di punti temporali da testare. Questo protocollo ha raccolto le cellule in un unico punto temporale (3 giorni di etichettatura leggera o pesante), il che semplifica sostanzialmente l'analisi risultante. La scelta del punto temporale dovrebbe essere basata sull'obiettivo dell'esperimento. Per l'analisi globale, ci si aspetta che 3 giorni catturino la maggior parte delle proteine, anche se le emivite per le proteine di breve durata che si trasformano completamente entro 3 giorni (tutto il segnale luminoso viene perso) non possono essere misurate in questo momento. Al contrario, le proteine longeve con pochissimo turnover in 3 giorni sono anche difficili da quantificare e spesso appaiono come aventi emivite estremamente grandi (nell'ordine delle settimane) che in genere sono solo una conseguenza di un accumulo di segnale molto poco pesante. A causa della relazione non lineare nel rapporto tra segnali peptidici pesanti e leggeri rispetto alla percentuale di proteine appena sintetizzate in punti temporali più brevi e più lunghi, la quantificazione delle emivite potrebbe essere migliorata aggiungendo ulteriori punti temporali di etichettatura. Per i confronti relativi tra due stati cellulari, come in questo protocollo, può essere sufficiente un'emivita approssimativa, ma è possibile utilizzare punti temporali aggiuntivi per migliorare l'accuratezza quantitativa.
Questo protocollo descrive come eseguire un'analisi non mirata basata su DDA del turnover proteico. Tuttavia, i calcoli del turnover proteico possono essere applicati generalmente a qualsiasi schema di acquisizione in grado di derivare l'abbondanza relativa di coppie di peptidi pesanti e leggeri. Ad esempio, metodi basati su MS2 come l'acquisizione indipendente dai dati (DIA/SWATH) possono essere applicati anche per il calcolo dei tassi di turnover con successo53. Inoltre, la strumentazione e le pipeline software diverse da quelle descritte in questo protocollo possono essere utilizzate per eseguire analisi DDA, identificazione delle proteine e quantificazione delle proteine. Quando si utilizzano piattaforme software di quantificazione delle proteine come Skyline per estrarre le aree di picco peptidico, è consigliabile ispezionare manualmente i cromatogrammi ionici estratti nell'area di lavoro dei documenti, identificare i picchi che sono stati erroneamente integrati e picchi non quantitativi e curare il documento di conseguenza. Una vasta raccolta di tutorial è disponibile online per Skyline (skyline.ms).
pSILAC rappresenta uno dei metodi più ideali per la quantificazione globale delle emivite proteiche nelle cellule coltivate grazie al multiplexing superiore (copertura del proteoma) e alla produttività. Mentre pSILAC non fornisce tassi diretti di sintesi o degradazione, poiché il cambiamento del segnale leggero e pesante è dovuto a una confluenza di fattori, pSILAC è molto utile per i confronti tra condizioni e diversi tipi di cellule. I metodi a basso rendimento spesso rientrano in due tipi: 1) trattamento delle cellule con cicloeximide per bloccare la sintesi proteica e raccogliere a intervalli di tempo dopo l'aggiunta per monitorare il decadimento, o 2) trattamento delle cellule con un inibitore del decadimento proteico e raccolta a intervalli di tempo dopo l'aggiunta per monitorare l'accumulo di proteine, deducendo così i tassi di decadimento proteico. Il limite di entrambi i metodi è che tali trattamenti causeranno inevitabilmente cambiamenti sostanziali alla fisiologia cellulare. Al contrario, pSILAC non richiede alcun intervento sostanziale e teoricamente non ha effetti rilevabili sulla fisiologia cellulare poiché gli amminoacidi isotopici differiscono di un solo neutrone dalle loro controparti non isotopiche. Pertanto, il metodo qui descritto per pSILAC rappresenta un semplice protocollo per la misurazione globale delle emivite proteiche più fisiologiche in cellule non in divisione.
Le alterazioni nel turnover proteico hanno una stretta relazione con l'invecchiamento, le malattie legate all'età, la neurodegenerazione e la longevità54,55. Questo protocollo descrive un metodo per interrogare queste relazioni utilizzando l'etichettatura isotopica stabile degli amminoacidi in coltura cellulare per misurare i tassi di turnover proteico nelle cellule di senescenza. Tuttavia, esistono numerosi metodi analoghi per eseguire studi nel contesto dell'invecchiamento e della neurodegenerazione in vivo in organismi interi come i topi. In effetti, questi studi hanno sottolineato l'importanza di misurare i tassi di turnover proteico nel contesto delle malattie legate all'età 56,57,58,59.
