Name: measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) og Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). N.B. ble støttet av Longevity Impetus Grants, og Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Figur 1 ble opprettet med BioRender.com.

Forfatterne har ingen avsløringer.

pSILAC er en kraftig teknikk som muliggjør global kvantifisering av proteinomsetningshastigheter på tvers av flere cellulære forhold. Dette dokumentet beskriver bruken av pSILAC for å sammenligne globalt protein halveringstid mellom senescent og quiescent celler, inkludert instruksjoner for fremstilling av senescent og quiescent celler, SILAC merking og høsting, og til slutt analyse ved hjelp av DDA masse spektrometri. I tillegg er en to-trinns test beskrevet for validering av senescence fenotype ved hjelp av SA-βGal og RT-qPCR analyse av et panel av mRNAs koding senescence-assosierte proteiner. I tillegg til validering av senescence med de to tilnærmingene som er beskrevet, kan en tredje validering av senescence utføres etter massespektrometrianalyse ved å lete etter endringer i kjente senescence markører mellom senescent og quiescent celler på proteomisk nivå. Senescence-assosierte proteiner som forventes å bli forhøyet inkluderer p16, p21 og BCL2, blant andre, beskrevet andre steder44,45. I protokollen beskrevet ovenfor ble ioniserende stråling brukt til induksjon av senescence og serum sult for passiviserende celler. For induksjon av senescence er det flere alternativer tilgjengelig, og det er betydelig heterogenitet blant dem 41,42,46. For tiden er det ingen senescent metode som regnes som den "mest fysiologiske", så valget av senescent inducer er i stor grad basert på konteksten av eksperimentet. Eksperimenter med mål om å si et generelt fenomen om senescence anbefales imidlertid å bruke minst to forskjellige senescent indusere. Å diskutere omfanget av senescence paradigmer er utenfor omfanget av dette papiret, men noen vanlige metoder for å indusere senescence inkluderer å utløse DNA-skade (IR, doxorubicin, replikerende utmattelse), uttrykke onkogene proteiner (HRAS, BRAF), og forstyrre mitokondrier funksjon2.
I tillegg til valg av senescent induser, er valg av kontrollceller en like viktig vurdering. Senescent celler er per definisjon under ubestemt vekst arrest, så en sammenligning med andre vekst-arresterte celler blir ofte valgt. For pSILAC er celler som er arrestert i cellesyklusen generelt å foretrekke fordi de ikke replikerer og dermed er lettere å bruke til beregninger av proteinhalvtid47. Men siden kultiverte celler ofte vil beholde noen skilleceller, er det viktig at metodene som brukes til å indusere cellesyklusstans, gir så homogen respons som mulig for å minimere feil fra celler som fortsatt sprer seg. For å beregne proteinforringelsesrater for sykkelceller ved hjelp av pSILAC krever ytterligere beregninger for å kompensere for hvor raskt protein fortynnes i datterceller27. Imidlertid er passiv vekstarrest i seg selv ikke uten komplikasjoner. Det er to generelle metoder for cellesyklusstans: serummangel og kontakthemming48. Ikke alle celler kan gjøres passiviserende gjennom kontakthemming, selv om noen fibroblaster har vist seg å demonstrere passivens etter flere dager med dyrking49. Denne metoden brukte serummangel fordi den er mer vanlig å bruke til sammenligninger av senescentceller, selv om det krever at senescentcellen er tilsvarende serumberøvet for nøyaktige sammenligninger. Serum aktiverer mTOR-komplekset, og dermed har serummangel flere nedstrømseffekter på cellen i tillegg til cellesyklusstans50. Spesielt har senescent celler vist seg å vise en redusert SASP ved serummangel eller mTOR-hemming51,52.
Et annet viktig poeng å vurdere i pSILAC er hvor mange tidspunkter å teste. Denne protokollen samlet celler på et enkelt tidspunkt (3 dager med lett eller tung merking), noe som betydelig forenkler den resulterende analysen. Valget av tidspunkt bør være basert på eksperimentets mål. For global analyse forventes det at 3 dager vil fange opp et flertall proteiner, selv om halveringstid for kortlivede proteiner som fullstendig omsetning innen 3 dager (alt lyssignal går tapt) ikke kan måles på dette tidspunktet. Omvendt er langlivede proteiner med svært liten omsetning på 3 dager også vanskelig å kvantifisere og vises ofte som å ha ekstremt store halveringstider (i rekkefølgen av uker) som vanligvis bare er en konsekvens av svært lite tung signalakkumulering. På grunn av det ikke-lineære forholdet mellom tunge og lette peptidsignaler kontra prosentandelen av nylig syntetisert protein på kortere og lengre tidspunkter, kan kvantiseringen av halveringstider forbedres ved å legge til flere merketidspunkter. For relative sammenligninger mellom to celletilstander, som i denne protokollen, kan en omtrentlig halveringstid være tilstrekkelig, men flere tidspunkter kan brukes til å forbedre kvantitativ nøyaktighet.
