Name: measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00
Duration: 8 min 52 s
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この研究は、国立衛生研究所(NIH)と国立老化研究所(NIA)の学内研究プログラム(IRP)の支援を受けました。NBは、長寿推進助成金、および栄養補助食品局(ODS)奨学生プログラムによって支援されました。 図 1 は、 BioRender.com を使用して作成されました。

著者らは開示していない。

pSILACは、複数の細胞状態にわたるタンパク質代謝回転率のグローバルな定量を可能にする強力な技術です。この論文では、老化細胞と静止期細胞の調製、SILAC標識と採取、そして最終的にはDDA質量分析法を用いた分析のための指示を含む、老化細胞と静止期細胞の間のグローバルなタンパク質半減期を比較するためのpSILACの使用について詳述する。さらに、老化関連タンパク質をコードするmRNAのパネルのSA-βGalおよびRT-qPCR分析を用いた老化表現型の検証のための2段階試験が記載されている。記載された2つのアプローチによる老化の検証に加えて、老化の第3の検証は、プロテオミクスレベルで老化細胞と静止期細胞との間の既知の老化マーカーの変化を探すことによって、質量分析分析に続いて行うことができる。上昇すると予想される老化関連タンパク質には、p16、p21、およびBCL2が含まれ、とりわけ、他の場所に記載されている44、45。上述のプロトコルにおいて、静止期細胞に対する老化および血清飢餓の誘導に電離放射線が用いられた。老化の誘導のために、利用可能な複数の選択肢があり、それらの間に実質的な不均一性がある41,42,46。現在、「最も生理学的」と考えられる老化法は存在しないため、老化誘導物質の選択は主に実験の文脈に基づいている。しかし、老化に関する一般的な現象を述べることを目的とする実験では、少なくとも2つの異なる老化誘導物質を使用することが推奨される。老化パラダイムの範囲を議論することはこの論文の範囲を超えていますが、老化を誘発するいくつかの一般的な方法には、DNA損傷(IR、ドキソルビシン、複製的枯渇)の誘発、発癌性タンパク質(HRAS、BRAF)の発現、およびミトコンドリア機能の破壊が含まれます2。
老化誘導物質の選択に加えて、対照細胞の選択も同様に重要な考慮事項である。老化細胞は、定義上、無期限の増殖停止下にあるので、他の増殖停止細胞との比較がしばしば選択される。pSILACの場合、細胞周期停止細胞は複製せず、したがってタンパク質半減期計算に使いやすいため、一般に好ましい47。しかし、培養細胞はしばしば分裂細胞を保持するため、細胞周期停止を誘導するために使用される方法は、依然として増殖している細胞からの誤差を最小限に抑えるために、できるだけ均質な応答を生成することが重要である。pSILACを用いて細胞を循環させるためのタンパク質分解速度を計算するには、タンパク質が娘細胞27に希釈される速度を補償するための追加の計算が必要である。しかし、静止成長の停止自体が合併症がないわけではありません。細胞周期停止には、血清欠乏および接触阻害の2つの一般的な方法がある48。接触阻害によってすべての細胞を静止させることができるわけではないが、いくつかの線維芽細胞は培養の数日後に静止を示すことが示されている49。この方法は、老化細胞の比較に一般的に使用されるため、血清欠乏を使用したが、正確な比較のために老化細胞を同様に血清欠乏にする必要がある。血清はmTOR複合体を活性化し、したがって血清剥奪は細胞周期停止50に加えて細胞にいくつかの下流効果を有する。注目すべきことに、老化細胞は、血清欠乏またはmTOR阻害時に減少したSASPを示すことが示されている51、52。
pSILAC で考慮すべきもう 1 つの重要なポイントは、テストするタイム ポイントの数です。このプロトコルは、単一の時点(3日間の軽または重い標識)で細胞を収集し、結果として得られる分析を大幅に簡素化します。タイムポイントの選択は、実験の目的に基づいて行う必要があります。グローバル解析では、3日間でタンパク質の大部分を捕捉すると予想されますが、3日以内に完全にターンオーバーする(すべての光シグナルが失われる)短命タンパク質の半減期は、現時点では測定できません。逆に、3日間で代謝回転がほとんどない長寿命のタンパク質も定量化が難しく、多くの場合、非常に大きな半減期(数週間程度)を有するように見えますが、これは通常、重信号の蓄積がほとんどない結果にすぎません。より短い時点およびより長い時点での新規合成タンパク質の割合に対する重ペプチドシグナルおよび軽ペプチドシグナルの比率の非線形関係により、半減期の定量は、追加の標識時間点を追加することによって改善され得る。このプロトコルのように、2つの細胞状態間の相対比較では、おおよその半減期で十分かもしれませんが、追加のタイムポイントを使用して定量的精度を向上させることができます。