In questo studio, le proteine ribosomiali e le proteine residenti nel reticolo endoplasmatico si sono distinte come due categorie di proteine con emivite ridotte e aumentate nelle cellule senescenti, rispettivamente. Mentre sono necessarie ulteriori analisi dei livelli di stato stazionario per conclusioni definitive, questi risultati suggeriscono ulteriormente che le cellule senescenti possono regolare in modo univoco la traduzione attraverso una diminuzione dell'emivita delle proteine ribosomiali. In futuro, l'applicazione di approcci stabili di marcatura isotopica per studiare la relazione tra senescenza cellulare e neurodegenerazione in vivo in modelli murini sarà un'estensione promettente dell'approccio di etichettatura degli isotopi descritto da questo protocollo.

La senescenza è stata identificata per la prima volta come uno stato di arresto della crescita indefinito esibito da cellule primarie in coltura dopo aver raggiunto l'esaurimento replicativo1. Da allora è stato dimostrato che la senescenza può insorgere in risposta a numerosi insulti cellulari, tra cui stress genotossici, mitocondriali e oncogeni, tra gli altri2. Mentre la senescenza ha diversi ruoli fisiologicamente importanti, come la soppressione del tumore e la guarigione delle ferite, l'accumulo di cellule senescenti durante l'invecchiamento è associato a una serie di effetti deleteri sulla salute3, tra cui diverse condizioni neurodegenerative 4,5,6. La senescenza cellulare si verifica in più tipi di cellule cerebrali, tra cui i neuroni 7,8,9,10, gli astrociti11, la microglia12 e i precursori degli oligodendrociti13, e contribuisce alla neurodegenerazione e alla disfunzione cognitiva. Gli oligomeri beta amiloidi, uno dei segni distintivi della malattia di Alzheimer14, hanno dimostrato di accelerare la senescenza neuronale 13,15,16. Un aumento della prevalenza di cellule senescenti è stato anche associato al morbo di Parkinson17, in particolare derivante da fattori di stress ambientali11,18. È importante sottolineare che l'eliminazione selettiva delle cellule senescenti nei modelli pre-clinici prolunga la durata della vita e mitiga una moltitudine di malattie legate all'età 3,5,12 e migliora i deficit cognitivi 8,11,12,13. Le cellule senescenti sono così emerse come promettenti bersagli terapeutici per il trattamento di molte condizioni legate all'età.
Gran parte dell'effetto dannoso delle cellule senescenti è causato dal fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP), una complessa miscela di molecole bioattive secrete da cellule senescenti che possono causare infiammazione locale, angiogenesi, distruzione della matrice extracellulare e propagazione della senescenza nel tessuto circostante 19,20,21 . Il SASP rappresenta anche un interessante fenomeno biologico di senescenza perché richiede un notevole sforzo trascrizionale e traslazionale durante uno stato di arresto del ciclo cellulare. Infatti, le cellule senescenti hanno dimostrato di mostrare diminuzioni nella biogenesi dei ribosomi 22,23,24 che dovrebbero ridurre la sintesi proteica. Invece, le cellule senescenti traducono robustamente alcune proteine, in particolare i fattori SASP, e influenzano il metabolismo del tessuto circostante25. Pertanto, vi è un notevole interesse nel comprendere come le cellule senescenti sottoposte a un arresto permanente del ciclo cellulare continuino a mantenere l'omeostasi proteica mentre allo stesso tempo esprimono in modo robusto fattori SASP e altre proteine selezionate.