Denne protokollen beskriver hvordan du utfører en umålt DDA-basert analyse av proteinomsetning. Imidlertid kan proteinomsetningsberegningene brukes generelt på enhver oppkjøpsordning som er i stand til å utlede den relative overfloden av tunge og lette peptidpar. MS2-baserte metoder som datauavhengig anskaffelse (DIA/SWATH) kan for eksempel også brukes til beregning av omsetningsrater med hell53. I tillegg kan andre instrumenterings- og programvarerørledninger enn de som er beskrevet i denne protokollen, brukes til å utføre DDA-analyse, proteinidentifikasjon og protein kvantifisering. Når du bruker programvareplattformer for protein kvantifisering som Skyline for å trekke ut peptidtoppområder, anbefales det å manuelt inspisere ekstraherte ionkromatogrammer i dokumentarbeidsområdet, identifisere topper som feilaktig ble integrert og ikke-kvantitative topper, og kuratere dokumentet deretter. En omfattende samling av opplæringsprogrammer er tilgjengelig online for Skyline (skyline.ms).
pSILAC representerer en av de mest ideelle metodene for global kvantifisering av proteinhalvliv i dyrkede celler på grunn av overlegen multipleksing (proteomdekning) og gjennomstrømning. Mens pSILAC ikke gir direkte syntese eller nedbrytning, siden endringen i lett og tungt signal skyldes en sammenløp av faktorer, er pSILAC svært nyttig for sammenligninger mellom forhold og forskjellige celletyper. Lavgjennomstrømningsmetoder faller ofte inn i to typer: 1) behandling av celler med cykloheksimid for å blokkere proteinsyntese og høste med tidsintervaller etter tilsetning for å overvåke forfall, eller 2) behandling av celler med en hemmer av proteinforfall og høsting med tidsintervaller etter tilsetning for å overvåke opphopning av protein, og dermed utlede proteinforfallshastigheter. Begrensningen av begge metodene er at slike behandlinger uunngåelig vil føre til betydelige endringer i cellulær fysiologi. I kontrast krever pSILAC ingen betydelig inngrep og har teoretisk sett ingen påvisbare effekter på cellulær fysiologi siden isotopiske aminosyrer bare varierer med en enkelt nøytron fra deres ikke-isotopiske kolleger. Dermed representerer metoden beskrevet her for pSILAC en enkel protokoll for global måling av de mest fysiologiske proteinhalvdelene i ikke-splittende celler.
Endringer i proteinomsetning har et nært forhold til aldring, aldersrelaterte sykdommer, nevrodegenerasjon og levetid54,55. Denne protokollen beskriver en metode for å forhøre disse forholdene ved å bruke stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekulturen for å måle proteinomsetningshastigheter i senescence-celler. Imidlertid finnes det mange analoge metoder for å utføre studier i sammenheng med aldring og nevrodegenerasjon in vivo i hele organismer som mus. Faktisk har disse studiene understreket viktigheten av å måle proteinomsetningsrater i sammenheng med aldersrelaterte sykdommer 56,57,58,59.
I denne studien skilte ribosomale proteiner og proteiner som ligger i det endoplasmiske retikulumet seg ut som to kategorier proteiner med henholdsvis redusert og økt halvering av liv i senescentceller. Mens videre analyse av steady-state nivåer er nødvendig for definitive konklusjoner, disse resultatene ytterligere tyder på at senescent celler kan unikt regulere oversettelse gjennom redusert halvering av ribosomale proteiner. Fremover vil bruk av stabile isotopmerkingsmetoder for å studere forholdet mellom cellulær senescence og neurodegeneration in vivo i musemodeller være en lovende forlengelse av isotopmerkingsmetoden beskrevet av denne protokollen.