このプロトコルは、タンパク質代謝回転の非標的DDAベースの分析を実行する方法を説明しています。しかしながら、タンパク質代謝回転計算は、一般に、重ペプチド対および軽ペプチド対の相対的存在量を導出することができる任意の取得スキームに適用することができる。例えば、データ非依存集録(DIA/SWATH)などのMS2ベースの方法も、ターンオーバー率の計算にうまく適用することができる53。さらに、このプロトコルに記載されているもの以外のインストルメンテーションおよびソフトウェアパイプラインを使用して、DDA分析、タンパク質同定、およびタンパク質定量を実行できます。Skylineなどのタンパク質定量ソフトウェアプラットフォームを使用してペプチドピーク領域を抽出する場合は、ドキュメントワークスペースで抽出されたイオンクロマトグラムを手動で検査し、誤って統合されたピークと非定量ピークを特定し、それに応じてドキュメントをキュレーションすることをお勧めします。チュートリアルの広範なコレクションは、スカイライン(skyline.ms)のためにオンラインで利用可能です。
pSILACは、優れた多重化(プロテオームカバレッジ)とスループットにより、培養細胞におけるタンパク質半減期のグローバル定量に最も理想的な方法の1つです。pSILACは合成または分解の直接的な速度を提供しないが、軽いシグナルと重いシグナルの変化は因子の合流によるものであるため、pSILACは条件と異なる細胞型との比較に非常に有用である。低スループット法は、しばしば2つのタイプに分類される:1)タンパク質合成をブロックし、崩壊を監視するために添加後の時間間隔で回収するシクロヘキシミドによる細胞の処理、または2)タンパク質崩壊の阻害剤による細胞の処理およびタンパク質の蓄積を監視するための添加後の時間間隔での採取、したがってタンパク質崩壊速度を推測する。両方の方法の限界は、そのような治療が必然的に細胞生理機能に実質的な変化を引き起こすことである。対照的に、pSILACは実質的な介入を必要とせず、同位体アミノ酸は非同位体アミノ酸と単一の中性子によってのみ異なるため、理論的には細胞生理機能に検出可能な影響を及ぼさない。したがって、pSILACについてここで記載される方法は、非分裂細胞における最も生理学的タンパク質半減期のグローバル測定のための単純なプロトコールを表す。
タンパク質代謝回転の変化は、加齢、加齢関連疾患、神経変性、および長寿と密接な関係がある54,55。このプロトコルは、細胞培養におけるアミノ酸の安定同位体標識を使用して老化細胞におけるタンパク質代謝回転率を測定することによって、これらの関係を調査する方法を記載している。しかしながら、マウスなどの生物全体においてインビボでの老化および神経変性の文脈で研究を行う多数の類似の方法が存在する。実際、これらの研究は、加齢性疾患の文脈におけるタンパク質代謝回転率を測定することの重要性を強調している56,57,58,59。
この研究では、リボソームタンパク質と小胞体に存在するタンパク質が、それぞれ老化細胞における半減期の減少と増加を伴う2つのカテゴリーのタンパク質として際立っていた。決定的な結論を得るには定常状態レベルのさらなる分析が必要であるが、これらの結果はさらに、老化細胞がリボソームタンパク質の半減期の減少を通じて翻訳を一意に調節する可能性があることを示唆している。今後、安定同位体標識アプローチを適用して、マウスモデル における細胞老化とインビボでの 神経変性の関係を研究することは、このプロトコルによって記述される同位体標識アプローチの有望な延長となるでしょう。

老化は、複製的枯渇1に達した後に培養初代細胞によって示される無期限の増殖停止の状態として最初に同定された。それ以来、老化は、遺伝毒性、ミトコンドリア、および発癌性ストレスを含む多数の細胞侮辱に応答して起こり得ることが示されている2。老化は腫瘍抑制および創傷治癒などのいくつかの生理学的に重要な役割を有するが、加齢中の老化細胞の蓄積は、いくつかの神経変性状態を含む健康3に対する多数の有害な影響と関連している4、5、6。細胞老化は、ニューロン7、8、9、10、アストロサイト11、ミクログリア12、および希突起膠細胞前駆体13を含む複数の脳細胞型において起こり、神経変性および認知機能障害に寄与する。アルツハイマー病の特徴の1つであるアミロイドベータオリゴマー14は、ニューロン老化を促進することが示されている13、15、16。老化細胞の有病率の増加はまた、パーキンソン病17、特に環境ストレッサー11、18から生じることと関連している。重要なことに、前臨床モデルにおける老化細胞の選択的排除は、寿命を延ばし、多数の加齢関連疾患3,5,12を緩和し、認知障害を改善する8,11,12,13。したがって、老化細胞は、多くの加齢関連状態の治療のための有望な治療標的として浮上してきた。