Questo metodo descrive come utilizzare la spettrometria di massa e l'etichettatura isotopica pulsata stabile da parte degli amminoacidi in coltura cellulare (pSILAC) per misurare globalmente l'emivita delle proteine nelle cellule senescenti su scala proteomica. Nel SILAC tradizionale, le cellule coltivate sono completamente metabolicamente etichettate con isotopi non radioattivi pesanti e leggeri di amminoacidi per l'analisi a valle dell'abbondanza proteica. Questo metodo è stato precedentemente applicato per valutare i cambiamenti di abbondanza in modo completo e quantitativo nel SASP dei fibroblastiin coltura 26. In pSILAC, le cellule sono similmente metabolicamente etichettate con un impulso di isotopo pesante che segue la pre-etichettatura con isotopo leggero e quindi raccolte a uno o più intervalli di tempo. I tassi di incorporazione di isotopi pesanti in riferimento a isotopi leggeri preesistenti vengono quindi utilizzati per calcolare i tassi di turnover proteico relativo. Generalmente, gli isotopi di arginina e lisina sono usati perché la tripsina si scinde a quei residui; pertanto, tutti i peptidi della digestione standard conterranno potenzialmente l'etichetta pesante. Coppie di peptidi che differiscono solo per la presenza o l'assenza di lisina pesante o arginina sono chimicamente identiche e possono essere differenziate e quantificate da uno spettrometro di massa. A seguito dell'analisi della spettrometria di massa, i peptidi possono essere identificati come di nuova sintesi o preesistenti in base alla presenza o all'assenza dell'etichetta isotopica nelle identificazioni peptidiche risultanti. I tassi di turnover proteico possono quindi essere determinati adattando il rapporto tra peptidi pesanti (13 C-15N) su leggeri (12 C-14N) per una data proteina e modelli cinetici per la crescita esponenziale o il decadimento 27,28. pSILAC è stato utilizzato in diversi confronti di tassi di turnover proteico 29,30,31,32 ed è attualmente il metodo più completo e ad alto rendimento per la misurazione delle emivite proteiche.
Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione delle cellule senescenti in parallelo con cellule quiescenti arrestate dalla crescita in coltura, seguite dall'etichettatura metabolica con pSILAC. Le cellule vengono quindi raccolte, omogeneizzate in lisati ed elaborate per l'acquisizione e l'analisi della spettrometria di massa. I dati ottenuti dalla spettrometria di massa vengono quindi utilizzati per determinare le emivite proteiche utilizzando un metodo quantitativo semplificato che impiega un singolo punto temporale e calcoli di emivita eseguiti in un foglio di calcolo. Utilizzando questo approccio, le stime delle emivite proteiche possono essere misurate in modo completo e quantitativo che è più autentico per le condizioni cellulari imperturbabili rispetto ai protocolli che utilizzano bloccanti della sintesi proteica o del turnover.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammacel 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td></td>
			<td>Cesium Irradiator for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-90 primary lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iRT Kit (indexed retention time)</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td>Indexed Retention Time Peptide Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>423835000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Mascot Daemon 2.8</td>
			<td>Proteomic database searching software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q Exactive HF Orbitrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>327110025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline</td>
			<td>University of Washington</td>
			<td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td>
			<td>Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator waterbath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-516R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Referred to as phenol in text; hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPle Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (sequencing grade)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry

Prove crescenti hanno dimostrato che l'accumulo di cellule senescenti nel sistema nervoso centrale contribuisce a disturbi neurodegenerativi come l'Alzheimer e il Parkinson. La senescenza cellulare è uno stato di arresto permanente del ciclo cellulare che si verifica in genere in risposta all'esposizione a stress sub-letali. Tuttavia, come altre cellule non in divisione, le cellule senescenti rimangono metabolicamente attive e svolgono molte funzioni che richiedono richieste trascrizionali e traslazionali uniche e cambiamenti diffusi nei proteomi intracellulari e secreti. Capire come la sintesi proteica e i tassi di decadimento cambiano durante la senescenza può illuminare i meccanismi alla base della senescenza cellulare e trovare potenziali vie terapeutiche per le malattie esacerbate dalle cellule senescenti. Questo articolo descrive un metodo per la valutazione su scala proteome delle emivite proteiche in cellule non in divisione utilizzando l'etichettatura di isotopi stabili pulsati da parte di amminoacidi in coltura cellulare (pSILAC) in combinazione con la spettrometria di massa. pSILAC comporta l'etichettatura metabolica di cellule con versioni stabili contenenti isotopi pesanti di amminoacidi. Accoppiato con i moderni approcci di spettrometria di massa, pSILAC consente la misurazione del turnover proteico di centinaia o migliaia di proteine in miscele complesse. Dopo l'etichettatura metabolica, la dinamica di turnover delle proteine può essere determinata in base all'arricchimento relativo di isotopi pesanti in peptidi rilevati mediante spettrometria di massa. In questo protocollo, viene descritto un flusso di lavoro per la generazione di colture di fibroblasti senescenti e fibroblasti quiescenti arrestati in modo simile, nonché un percorso temporale semplificato e a punto singolo pSILAC che massimizza la copertura dei tassi di turnover proteico previsti. Inoltre, viene presentata una pipeline per l'analisi dei dati della spettrometria di massa pSILAC e il calcolo user-friendly dei tassi di degradazione delle proteine utilizzando fogli di calcolo. L'applicazione di questo protocollo può essere estesa oltre le cellule senescenti a qualsiasi cellula in coltura non in divisione come i neuroni.