Senescence ble først identifisert som en tilstand av ubestemt vekst arrest utstilt av kultiverte primærceller etter å ha nådd replikert utmattelse1. Det har siden blitt vist at senescence kan oppstå som svar på mange cellulære fornærmelser, inkludert gentoksiske, mitokondrie og onkogene påkjenninger, blant andre2. Mens senescence har flere fysiologisk viktige roller, for eksempel tumorundertrykking og sårheling, er akkumulering av senescentceller under aldring forbundet med en rekke skadelige effekter på helse3, inkludert flere nevrodegenerative forhold 4,5,6. Cellulær senescence forekommer i flere hjernecelletyper, inkludert nevroner 7,8,9,10, astrocytter11, mikroglia12 og oligodendrocyttforløpere13, og bidrar til nevrodegenerasjon og kognitiv dysfunksjon. Amyloid beta oligomers, et av kjennetegnene på Alzheimers sykdom14, har vist seg å akselerere nevronal senescence 13,15,16. En økt forekomst av senescent celler har også vært forbundet med Parkinsons sykdom17, spesielt som følge av miljøstressorer11,18. Det er viktig at selektiv eliminering av senescentceller i prekliniske modeller forlenger levetiden og reduserer en rekke aldersrelaterte sykdommer 3,5,12 og forbedrer kognitive underskudd 8,11,12,13. Senescent celler har dermed dukket opp som lovende terapeutiske mål for behandling av mange aldersrelaterte forhold.
Mye av den skadelige effekten av senescentceller er forårsaket av senescence-assosiert sekretorisk fenotype (SASP), en kompleks blanding av bioaktive molekyler utskilt av senescent celler som kan forårsake lokal betennelse, angiogenese, ødeleggelse av den ekstracellulære matrisen, og forplantning av senescence i omkringliggende vev 19,20,21 . SASP representerer også et interessant biologisk fenomen av senescence fordi det krever en betydelig transkripsjons- og translasjonsinnsats under en tilstand av cellesyklusarrest. Faktisk har senescent celler vist seg å vise nedgang i ribosomet biogenese 22,23,24 som bør redusere proteinsyntesen. I stedet oversetter senescentceller robust noen proteiner, spesielt SASP-faktorer, og påvirker metabolismen av omkringliggende vev25. Dermed er det stor interesse for å forstå hvordan senescentceller som gjennomgår en permanent cellesyklusstans fortsetter å opprettholde protein homeostase, samtidig som de robust uttrykker SASP-faktorer og andre utvalgte proteiner.
Denne metoden beskriver hvordan du bruker massespektrometri og pulserende stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekultur (pSILAC) for å globalt måle halvering av proteiner i senescentceller i proteome-bred skala. I tradisjonell SILAC er dyrkede celler helt metabolsk merket med tunge og lette ikke-radioaktive isotoper av aminosyrer for nedstrøms analyse av proteinoverflod. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å vurdere overflodsendringer omfattende og kvantitativt i SASP av kultiverte fibroblaster26. I pSILAC er celler tilsvarende metabolsk merket med en puls av tung isotop som følger forhåndsmerking med lett isotop, og deretter høstes med ett eller flere tidsintervaller. Graden av inkorporering av tung isotop i referanse til eksisterende lysisotoper brukes deretter til å beregne relative proteinomsetningshastigheter. Vanligvis brukes isotoper av arginin og lysin fordi trypsin cleaves på disse rester; Dermed vil alle peptider fra standard fordøyelse potensielt inneholde den tunge etiketten. Par peptider som bare varierer ved tilstedeværelse eller fravær av tung lysin eller arginin er kjemisk identiske og kan differensieres og kvantifiseres av et massespektrometer. Etter massespektrometrianalyse kan peptider identifiseres som nylig syntetisert eller eksisterende basert på tilstedeværelsen eller fraværet av den isotopiske etiketten i de resulterende peptididentifikasjonene. Proteinomsetningshastigheter kan deretter bestemmes ved å tilpasse forholdet mellom tunge (13 C-15N) over lette (12 C-14N) peptider for et gitt protein til kinetiske modeller for eksponentiell vekst eller forfall27,28. pSILAC har blitt brukt i flere sammenligninger av proteinomsetningshastigheter 29,30,31,32 og er for tiden den mest omfattende og høygjennomstrømningsmetoden for måling av protein halveringstiden.