老化細胞の有害な影響の多くは、老化関連分泌表現型(SASP)、局所炎症、血管新生、細胞外マトリックスの破壊、および周辺組織における老化の伝播を引き起こす可能性のある老化細胞によって分泌される生理活性分子の複雑な混合物によって引き起こされる19,20,21.SASPはまた、細胞周期停止の状態の間にかなりの転写および翻訳努力を必要とするため、老化の興味深い生物学的現象を表す。実際、老化細胞は、タンパク質合成を減少させるべきリボソーム生合成22、23、24の減少を示すことが示されている。その代わりに、老化細胞はいくつかのタンパク質、特にSASP因子を強固に翻訳し、周囲の組織の代謝に影響を与える25。したがって、永久的な細胞周期停止を受けている老化細胞が、SASP因子および他の選択されたタンパク質を頑健に発現しながら、タンパク質の恒常性を維持し続ける方法を理解することにかなりの関心がある。
この方法では、質量分析法と細胞培養中のアミノ酸によるパルス安定同位体標識(pSILAC)を使用して、老化細胞中のタンパク質の半減期をプロテオーム全体規模でグローバルに測定する方法について説明します。従来のSILACでは、培養細胞は、タンパク質存在量の下流分析のために、アミノ酸の重および軽度の非放射性同位体で完全に代謝的に標識されています。この方法は、培養線維芽細胞のSASPにおける存在量変化を包括的かつ定量的に評価するために以前に適用されてきた26。pSILACにおいて、細胞は、同様に、軽同位体による事前標識に続く重同位体のパルスで代謝的に標識され、次いで、1つ以上の時間間隔で回収される。既存の軽同位体に関する重同位体の取り込み速度は、次に、相対タンパク質代謝回転率を計算するために使用される。一般に、アルギニンおよびリジンの同位体は、トリプシンがそれらの残基で切断するために使用される。したがって、標準的な消化からのすべてのペプチドは、潜在的に重い標識を含むであろう。重リジンまたはアルギニンの有無によってのみ異なるペプチドの対は化学的に同一であり、質量分析計によって区別および定量することができる。質量分析分析に続いて、得られたペプチド同定における同位体標識の有無に基づいて、ペプチドを新たに合成または既存のものとして同定することができる。次いで、タンパク質代謝回転率は、所与のタンパク質に対する重(13C−15N)対軽(12C−14N)ペプチドの比を指数関数的成長または崩壊のための速度論モデルに当てはめることによって決定することができる27,28。pSILACは、タンパク質代謝回転率29、30、31、32のいくつかの比較に使用されており、現在、タンパク質半減期の測定のための最も包括的でハイスループットな方法です。
このプロトコールは、培養中の同様に増殖停止静止細胞と並行して老化細胞の調製を詳述し、続いてpSILACによる代謝標識を行う。次いで、細胞を回収し、溶解物にホモジナイズし、質量分析の取得および分析のために処理する。質量分析から得られたデータは、スプレッドシートで実行される単一の時点および半減期の計算を使用する単純化された定量方法を使用して、タンパク質の半減期を決定するために使用されます。このアプローチを使用して、タンパク質半減期の推定値を包括的かつ定量的に測定することができ、タンパク質合成または代謝回転の遮断薬を使用するプロトコルよりも、摂動していない細胞状態に対してより真正である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammacel 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td></td>
			<td>Cesium Irradiator for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-90 primary lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iRT Kit (indexed retention time)</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td>Indexed Retention Time Peptide Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>423835000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Mascot Daemon 2.8</td>