Questo protocollo descrive un metodo per confrontare globalmente le emivite proteiche tra cellule di controllo quiescenti senescenti e non in divisione utilizzando pSILAC e punti temporali minimi. Questo protocollo descrive la generazione di cellule senescenti e quiescenti in coltura, l'etichettatura metabolica di cellule con isotopi stabili di arginina e lisina nell'arco di 3 giorni, quantificando l'abbondanza relativa di isotopi peptidici pesanti e leggeri mediante spettrometria di massa e un calcolo semplice e accessibile delle emivite proteiche utilizzando formule di foglio di calcolo (Figura 1). Questo metodo è altamente flessibile e può essere adattato a numerosi tipi di cellule e condizioni.
Come parte della generazione di cellule senescenti per questo protocollo, vengono utilizzati due metodi di convalida della senescenza: cellule SA-βGal-positive visualizzate al microscopio e livelli aumentati di marcatori senescenti quantificati utilizzando l'analisi RT-qPCR. La misurazione dei marcatori senescenti dovrebbe fornire chiare distinzioni tra cellule quiescenti e senescenti affinché i confronti delle due popolazioni cellulari siano considerati validi. Per l'attività di SA-βGal, le cellule senescenti dovrebbero apparire blu mentre le cellule di controllo quiescenti non hanno colore o hanno pochissimo colore (Figura 2A). Questo test può essere quantificato contando le cellule positive, colorate di blu come percentuale del numero totale di cellule, e quindi confrontando il tasso di positività percentuale tra il controllo quiescente e le cellule senescenti. È importante che questo protocollo venga eseguito contemporaneamente per il confronto di entrambi gli stati cellulari; L'attività di SA-βGal si basa sul pH della soluzione colorante, quindi i risultati possono variare sostanzialmente tra i saggi e devono essere considerati una misura qualitativa.
L'analisi RT-qPCR dei marcatori senescenti mostrerà alti livelli degli mRNA che codificano i fattori SASP (IL6, CXCL8, IL1B) e gli inibitori del ciclo cellulare (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) nella maggior parte dei modelli senescenti. Sebbene si preveda una certa variazione in base al tipo di cellula, alla condizione di coltura e all'induttore senescente 41,42, la maggior parte delle cellule senescenti mostra livelli superiori di cinque volte superiori di mRNA IL6, CXCL8 e CDKN1A / p21 rispetto alle cellule di controllo quiescenti; al contrario, i livelli di MRNA LMNB1 e PCNA, che codificano i marcatori di proliferazione, dovrebbero essere bassi o assenti nelle cellule senescenti rispetto alle cellule quiescenti (Figura 2B). Nel loro insieme, una percentuale significativa di positività a SA-βGal e l'espressione attesa di un pannello di marcatori di mRNA associati alla senescenza sono sufficienti per confermare l'induzione della senescenza in un esperimento.