Denne protokollen beskriver utarbeidelsen av senescent celler parallelt med tilsvarende vekst-arresterte passivitetsceller i kultur, etterfulgt av metabolsk merking med pSILAC. Celler høstes deretter, homogeniseres til lysater og behandles for massespektrometrioppkjøp og analyse. Dataene hentet fra massespektrometri brukes deretter til å bestemme protein halveringstider ved hjelp av en forenklet kvantitativ metode som bruker ett enkelt tidspunkt og halveringsberegninger utført i et regneark. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan estimater av protein halveringstiden måles på en omfattende og kvantitativ måte som er mer autentisk for uforstyrrede cellulære forhold enn protokoller som bruker blokkeringer av proteinsyntese eller omsetning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammacel 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td></td>
			<td>Cesium Irradiator for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-90 primary lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iRT Kit (indexed retention time)</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td>Indexed Retention Time Peptide Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>423835000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Mascot Daemon 2.8</td>
			<td>Proteomic database searching software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q Exactive HF Orbitrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>327110025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline</td>
			<td>University of Washington</td>
			<td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td>
			<td>Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator waterbath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-516R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Referred to as phenol in text; hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPle Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (sequencing grade)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry

Voksende bevis har vist at opphopning av senescent celler i sentralnervesystemet bidrar til nevrodegenerative lidelser som Alzheimers og Parkinsons sykdommer. Cellulær senescence er en tilstand av permanent celle syklus arrestasjon som vanligvis oppstår som svar på eksponering for sub-dødelige påkjenninger. Men som andre ikke-splittende celler forblir senescentceller metabolsk aktive og utfører mange funksjoner som krever unike transkripsjons- og translasjonskrav og utbredte endringer i de intracellulære og utskilte proteomene. Forstå hvordan proteinsyntese og forfallshastigheter endres under senescence kan belyse de underliggende mekanismene for cellulær senescence og finne potensielle terapeutiske veier for sykdommer forverret av senescent celler. Dette dokumentet beskriver en metode for proteomskala evaluering av protein halveringstider i ikke-splittende celler ved hjelp av pulserende stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekultur (pSILAC) i kombinasjon med massespektrometri. pSILAC innebærer metabolsk merking av celler med stabile tunge isotopholdige versjoner av aminosyrer. Kombinert med moderne massespektrometri tilnærminger, pSILAC muliggjør måling av proteinomsetning av hundrevis eller tusenvis av proteiner i komplekse blandinger. Etter metabolsk merking kan omsetningsdynamikken til proteiner bestemmes basert på relativ berikelse av tunge isotoper i peptider oppdaget av massespektrometri. I denne protokollen er en arbeidsflyt beskrevet for generering av senescent fibroblastkulturer og tilsvarende arresterte quiescent fibroblaster, samt et forenklet, engangspunkt pSILAC-merkingstidskurs som maksimerer dekningen av forventede proteinomsetningshastigheter. Videre presenteres en rørledning for analyse av pSILAC massespektrometridata og brukervennlig beregning av proteinforringelseshastigheter ved hjelp av regneark. Anvendelsen av denne protokollen kan utvides utover senescent celler til alle ikke-splittende dyrkede celler som nevroner.

Denne protokollen beskriver en metode for globalt å sammenligne proteinhalvvanser mellom senescent og ikke-splittende, passiv kontrollceller ved hjelp av pSILAC og minimale tidspunkter. Denne protokollen beskriver generering av senescent og quiescent celler i kultur, metabolsk merking av celler med stabile isotoper av arginin og lysin over 3 dager, kvantifiserer de relative overflod av tunge og lette peptidisotoper ved massespektrometri, og en enkel og tilgjengelig beregning av protein halveringstider ved hjelp av regnearkformler (figur 1). Denne metoden er svært fleksibel og kan tilpasses mange celletyper og forhold.
Som en del av genereringen av senescentceller for denne protokollen, brukes to metoder for senescence-validering: SA-βGal-positive celler visualisert ved mikroskopi og økte nivåer av senescentmarkører kvantifisert ved hjelp av RT-qPCR-analyse. Måling av senescent markører bør gi klare forskjeller mellom passiviserende og senescent celler for sammenligninger av de to cellene populasjoner som skal anses som gyldige. For SA-βGal-aktivitet skal senescentceller vises blå mens passivitetskontrollceller ikke har noen eller svært liten farge (figur 2A). Denne analysen kan kvantifiseres ved å telle de positive, blåfargede cellene som en prosentandel av det totale antallet celler, og deretter sammenligne den prosentvise positivitetshastigheten mellom passivitetskontroll og senescentceller. Det er viktig at denne protokollen utføres samtidig for sammenligning av begge celletilstander; SA-βGal aktivitet er avhengig av pH i fargeløsningen, slik at resultatene kan variere betydelig mellom analyser og bør betraktes som et kvalitativt tiltak.