			<td>Proteomic database searching software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q Exactive HF Orbitrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>327110025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline</td>
			<td>University of Washington</td>
			<td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td>
			<td>Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator waterbath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-516R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Referred to as phenol in text; hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPle Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (sequencing grade)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry

中枢神経系における老化細胞の蓄積がアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患に寄与することが示されている。細胞老化は、典型的には、致死的以下のストレスへの曝露に応答して起こる永久的な細胞周期停止の状態である。しかし、他の非分裂細胞と同様に、老化細胞は代謝的に活性なままであり、独自の転写および翻訳要求、ならびに細胞内および分泌されたプロテオームの広範な変化を必要とする多くの機能を果たす。老化の間にタンパク質合成と崩壊速度がどのように変化するかを理解することは、細胞老化の根底にあるメカニズムを明らかにし、老化細胞によって悪化する疾患の潜在的な治療手段を見つけることができます。本稿では、細胞培養中のアミノ酸によるパルス安定同位体標識(pSILAC)を質量分析と組み合わせて用いた、非分裂細胞におけるタンパク質半減期をプロテオームスケールで評価する方法について説明する。pSILACは、アミノ酸の安定な重同位体含有バージョンを有する細胞の代謝標識を含む。最新の質量分析アプローチと組み合わせることで、pSILACは複雑な混合物中の数百または数千のタンパク質のタンパク質代謝回転の測定を可能にします。代謝標識後、タンパク質のターンオーバーダイナミクスは、質量分析によって検出されたペプチド中の重同位体の相対的濃縮に基づいて決定することができる。このプロトコルでは、老化性線維芽細胞培養物および同様に停止した静止性線維芽細胞の生成に関するワークフロー、ならびに予想されるタンパク質代謝回転率のカバレッジを最大化する単純化された単一時点pSILAC標識時間経過が記述されている。さらに、pSILAC質量分析データの分析とスプレッドシートを使用したタンパク質分解速度のユーザーフレンドリーな計算のためのパイプラインが提示されます。このプロトコルの適用は、老化細胞を超えて、ニューロンなどの任意の非分裂培養細胞に拡張することができる。

このプロトコルは、pSILACおよび最小時点を使用して、老化および非分裂静止制御細胞間のタンパク質半減期をグローバルに比較する方法を記述している。このプロトコルは、培養中の老化細胞および静止期細胞の生成、3日間にわたるアルギニンおよびリジンの安定同位体を有する細胞の代謝標識、質量分析による重ペプチドおよび軽ペプチド同位体の相対存在量の定量、およびスプレッドシート式を使用したタンパク質半減期の簡単でアクセス可能な計算を詳述する(図1)。この方法は非常に柔軟であり、多数の細胞型および条件に適合させることができる。