L'elaborazione di campioni proteici per l'analisi della spettrometria di massa consiste nella digestione in soluzione (2 giorni) e nell'estrazione in fase solida (4-6 ore). Per eseguire analisi proteomiche non mirate, i peptidi risultanti vengono sottoposti all'analisi LC-MS/MS utilizzando l'acquisizione dipendente dai dati (DDA). Sugli strumenti Orbitrap, un metodo DDA può essere specificato nell'editor del metodo software dello strumento di spettrometria di massa. Le impostazioni dello spettrometro di massa utilizzate in questo studio sono mostrate nella Figura 3A. Le impostazioni della cromatografia liquida possono anche essere specificate all'interno dell'editor di metodi. Per questo studio è stato utilizzato un gradiente lineare di 90 minuti con fase organica crescente (acetonitrile) (Figura 3B). A seguito di un'acquisizione riuscita, la corrente ionica totale (TIC) dovrebbe contenere un segnale intenso durante la porzione di gradiente lineare del metodo (Figura 3C). Questo protocollo descrive un protocollo di esempio su uno strumento Orbitrap, ma il calcolo delle emivite proteiche può essere eseguito sui dati ottenuti da qualsiasi spettrometro di massa raccolto in modalità DDA, che è disponibile su diversi tipi di strumenti (ad esempio, Orbitraps e strumenti a tempo di volo) e fornitori. Le impostazioni di acquisizione saranno uniche per il tipo e la configurazione dello strumento utilizzato e si consiglia di utilizzare le impostazioni suggerite dalla struttura di spettrometria di massa. Questo metodo è anche compatibile con i metodi non DDA (SRM, PRM, DIA), purché le aree di picco cromatografiche quantitative per picchi pesanti e leggeri possano essere estratte dai file di dati grezzi e inserite nelle formule del foglio di calcolo.
I file di spettrometria di massa grezzi vengono cercati con uno dei tanti strumenti di ricerca di database proteomici disponibili per identificare peptidi e proteine. Ad esempio, questo studio ha utilizzato il motore di ricerca Mascot43. Per ottenere aree di picco cromatografiche per la quantificazione di peptidi pesanti e leggeri, i risultati della ricerca nel database vengono importati in un software proteomico in grado di aree di picco cromatografiche come Skyline39,40. L'esame dei cromatogrammi ionici estratti dei peptidi (Figura 4) rivelerà la proporzione relativa di segnali peptidici pesanti e leggeri. Una percentuale inferiore di segnale peptidico pesante rispetto al segnale peptidico leggero nelle cellule senescenti indica un tasso di turnover proteico più lento (Figura 4A) e un segnale peptidico pesante più elevato rispetto alla luce indica un tasso di turnover proteico più veloce (Figura 4B). I campioni non etichettati dovrebbero mostrare poco o nessun segnale peptidico pesante. Qualsiasi segnale peptidico pesante apparente nei campioni non etichettati è considerato rumore di fondo e verrà sottratto durante i calcoli finali. La quantificazione delle aree di picco cromatografiche per peptidi leggeri e pesanti per tutte le condizioni di trattamento ed etichettatura deve essere esportata per il successivo calcolo dei tassi di turnover proteico e l'analisi statistica.
Utilizzando l'analisi a singolo punto temporale, la quantificazione delle emivite proteiche è semplice da eseguire e può essere eseguita comodamente in fogli di calcolo. Nella Tabella 3 sono state calcolate le emivite per 695 proteine identificate dall'analisi di spettrometria di massa. Partendo dall'abbondanza di isotopi pesanti e leggeri a livello proteico per ogni proteina nei campioni (input per la scheda tecnica grezza 1 ), un isotopo pesante percentuale (chiamato Ratio, R) viene quindi calcolato automaticamente sul foglio intitolato 2) Rapporto H | H + L. In questa fase, la R da campioni etichettati pesanti viene normalizzata sottraendo la R da campioni non etichettati per produrre una R finale per i triplicati quiescenti e senescenti. Poiché i campioni non etichettati non dovrebbero avere alcun isotopo pesante aggiunto esogenamente, vengono utilizzati per eliminare il segnale di fondo. Da R, il kdeg (tasso di turnover) viene calcolato utilizzando la seguente formula:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
L'emivita (H, in giorni) è determinata per ogni proteina nel controllo quiescente e nei triplicati senescenti (foglio intitolato 3) Emivita (giorni)) utilizzando la seguente formula:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
Queste emivite vengono quindi mediate tra i triplicati quiescenti e senescenti per generare un'emivita media quiescente e senescente per ciascuna proteina e un valore p. Le emivite calcolate vengono quindi filtrate per valori negativi, che si verificano quando il segnale pesante proveniente da celle etichettate con luce (lo sfondo) è maggiore del segnale pesante proveniente da celle etichettate pesantemente. Questo filtraggio ha portato a 707 proteine da 841 identificate con emivite valide per i risultati qui presentati.