RT-qPCR-analysen av senescent markører vil vise høye nivåer av mRNAs koding SASP-faktorer (IL6, CXCL8, IL1B) og cellesyklushemmere (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21) i de fleste senescent modeller. Selv om det forventes en viss variasjon basert på celletype, kulturtilstand og senescent induser41,42, viser de fleste senescent celler større enn fem ganger høyere nivåer av IL6, CXCL8 og CDKN1A / p21 mRNAer sammenlignet med passiv kontrollceller; Nivåene av LMNB1- og PCNA mRNAer, koding av spredningsmarkører, bør derimot være lave eller fraværende i senescentceller sammenlignet med passiviserende celler (figur 2B). Samlet sett er en betydelig prosentandel av SA-βGal positivitet og det forventede uttrykket for et panel av senescence-assosierte mRNA-markører tilstrekkelig til å bekrefte induksjon av senescence i et eksperiment.
Behandling av proteinprøver for massespektrometrianalyse består av in-solution fordøyelse (2 dager) og solidfaseutvinning (4-6 t). For å utføre umålt proteomisk analyse sendes de resulterende peptidene inn for LC-MS/MS-analyse ved hjelp av dataavhengig anskaffelse (DDA). På Orbitrap-instrumenter kan en DDA-metode spesifiseres i redigeringsprogrammet for massespektrometriinstrumenter. Massespektrometerinnstillingene som brukes i denne studien, er vist i figur 3A. Innstillinger for væskekromatografi kan også spesifiseres i metoderedigeringsprogrammet. For denne studien ble det brukt en 90 min lineær gradient med økende organisk fase (acetonitril) (figur 3B). Etter et vellykket oppkjøp skal den totale ionstrømmen (TIC) inneholde et intenst signal under den lineære gradientdelen av metoden (figur 3C). Denne protokollen beskriver en eksempelprotokoll på et Orbitrap-instrument, men beregningen av proteinhalvtider kan utføres på data hentet fra ethvert massespektrometer som ble samlet inn i DDA-modus, som er tilgjengelig på flere typer instrumenter (f.eks. Orbitraps og tid-of-flight instrumenter) og leverandører. Anskaffelsesinnstillingene vil være unike for typen og konfigurasjonen av instrumentet som brukes, og det anbefales å bruke innstillingene som foreslås av massespektrometrianlegget. Denne metoden er også kompatibel med ikke-DDA-metoder (SRM, PRM, DIA), så lenge kvantitative kromatografiske toppområder for tunge og lette topper kan trekkes ut fra rådatafilene og legges inn i regnearkformlene.
Rå masse spektrometri filer er søkt med en av de mange tilgjengelige proteomiske database søk verktøy for å identifisere peptider og proteiner. For eksempel brukte denne studien Mascot43 søkemotor. For å oppnå kromatografiske toppområder for kvantifisering av tunge og lette peptider importeres databasesøkeresultater til en proteomisk programvare som er i stand til kromatografiske toppområder som Skyline39,40. Undersøkelse av de ekstraherte ionkromatogrammer av peptider (figur 4) vil avsløre den relative andelen tunge og lette peptidsignaler. En lavere andel av tunge peptidsignaler i forhold til lett peptidsignal i senescentceller indikerer en langsommere proteinomsetningshastighet (figur 4A), og et høyere tungt peptidsignal i forhold til lys indikerer en raskere proteinomsetningshastighet (figur 4B). De umerkede prøvene skal vise lite eller ingen tungt peptidsignal. Ethvert tilsynelatende tungt peptidsignal i de umerkede prøvene betraktes som bakgrunnsstøy og vil bli trukket fra under de endelige beregningene. Kvantifisering av kromatografiske toppområder for lette og tunge peptider for alle behandlings- og merkeforhold må eksporteres for etterfølgende beregning av proteinomsetningshastigheter og statistisk analyse.