このプロトコールの老化細胞の生成の一環として、老化検証の2つの方法が使用される:顕微鏡によって視覚化されたSA-βGal陽性細胞およびRT-qPCR分析を使用して定量された老化マーカーのレベルの増加。老化マーカーの測定は、2つの細胞集団の比較が有効とみなされるために、静止細胞と老化細胞の間に明確な区別をもたらすべきである。SA-βGal活性の場合、老化細胞は青色に見えるはずですが、静止期対照細胞は色がまったくないか、ほとんどありません(図2A)。このアッセイは、陽性の青色染色された細胞を全細胞数に対する百分率としてカウントし、次いで静止期対照と老化細胞との間の陽性率の百分率を比較することによって定量化することができる。両方のセル状態を比較するために、このプロトコルを同時に実行することが重要です。SA-βGal活性は染色溶液のpHに依存するため、結果はアッセイ間で大きく異なる可能性があり、定性的な尺度と考える必要があります。
老化マーカーのRT-qPCR解析では、ほとんどの老化モデルにおいて、SASP因子(IL6、CXCL8、IL1B)および細胞周期阻害剤(CDKN2A/p16、CDKN1A/p21)をコードするmRNAの高レベルが示されます。細胞型、培養状態、および老化誘導物質41,42に基づいて多少の変動が予想されるが、ほとんどの老化細胞は、静止対照細胞と比較してIL6、CXCL8、およびCDKN1A/p21 mRNAの5倍以上高いレベルを示す。逆に、増殖マーカーをコードするLMNB1およびPCNA mRNAのレベルは、静止期細胞と比較して老化細胞において低いか、または存在しないはずである(図2B)。まとめると、SA-βGal陽性の有意な割合と老化関連mRNAマーカーのパネルの予想される発現は、実験における老化の誘導を確認するのに十分である。
質量分析分析のためのタンパク質サンプルの処理は、溶液中消化(2日間)および固相抽出(4〜6時間)からなる。非標的プロテオミクス解析を実行するために、得られたペプチドをデータ依存性取得(DDA)を用いたLC-MS/MS解析に提出します。Orbitrap機器では、質量分析機器ソフトウェアメソッドエディタでDDA法を指定できます。この研究で使用した質量分析計の設定を 図3Aに示す。液体クロマトグラフィーの設定は、メソッドエディタ内で指定することもできます。この研究のために、有機相(アセトニトリル)を増加させる90分間の直線勾配を使用した(図3B)。集録が成功すると、総イオン電流(TIC)は、この方法の線形勾配部分の間に強烈な信号を含むはずです(図3C)。このプロトコルは、Orbitrap機器のプロトコル例を説明していますが、タンパク質半減期の計算は、DDAモードで収集された任意の質量分析計から得られたデータに対して実行することができ、これはいくつかのタイプの機器(例えば、Orbitrapsおよび飛行時間計器)およびベンダーで入手可能である。集録設定は、使用する機器の種類と構成に固有であり、質量分析施設によって提案された設定を使用することをお勧めします。この方法は、生データファイルから重いピークと軽いピークの定量クロマトグラフィーピーク面積を抽出し、スプレッドシート式に入力できる限り、非DDA法(SRM、PRM、DIA)とも互換性があります。
生質量分析ファイルは、ペプチドおよびタンパク質を同定するために利用可能な多くのプロテオミクスデータベース検索ツールの1つで検索されます。たとえば、この研究では、Mascot43検索エンジンを利用しました。重ペプチドと軽質ペプチドの定量のためのクロマトグラフィーピーク面積を得るために、データベース検索結果は、Skyline39,40などのクロマトグラフィーピーク面積が可能なプロテオミクスソフトウェアにインポートされます。抽出されたペプチドのイオンクロマトグラム(図4)を調べると、重ペプチドシグナルと軽ペプチドシグナルの相対比率が明らかになります。老化細胞における軽ペプチドシグナルに対する重質ペプチドシグナルの割合が低いほど、タンパク質代謝回転速度が遅いことを示し(図4A)、光に対する重いペプチドシグナルが高いほど、タンパク質代謝回転速度が速い(図4B)。標識されていないサンプルは、重いペプチドシグナルをほとんどまたはまったく示さないはずです。標識されていないサンプル中の見かけ上の重いペプチドシグナルはバックグラウンドノイズと見なされ、最終計算中に差し引かれます。すべての処理および標識条件における軽質ペプチドおよび重質ペプチドのクロマトグラフィーピーク面積の定量は、その後のタンパク質代謝回転率の計算および統計分析のためにエクスポートする必要があります。