L'emivita viene quindi riportata come un rapporto log2 di celle di controllo senescenti su quiescenti (log2FC) e tracciata in un grafico vulcanico (Figura 5). Ad esempio, osservando il foglio di analisi 5), la proteina del recettore della trombina II della coagulazione (F2R) può essere vista avere un'emivita nelle cellule quiescenti di 0,51 giorni (colonna B) e un'emivita nelle cellule senescenti di 1,07 giorni (colonna C) che ha prodotto un log2FC di ~ 1,06 (colonna D) con un valore p di 0,001.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro pSILAC per celle di controllo senescenti e quiescenti. I fibroblasti IMR-90 umani sono stati utilizzati per preparare colture cellulari quiescenti (a basso siero) o senescenti (IR) per il confronto delle emivite proteiche. Le cellule sono state quindi etichettate con SILAC Light o SILAC Heavy media con arginina isotopica e lisina per 3 giorni. I lisati sono stati estratti dalle cellule, digeriti, dissalati e analizzati utilizzando la spettrometria di massa. I picchi isotopici peptidici pesanti e leggeri corrispondono rispettivamente ai peptidi appena sintetizzati e preesistenti. Le emivite sono state calcolate usando un'equazione per il decadimento esponenziale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> Figura 2: Validazione dei fenotipi senescenti mediante analisi SA-βGal e RT-qPCR. (A) Le cellule senescenti e quiescenti vengono ripiazionate al momento della raccolta in una piastra a 6 pozzetti e colorate per SA-βGal utilizzando il kit di colorazione SA-βGal. Il colore blu nel corpo cellulare è positivo per la senescenza. Le immagini sono scattate in campo luminoso con colore a ingrandimento 10x, marcatore di dimensioni in rosso. (B) Analisi RT-qPCR che confronta cellule senescenti (rosse) e cellule cicliche (grigie) da un esperimento non correlato. Gli aumenti dei livelli di mRNA CDKN1A/p21, CXCL8 e IL6 sono indicativi della senescenza, così come la diminuzione dei livelli di mRNA LMNB1 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> Figura 3: Metodi rappresentativi per scansioni di acquisizione dipendente dai dati (DDA) e gradiente di cromatografia liquida di colture pSILAC sullo spettrometro di massa orbitrap Q-Exactive HF. (A) Impostazioni dello strumento consigliate nel software dello strumento per l'analisi dipendente dai dati di lisati di cellule intere da un esperimento pSILAC. (B) Esempio di impostazioni del gradiente di flusso della cromatografia liquida. I peptidi vengono eluiti su un gradiente lineare di 90 minuti che va dal 5% al 35% di tampone B (0,2% di acido formico e 99,8% di acetonitrile), seguito da un lavaggio di 10 minuti con tampone B all'80% e 25 minuti di equilibrio con tampone B al 5% (C) Un cromatogramma ionico totale rappresentativo (TIC) di un'acquisizione spettrometrica di massa di peptidi di fibroblasti IMR-90 acquisiti con le impostazioni specificate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> Figura 4: Cromatogrammi ionici estratti rappresentativi di peptidi con turnover alterato durante la senescenza. (A) Aree di picco cromatografiche del peptide FQMTQEVVCDECPNVK++ dalla proteina DnaJ omologo sottofamiglia B membro 11 (DNAJB11) in cellule senescenti e non senescenti. Dopo 3 giorni di SILAC, le cellule senescenti incorporano isotopi meno pesanti in questo peptide rispetto alle cellule quiescenti (non senescenti), come indicato da una riduzione dell'area di picco del peptide contenente isotopi pesanti (blu) rispetto al peptide leggero (rosso), indicando che questo peptide ha ridotto il turnover nelle cellule senescenti. (B) Aree di picco cromatografiche del peptide VQAQVIQETIVPK++ dalla proteina Splicing Factor 3a Subunità 1 (SF3A1) in cellule senescenti e non senescenti. Dopo 3 giorni di SILAC, le cellule senescenti incorporano una percentuale maggiore di isotopo pesante in questo peptide rispetto alle cellule quiescenti (non senescenti), come indicato da una riduzione dell'area di picco del peptide contenente isotopi pesanti (blu) rispetto al peptide leggero (rosso), indicando che questo peptide ha aumentato il turnover nelle cellule senescenti. Le condizioni non etichettate (Giorno 0) non mostrano alcuna incorporazione di isotopi pesanti per entrambi i peptidi, come previsto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> Figura 5: Confronto delle emivite proteiche in cellule senescenti e quiescenti determinate dall'etichettatura pSILAC. (A) Grafico del vulcano che mostra il rapporto log2 di senescente / controllo (quiescente) per ciascuna delle 695 proteine identificate; in questo esperimento, i mezzi di etichettatura Light and Heavy non contenevano glucosio e rosso fenolo. (B) Tabelle che mostrano le prime 10 proteine con l'emivita più aumentata o diminuita nelle cellule quiescenti rispetto alle cellule senescenti (sinistra e destra, rispettivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Supporti e buffer utilizzati in questo protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Primer RT-qPCR utilizzati in questo protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: Cartella di lavoro dell'analisi SILAC per il calcolo delle emivite proteiche, dei cambiamenti di piega e dei t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

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Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per l'etichettatura metabolica di cellule senescenti e non in divisione con SILAC pulsato, analisi di spettrometria di massa non mirata e un calcolo semplificato delle emivite proteiche.