Ved å bruke enkelttidspunktanalyse er kvantifiseringen av protein halveringstider enkel å utføre og kan gjøres praktisk i regneark. I tabell 3 ble halveringstider for 695 proteiner identifisert fra massespektrometrianalysen beregnet. Fra protein-nivå tunge og lette isotop overflod for hvert protein i prøvene (inngang for 1) Raw Data sheet), en prosent tung isotop (kalt Ratio, R) beregnes deretter automatisk på arket med tittelen 2) Ratio H | H + L. På dette trinnet normaliseres R fra tunge merkede prøver ved å trekke R fra umerkede prøver for å produsere en endelig R for passivitet og senescent triplikater. Siden umerkede prøver ikke bør ha noen eksogent lagt til tung isotop, brukes de til å eliminere bakgrunnssignalet. Fra R beregnes kdeg (omsetningshastighet) ved hjelp av følgende formel:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
Halveringstiden (H, i dager) bestemmes for hvert protein i passiviserende kontroll og senescent triplikater (ark med tittelen 3) Half-Life (dager)) ved hjelp av følgende formel:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
Disse halveringstidene blir deretter gjennomsnittet blant passiviserende og senescent triplikater for å generere en passiv og senescent gjennomsnittlig halveringstid for hvert protein samt en p-verdi. Beregnede halveringstider filtreres deretter etter verdier som er negative, noe som oppstår når det tunge signalet fra lyse celler (bakgrunnen) er større enn det tunge signalet fra tunge celler. Denne filtreringen resulterte i 707 proteiner fra 841 identifisert med gyldige halveringstider for resultatene som presenteres her.
Halveringstiden rapporteres deretter som et logg2-forhold mellom senescent over passiv kontrollceller (log2FC) og plottet inn i en vulkanplott (figur 5). Hvis du for eksempel ser på analysearket 5), koagulasjonen II trombinreseptor (F2R) protein kan sees å ha en halveringstid i passiviserende celler på 0,51 dager (kolonne B) og en halveringstid i senescent celler på 1,07 dager (kolonne C) som ga en logg2FC på ~ 1,06 (kolonne D) med en p-verdi på 0,001.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> Figur 1: Diagram over pSILAC-arbeidsflyt for senescent- og passivitetskontrollceller. Humane IMR-90 fibroblaster ble brukt til å forberede passiviser (lavt serum) eller senescent (IR) cellekulturer for sammenligning av protein halvering av liv. Celler ble deretter merket med SILAC Light eller SILAC Heavy media med isotopisk arginin og lysin i 3 dager. Lysater ble ekstrahert fra celler, fordøyd, avsaltet og analysert ved hjelp av massespektrometri. Tunge og lette peptidisotoper tilsvarer henholdsvis nylig syntetiserte og eksisterende peptider. Halveringstiden ble beregnet ved hjelp av en ligning for eksponentiell forfall. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> Figur 2: Validering av senescent fenotyper ved hjelp av SA-βGal- og RT-qPCR-analyser. (A) Senescent- og passive celler re-belagt på tidspunktet for høsting i en 6-brønns plate og farget for SA-βGal ved hjelp av SA-βGal fargesett. Blå farge i cellekroppen er positiv for senescence. Bilder er tatt i brightfield med farge ved 10x forstørrelse, størrelsesmarkør i rødt. (B) RT-qPCR-analyse som sammenligner senescentceller (røde) og sykkelceller (grå) fra et ikke-relatert eksperiment. Økninger i nivåene av CDKN1A/p21, CXCL8 og IL6 mRNAer indikerer senescence, og det samme gjelder nedgangen i LMNB1 mRNA-nivåer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> Figur 3: Representative metoder for dataavhengig anskaffelse (DDA) skanninger og væskekromatografi gradient av pSILAC kulturer på Q-Exactive HF orbitrap massespektrometer. (A) Anbefalte instrumentinnstillinger i instrumentprogramvaren for dataavhengig analyse av helcellelys fra et pSILAC-eksperiment. (B) Eksempel på innstillinger for strømningsmetode for flytende kromatografi. Peptider er eluted over en 90-min lineær gradient som spenner fra 5% til 35% buffer B (0,2% maursyre og 99,8% acetonitril), etterfulgt av en 10 min vask med 80% buffer B, og 25 min likevekt med 5% buffer B. (C) Et representativt totalt ionkromatogram (TIC) av et massespektrometrioppkjøp av IMR-90 fibroblastpeptider ervervet med de angitte innstillingene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> Figur 4: Representativt ekstrahert ionkromatogrammer av peptider med endret omsetning under senescence. (A) Kromatografiske toppområder i peptidet