単一時点分析を使用することで、タンパク質半減期の定量化は実行が簡単で、スプレッドシートで簡単に実行できます。 表3において、質量分析分析から同定された695個のタンパク質についての半減期を計算した。サンプル中の各タンパク質のタンパク質レベルの重同位体および軽同位体の存在量( 1)生データ シートの入力)から始めて、パーセント重同位体(比、Rと呼ばれる)が 、2)比H|と題されたシートで自動的に計算されます。H + L.このステップでは、重標識サンプルからのRを非標識サンプルから差し引くことによって正規化され、静止および老化の3連に対する最終的なRが生成されます。標識されていないサンプルは外因的に付加された重同位体を持つべきではないので、それらはバックグラウンドシグナルを除去するために使用されます。R から、k度 (離職率) は、次の式を使用して計算されます。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
半減期(H、日数)は、静止期対照および老化期の3連( 3)半減期(日)と題するシート)中の各タンパク質について、以下の式を用いて決定される:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
次に、これらの半減期を静止期と老化期の3連間で平均化して、各タンパク質の静止期と老化の平均半減期とp値を生成します。計算された半減期は、負の値に対してフィルタリングされます。これは、光標識された細胞(バックグラウンド)からの重いシグナルが、重い標識された細胞からの重いシグナルよりも大きい場合に発生します。このフィルタリングの結果、841から707のタンパク質が、ここに提示された結果に対して有効な半減期を有する同定された。
半減期は、静止制御細胞(log2FC )に対する老化のlog2比として報告され、火山プロットにプロットされます(図5)。例えば、 5)分析シートを見ると、凝固IIトロンビン受容体(F2R)タンパク質は、静止期細胞における半減期が0.51日(カラムB)であり、老化細胞における半減期が1.07日(カラムC)であり、p値が0.001の〜1.06(カラムD)のlog2FCを生じることがわかる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> 図1:老化および静止期の制御セルのpSILACワークフローの図。ヒトIMR-90線維芽細胞を用いて、タンパク質半減期の比較のために静止期(低血清)または老化期(IR)細胞培養物を調製した。次いで、細胞を、同位体アルギニンおよびリジンを有するSILACライトまたはSILACヘビー培地で3日間標識した。溶解物を細胞から抽出し、消化し、脱塩し、質量分析法を用いて分析した。重ペプチドおよび軽ペプチド同位体ピークは、それぞれ、新たに合成されたペプチドおよび既存のペプチドに対応する。半減期は指数関数的減衰の方程式を用いて計算した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> (A)老化細胞と静止期の細胞は、採取時に6ウェルプレートに再播種され、SA-βGal染色キットを使用してSA-βGalについて染色されます。細胞体の青色は老化に陽性である。画像は明視野で撮影され、倍率10倍のカラー、赤でサイズマーカーが表示されます。(B)無関係な実験からの老化細胞(赤色)およびサイクリング細胞(灰色)を比較するRT-qPCR分析。CDKN1A/p21、CXCL8、およびIL6 mRNAのレベルの上昇は、LMNB1 mRNAレベルの低下と同様に老化の指標である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> 図3:Q-Exactive HF orbitrap質量分析計でのpSILAC培養物のデータ依存取得(DDA)スキャンおよび液体クロマトグラフィー勾配の代表的な方法。 (A)pSILAC実験からの全細胞溶解物のデータ依存分析のための機器ソフトウェアの推奨機器設定。(b)液体クロマトグラフィーフローグラジエント法設定例。ペプチドは、5%~35%の緩衝液B(0.2%ギ酸および99.8%アセトニトリル)の範囲の90分間の直線勾配にわたって溶出され、続いて80%緩衝液Bで10分間洗浄され、5%緩衝液Bで25分間平衡化される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> 図4:老化中にターンオーバーが変化したペプチドの代表的な抽出イオンクロマトグラム 。 (A)老化細胞および非老化細胞におけるタンパク質DnaJホモログサブファミリーBメンバー11(DNAJB11)からのペプチドFQMTQEVVCDECPNVK++のクロマトグラフィーピーク面積。