Misurazione dei tassi di turnover proteico in cellule coltivate senescenti e non in divisione con etichettatura metabolica e spettrometria di massa

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Il modo in cui le cellule mantengono l'omeostasi proteica non è ben compreso nel contesto dello stress cellulare e della senescenza. In questo protocollo, forniamo un modo semplice e preciso per calcolare il turnover proteico, che è un componente chiave dell'omeostasi proteica nelle cellule viventi. Pulse SILAC offre a uno sperimentatore la possibilità di misurare il turnover proteico per le singole proteine e l'intero proteoma in un modo ad alto rendimento che è anche più autentico per i sistemi biologici rispetto ad altri metodi.I principi di questo metodo possono essere applicati a qualsiasi sistema che può essere metabolicamente etichettato, compresi interi organismi. Questo metodo può anche portare a intuizioni sulla senescenza cellulare, l'invecchiamento e le malattie neurodegenerative. L'analisi della spettrometria di massa è altamente sensibile a determinati contaminanti chimici, come i detergenti.Utilizzare reagenti di grado LC-MS durante questa procedura per garantire una raccolta dati di alta qualità. Per iniziare l'etichettatura metabolica delle cellule, sostituire il mezzo per tre piastre ciascuna di cellule senescenti e quiescenti con 30 millilitri di mezzi SILAC Light. Separatamente, sostituire il mezzo per tre piastre senescenti e tre quiescenti con 30 millilitri di SILAC Heavy.Far crescere le cellule per tre giorni senza cambiare il mezzo. Per staccare le cellule dalle piastre di coltura, aggiungere cinque millilitri di reagente di tripsina preriscaldato a ciascuna piastra e incubare le piastre per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, risospese le cellule staccate in cinque millilitri dello stesso mezzo utilizzato per la coltura per un volume totale di 10 millilitri.Quindi, trasferire le cellule sul ghiaccio e centrifugare le cellule a 300 volte G a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato il pellet due volte, ruotare nuovamente le cellule e rimuovere il surnatante prima di risospendere il pellet in 150 microlitri di urea a otto molari appena preparata e tampone di lisi di bicarbonato di ammonio 50 millimolare. Mescolare il contenuto del tubo pipettando su e giù.Aliquota 50 microgrammi del campione proteico in una nuova provetta e porta i campioni fino a volumi uguali con tampone di lisi. Quindi aggiungere il ditiotreitolo a una concentrazione finale di 20 millimolari al tubo e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti con agitazione. Lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti prima di aggiungere iodoacetammide a una concentrazione finale di 40 millimolare e incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.Quindi diluire il campione al di sotto dell'urea monomolare con un tampone di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari. Aggiungere un microgrammo di tripsina per 50 microgrammi di proteina iniziale o a 1:50 tripsina al rapporto proteina al campione. Incubare il campione durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione per digerire le proteine in peptidi.Il giorno successivo, aggiungere acido formico all'1% in volume del campione per estinguere la digestione delle proteine. Per la pulizia del campione, posizionare una cartuccia di estrazione in fase solida su un collettore a vuoto, utilizzando una cartuccia di estrazione per ciascun campione, secondo le linee guida del produttore. Dopo l'estrazione, rimuovere i campioni peptidici dal collettore a vuoto e asciugarli completamente in un concentratore di vuoto.L'essiccazione richiede circa tre ore. Per la spettrometria di massa, o analisi MS, risospesare il campione peptidico ad una concentrazione di 400 nanogrammi per microlitro in un tampone di