FQMTQEVVCDECPNVK++ fra proteinet DnaJ homolog subfamilie B medlem 11 (DNAJB11) i senescent og ikke-senescent celler. Etter 3 dager med SILAC inkorporerer senescentceller mindre tung isotop i dette peptidet sammenlignet med quiescent (ikke-senescent) celler, som indikert ved en reduksjon i toppområdet av tung isotopholdig peptid (blå) i forhold til lyspeptidet (rødt), noe som indikerer at dette peptidet har redusert omsetningen i senescentceller. (B) Kromatografiske toppområder i peptidet VQAQVIQETIVPK++ fra proteinet Skjøtefaktor 3a Subenhet 1 (SF3A1) i senescent og ikke-senescent celler. Etter 3 dager med SILAC inkorporerer senescentceller en høyere andel av tung isotop i dette peptidet sammenlignet med passivitetsceller (ikke-senescent), som indikert av en reduksjon i toppområdet av tung isotopholdig peptid (blå) i forhold til lyspeptidet (rødt), noe som indikerer at dette peptidet har økt omsetningen i senescentceller. De umerkede (dag 0) forholdene viser ingen inkorporering av tung isotop for begge peptider, som forventet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> Figur 5: Sammenligning av halvering av protein i senescent og passivitetsceller bestemt av pSILAC-merking. (A) Vulkan plott som viser logg2 forholdet mellom senescent / kontroll (passivist) for hver av de 695 identifiserte proteinene; I dette eksperimentet inneholdt lys og tung merkingsmedie ingen glukose og ingen fenolrød. (B) Tabeller som viser de 10 beste proteinene med mest økt eller redusert halvering av liv i passivefleksceller kontra senescentceller (henholdsvis venstre og høyre). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: Medier og buffere som brukes i denne protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 2: RT-qPCR-primere som brukes i denne protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 3: SILAC-analysearbeidsbok for beregning av halvering av protein, foldendringer og t-tester. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Denne protokollen beskriver arbeidsflyten for metabolsk merking av senescent og ikke-delende celler med pulserende SILAC, umålt massespektrometrianalyse og en strømlinjeformet beregning av proteinhalvvanser.

Måling av proteinomsetningshastigheter i senescent og ikke-dele kultivert celler med metabolsk merking og massespektrometri

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Hvordan celler opprettholder protein homeostase er ikke godt forstått i sammenheng med cellulær stress og senescence. I denne protokollen gir vi en enkel og nøyaktig måte å beregne proteinomsetning, som er en nøkkelkomponent i protein homeostase i levende celler. Pulse SILAC gir en eksperimenterer muligheten til å måle proteinomsetning for individuelle proteiner og hele proteomet på en høy gjennomstrømningsmåte som også er mer autentisk for biologiske systemer enn andre metoder.Prinsippene for denne metoden kan brukes på ethvert system som kan merkes metabolsk, inkludert hele organismer. Denne metoden kan også føre til innsikt i cellulær senescence, aldring og nevrodegenerativ sykdom. Massespektrometrianalyse er svært følsom for visse kjemiske forurensninger, for eksempel vaskemidler.Bruk LC-MS-grade reagenser gjennom hele denne prosedyren for å sikre innsamling av data av høy kvalitet. For å begynne metabolsk merking av cellene, erstatt mediet for tre plater hver av senescent og quiescent celler med 30 milliliter SILAC Light media. Separat, erstatt mediet for tre senescent og tre passivitetsplater med 30 milliliter SILAC Heavy.Utvid cellene i tre dager uten å endre mediet. For å løsne cellene fra kulturplatene, legg til fem milliliter forvarmet trypsinreagens til hver tallerken og inkuber platene i fem minutter ved 37 grader Celsius. Senere, resuspend de frittliggende cellene i fem milliliter av samme medier som brukes til kultur til et totalt volum på 10 milliliter.Deretter overfører du cellene til is og sentrifugerer cellene ved 300 ganger G ved fire grader Celsius. Etter å ha vasket pellet to ganger, snurr du ned cellene igjen og fjerner supernatanten før du bruker pelletsen på nytt i 150 mikroliter nylagde åtte-molar urea og 50 millimolar ammoniumbikarbonat lysisbuffer. Bland innholdet i røret ved å pipettere opp og ned.Aliquot 50 mikrogram proteinprøven inn i et nytt rør og bringer prøver opp til like volumer med lysisbuffer. Tilsett deretter dithiothreitol i en endelig konsentrasjon på 20 millimolar