SILACの3日後、老化細胞は、軽ペプチド(赤色)に対する重同位体含有ペプチド(青色)のピーク面積の減少によって示されるように、静止期(非老化)細胞と比較して、このペプチドにより少ない重同位体をこのペプチドに組み込む。(b)老化細胞および非老化細胞におけるタンパク質スプライシング因子3aサブユニット1(SF3A1)由来のペプチドVQAQVIQETIVPK++のクロマトグラフィーピーク面積。SILACの3日後、老化細胞は、軽ペプチド(赤色)に対する重同位体含有ペプチド(青色)のピーク面積の減少によって示されるように、静止期(非老化)細胞と比較して、このペプチドにより高い割合の重同位体を組み込んでおり、このペプチドが老化細胞における代謝回転を増加させたことを示している。標識されていない(Day 0)条件は、予想通り、両方のペプチドに対する重同位体の取り込みを示さない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> 図5:pSILAC標識から決定された老化細胞および静止期細胞におけるタンパク質半減期の比較。 (a)695個の同定されたタンパク質のそれぞれについての老化/対照(静止)のlog2 比を表示する火山プロット;この実験では、ライトおよびヘビー標識媒体はグルコースおよびフェノールレッドを含まなかった。(B)静止期細胞対老化細胞において半減期が最も増加または減少した上位10個のタンパク質を示す表(それぞれ左および右)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:このプロトコルで使用されるメディアとバッファ<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:このプロトコールで用いたRT-qPCRプライマー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表3:タンパク質半減期、フォールド変化、およびt検定を計算するためのSILAC分析ワークブック。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

このプロトコルは、パルスSILACによる老化細胞および非分裂細胞の代謝標識、非標的質量分析分析、およびタンパク質半減期の合理化された計算のためのワークフローを記述します。

代謝標識および質量分析による老化および非分裂培養細胞におけるタンパク質代謝回転率の測定

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

細胞がタンパク質の恒常性を維持する方法は、細胞ストレスと老化の文脈ではよく理解されていません。このプロトコルでは、生細胞におけるタンパク質恒常性の重要な要素であるタンパク質代謝回転を計算するための簡単で正確な方法を提供します。Pulse SILACは、個々のタンパク質およびプロテオーム全体のタンパク質代謝回転をハイスループットな方法で測定する能力を実験者に提供しますが、これは他の方法よりも生物学的システムにとってより本物です。この方法の原理は、生物全体を含む代謝的に標識することができる任意の系に適用することができる。この方法はまた、細胞老化、老化、および神経変性疾患への洞察をもたらし得る。質量分析分析は、洗剤などの特定の化学汚染物質に対して非常に敏感です。この手順全体を通してLC-MSグレードの試薬を使用して、高品質のデータ収集を保証します。細胞の代謝標識を開始するには、老化細胞および静止期細胞のそれぞれ 3 つのプレートの培地を 30 ミリリットルの SILAC Light 培地と交換します。別途、3つの老化プレートと3つの静止プレート用の培地を30ミリリットルのSILAC Heavyと交換してください。培地を交換せずに細胞を3日間増殖させる。培養プレートから細胞を剥離するために、予め加温したトリプシン試薬を各プレートに5ミリリットル加え、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートする。その後、剥離した細胞を培養に用いた5ミリリットルの同じ培地に全量10ミリリットルまで再懸濁する。次に、細胞を氷に移し、細胞を摂氏4度でGの300倍で遠心分離する。ペレットを2回洗浄した後、細胞を再びスピンダウンし、上清を除去してから、ペレットを150マイクロリットルの新しく調製した8モル尿素および50ミリモル重炭酸アンモニウム溶解緩衝液に再懸濁する。チューブの内容物を上下にピペッティングして混合します。50マイクログラムのタンパク質サンプルを新しいチューブにアリコートし、溶解バッファーでサンプルを等量まで運びます。