acido formico allo 0,2%. Per risolubilizzare i peptidi, mescolare il campione per cinque minuti.Quindi, sonicare per cinque minuti in un sonicatore a bagnomaria. Quindi, centrifugare il campione per pellettare i materiali insolubili e trasferire i supernatanti peptidici in flaconcini di SM. Presentare i campioni per l'analisi proteomica utilizzando la spettrometria di massa tandem a cromatografia liquida o LC-MS-MS.Utilizzare le impostazioni consigliate per l'analisi non mirata da parte della struttura di spettrometria di massa. Caricare i campioni su una colonna analitica con una portata di 400 nanolitri al minuto per eluire i peptidi su un gradiente lineare di 90 minuti utilizzando una miscela di solventi organici e inorganici, con il solvente organico che va dal 5 al 35% Acquisire dati di spettrometria di massa in modalità dipendente dai dati, con un ciclo continuo di scansioni di indagine MS1 seguite da 20 scansioni MS2 dipendenti dai dati con frammentazione HCD. Quantificare le aree di picco peptidico per peptidi pesanti e leggeri nello strumento software Proteome Quantitation.Quindi, esporta le aree di picco peptidico pesanti e leggere. Per il calcolo delle emivite proteiche, aprire la cartella di lavoro di analisi SILAC al primo foglio denominato Raw Data e incollare negli ID UniProt, nomi di geni, aree di picco pesanti e leggere nelle colonne indicate. Quindi, aprire il quarto foglio denominato Analisi e rimuovere le righe in cui le colonne G e H indicano che l'esempio è fuori dall'intervallo e mantenere le righe che vengono lette all'interno dell'intervallo.I fenotipi senescenti sono stati convalidati utilizzando l'attività beta-galattosidasi associata alla senescenza e l'analisi RT-qPCR. Per l'attività della beta-galattosidasi, le cellule senescenti apparivano blu, mentre le cellule di controllo quiescenti avevano un colore nullo o minimo. Nell'analisi RT-qPCR, le cellule senescenti hanno mostrato mRNA interleuchina-6, CXCL8 e CDKN1A-P21 più elevati rispetto alle cellule quiescenti.Al contrario, il livello di lamina B1 che codifica per il marcatore di proliferazione era basso o assente nelle cellule senescenti. I cromatogrammi ionici estratti dei peptidi hanno rivelato la proporzione relativa di segnali peptidici pesanti e leggeri. Una percentuale inferiore di segnali peptidici pesanti rispetto alle cellule senescenti leggere indicava un tasso di turnover proteico più lento e un segnale peptidico pesante più elevato rispetto alla luce indicava un tasso di turnover proteico più veloce.I campioni non etichettati hanno mostrato poco o nessun segnale peptidico pesante. Sono state calcolate le emivite per 695 proteine identificate dall'analisi di spettrometria di massa. L'emivita è riportata come un rapporto log-due di cellule senescenti su quiescenti e tracciata in un grafico vulcanico.Seguendo il calcolo dei tassi di turnover proteico nelle cellule senescenti, l'analisi a valle può rivelare percorsi biologici candidati che sono regolati da meccanismi di proteostasi. Pulse SILAC ha spianato la strada ai ricercatori per studiare la dinamica delle proteine con granularità e produttività senza precedenti, consentendoci di studiare i cambiamenti nell'omeostasi proteica in molte singole proteine.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Guaina elettroforesi capillare-spettrometria di massa per metaboliche Profiling di campioni biologici

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Ricerca

Biochimica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Spettrometria di Massa e approcci Luminogenic a base di caratterizzare la fase I metabolica competenza di<em&gt; In Vitro</em&gt; colture cellulari

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Misurare e interpretare i tassi di consumo di ossigeno in tutto Vola testa segmenti

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...