til røret og inkuber prøven ved 37 grader Celsius i 30 minutter med risting. La prøven avkjøles ved romtemperatur i 10 minutter før du tilsetter iodoacetamid til en endelig konsentrasjon på 40 millimolar og inkuberer ved romtemperatur i mørket i 30 minutter.Fortynn deretter prøven til under en-molar urea med en 50 millimolar ammoniumbikarbonatbuffer. Tilsett ett mikrogram trypsin for 50 mikrogram startprotein eller ved 1:50 trypsin til proteinforhold til prøven. Inkuber prøven over natten ved 37 grader Celsius med risting for å fordøye proteiner i peptider.Neste dag legger du til maursyre til 1% etter volum av prøven for å slukke protein fordøyelsen. For prøveopprydding plasserer du en avsugspatron med fast fase på en vakuummanifold ved hjelp av én ekstraksjonspatron for hver prøve, i henhold til produsentens retningslinjer. Etter ekstraksjonen fjerner du peptidprøvene fra vakuummanifolden og tørker dem helt i en vakuumkonsentrator.Tørking tar omtrent tre timer. For massespektrometri, eller MS-analyse, resuspender peptidprøven i en konsentrasjon på 400 nanogram per mikroliter i en 0,2% maursyrebuffer. For å resolubilisere peptidene, bland prøven i fem minutter.Deretter sonikerer du i fem minutter i en vannbadsonator. Deretter sentrifugerer du prøven for å pellet de uoppløselige materialene og overføre peptid supernatanter til MS-hetteglass. Send inn prøvene for den proteomiske analysen ved hjelp av flytende kromatografi tandem massespektrometri, eller LC-MS-MS.Bruk innstillingene som anbefales for umålt analyse av massespektrometrianlegget. Last prøvene på en analytisk kolonne med en strømningshastighet på 400 nanolitere per minutt for å unngå peptidene over en 90-minutters lineær gradient ved hjelp av en blanding av organiske og uorganiske løsningsmidler, med det organiske løsningsmidlet fra 5 til 35% Anskaffe massespektrometridata i dataavhengig modus, med en kontinuerlig syklus av MS1-undersøkelsesskanninger etterfulgt av 20 dataavhengige MS2-skanninger med HCD-fragmentering. Kvantifisere peptidtoppområdene for tunge og lette peptider i Proteome Quantitation programvareverktøy.Eksporter deretter de tunge og lette peptidtoppområdene. For beregning av halvering av protein, åpne SILAC-analysearbeidsboken til det første arket kalt Rådata og lim inn UniProt-IDene, gennavnene, tunge og lyse toppområdene i de angitte kolonnene. Deretter åpner du det fjerde arket med navnet Analyse og fjerner radene der kolonne G og H angir at eksemplet er utenfor området, og beholder rader som leses innenfor området.De senescent fenotypene ble validert ved hjelp av senescence-assosiert beta-galaktosidase aktivitet og RT-qPCR analyse. For beta-galactosidase-aktiviteten virket senescentcellene blå, mens quiescent kontrollcellene ikke hadde noen eller minimal farge. I RT-qPCR-analysen viste senescentcellene høyere interleukin-6, CXCL8 og CDKN1A-P21 mRNA sammenlignet med quiescentcellene.Omvendt var nivået av lamin B1-koding for spredningsmarkør lav eller fraværende i senescentcellene. De ekstraherte ionkromatogrammer av peptider avslørte den relative andelen tunge og lette peptidsignaler. En lavere andel tunge peptidsignaler i forhold til lette senescentceller indikerte en langsommere proteinomsetningshastighet, og et høyere tungt peptidsignal i forhold til lys indikerte en raskere proteinomsetningshastighet.De umerkede prøvene viste lite eller ingen tungt peptidsignal. Halveringstider for 695 proteiner identifisert fra massespektrometrianalysen ble beregnet. Halveringstiden rapporteres som et log-to-forhold mellom senescent over passive celler og plottet inn i en vulkanplott.Etter beregning av proteinomsetningshastigheter i senescentceller, kan nedstrømsanalyse avsløre kandidatbiologiske veier som reguleres av proteostasemekanismer. Puls SILAC banet vei for forskere å studere proteindynamikk med enestående granularitet og gjennomstrømning, slik at vi kan studere endringer i protein homeostase i mange individuelle proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Kapillær elektroforese-massespektrometri for Metabolsk profilering av biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Massespektrometri og Luminogenic baserte tilnærminger for å karakter Fase I Metabolsk kompetansen<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og tolke oksygen forbruk priser helt Fly hodet segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...