次いで、ジチオスレイトールを終濃度20ミリモルまでチューブに加え、試料を摂氏37度で振とうしながら30分間インキュベートする。サンプルを室温で10分間冷却してから、ヨードアセトアミドを終濃度40ミリモルに添加し、室温で暗所で30分間インキュベートする。次いで、50ミリモルの炭酸水素アンモニウム緩衝液で試料を1モル以下の尿素に希釈する。50マイクログラムの開始タンパク質に対して1マイクログラムのトリプシンを加えるか、または1:50のトリプシン対タンパク質比でサンプルに加える。サンプルを摂氏37度で一晩振とうしながらインキュベートし、タンパク質をペプチドに消化します。翌日、ギ酸をサンプルの1体積%に加え、タンパク質消化をクエンチする。サンプルのクリーンアップでは、製造元のガイドラインに従って、サンプルごとに 1 つの抽出カートリッジを使用して、真空マニホールド上に固相抽出カートリッジを置きます。抽出後、真空マニホールドからペプチドサンプルを取り出し、真空濃縮器で完全に乾燥させます。乾燥には約3時間かかります。質量分析またはMS分析のために、0.2%ギ酸緩衝液中に1マイクロリットルあたり400ナノグラムの濃度でペプチドサンプルを再懸濁する。ペプチドを再可溶化するために、サンプルを5分間混合する。その後、水浴超音波処理機で5分間超音波処理する。次いで、サンプルを遠心分離して不溶性物質をペレット化し、ペプチド上清をMSバイアルに移す。液体クロマトグラフィータンデム質量分析法 (LC-MS-MS) を使用してプロテオーム分析用のサンプルを提出します。質量分析施設による非ターゲット分析に推奨される設定を使用します。毎分400ナノリットルの流速でサンプルを分析カラムにロードし、有機溶媒と無機溶媒の混合物を使用して90分間の直線勾配でペプチドを溶出させ、有機溶媒は5〜35%の範囲で、MS1サーベイスキャンの連続サイクルに続いてHCDフラグメンテーションを伴う20のデータ依存MS2スキャンが続くデータ依存モードで質量分析データを取得します。プロテオーム定量ソフトウェアツールで重ペプチドと軽質ペプチドのペプチドピーク面積を定量します。次に、重くて軽いペプチドピーク領域をエクスポートします。タンパク質の半減期を計算するには、SILAC 解析ワークブックを Raw Data という名前の最初のシートに開き、UniProt ID、遺伝子名、重いピーク領域と軽いピーク領域を指示された列に貼り付けます。次に、「分析」という名前の 4 番目のシートを開き、列 G と列 H がサンプルが範囲外であることを示す行を削除し、読み取り対象の行を範囲内に保ちます。老化表現型を、老化関連β-ガラクトシダーゼ活性およびRT-qPCR分析を用いて検証した。β-ガラクトシダーゼ活性については、老化細胞は青色に見えたが、静止期対照細胞は色が全くないか、または最小色であった。RT-qPCR解析では、老化細胞は静止細胞と比較して高いインターロイキン-6、CXCL8、およびCDKN1A-P21 mRNAを示した。逆に、増殖マーカーをコードするラミンB1のレベルは、老化細胞において低かったか、または存在しなかった。抽出されたペプチドのイオンクロマトグラムは、重ペプチドシグナルと軽ペプチドシグナルの相対比率を明らかにした。軽い老化細胞と比較して重いペプチドシグナルの割合が低いほどタンパク質代謝回転速度が遅くなり、軽い細胞に対して重いペプチドシグナルが高いほどタンパク質代謝回転速度が速いことが示されました。標識されていないサンプルは、重いペプチドシグナルをほとんどまたはまったく示さなかった。質量分析分析から同定された695タンパク質についての半減期を計算した。半減期は、静止状態の細胞に対する老化の対数2比として報告され、火山プロットにプロットされる。老化細胞におけるタンパク質代謝回転率の計算に続いて、下流の解析により、タンパク質形成機構によって調節される候補生物学的経路が明らかにされ得る。Pulse SILACは、研究者が前例のない粒度とスループットでタンパク質ダイナミクスを研究する道を開き、多くの個々のタンパク質におけるタンパク質恒常性の変化を研究することを可能にしました。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

のフェーズI代謝コンピテンシーを特徴づけるために質量分析とルミネベースのアプローチ<em&gt;インビトロ</em&gt;細胞培養

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

校正と単一のヌクレオチドの拡張子と MALDI-TOF 質量分析を用いた DNA 修復アッセイ

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...