Name: measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) и Программой внутренних исследований (IRP), Национальным институтом по проблемам старения (NIA). N.B. был поддержан грантами Longevity Momentum и Программой стипендий Управления пищевых добавок (ODS). Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Авторы не раскрывают информацию.

pSILAC является мощным методом, который позволяет глобально количественно оценивать скорость оборота белка в нескольких клеточных условиях. В этой статье подробно описывается использование pSILAC для сравнения глобальных периодов полураспада белка между стареющими и покоящимися клетками, включая инструкции по подготовке стареющих и покоящихся клеток, маркировке и сбору SILAC и, в конечном счете, анализу с использованием масс-спектрометрии DDA. Кроме того, описан двухэтапный тест для валидации фенотипа старения с использованием анализа SA-βGal и RT-qPCR панели мРНК, кодирующих белки, связанные со старением. В дополнение к валидации старения с помощью двух описанных подходов, третья валидация старения может быть выполнена после масс-спектрометрического анализа путем поиска изменений в известных маркерах старения между стареющими и покоящимися клетками на протеомном уровне. Белки, ассоциированные со старением, которые, как ожидается, будут повышены, включают p16, p21 и BCL2, среди прочих, описанных в другом месте44,45. В описанном выше протоколе ионизирующее излучение использовалось для индукции старения и сывороточного голодания для покоящихся клеток. Для индукции старения существует несколько вариантов, и среди них существует существенная гетерогенность 41,42,46. В настоящее время не существует стареющего метода, который считается «наиболее физиологичным», поэтому выбор стареющего индуктора во многом основывается на контексте эксперимента. Однако в экспериментах с целью констатации общего явления о старении рекомендуется использовать как минимум два разных стареющих индуктора. Обсуждение диапазона парадигм старения выходит за рамки данной статьи, но некоторые распространенные методы индуцирования старения включают в себя запуск повреждения ДНК (IR, доксорубицин, репликативное истощение), экспрессию онкогенных белков (HRAS, BRAF) и нарушение функции митохондрий2.
В дополнение к выбору стареющего индуктора, выбор контрольных клеток является не менее важным соображением. Стареющие клетки, по определению, находятся под неопределенной остановкой роста, поэтому часто выбирают сравнение с другими клетками с остановкой роста. Для pSILAC клетки, арестованные клеточным циклом, как правило, предпочтительнее, поскольку они не реплицируются и, следовательно, их легче использовать для расчетов периода полураспада белка47. Однако, поскольку культивируемые клетки часто сохраняют некоторые делящиеся клетки, важно, чтобы методы, используемые для индуцирования остановки клеточного цикла, производили как можно более однородный ответ, чтобы свести к минимуму ошибку от клеток, которые все еще размножаются. Для расчета скорости деградации белка для циклических клеток с помощью pSILAC требуются дополнительные расчеты для компенсации скорости, с которой белок разбавляется в дочерние клетки27. Однако остановка покоя сама по себе не лишена осложнений. Существует два общих метода остановки клеточного цикла: сывороточная депривация и ингибирование контакта48. Не все клетки могут быть успокоены путем контактного ингибирования, хотя было показано, что некоторые фибробласты демонстрируют покой после нескольких дней культивирования49. Этот метод использовал сывороточную депривацию, потому что он чаще используется для сравнения стареющих клеток, хотя он требует, чтобы стареющая клетка была также лишена сыворотки для точных сравнений. Сыворотка активирует комплекс mTOR, и, таким образом, депривация сыворотки оказывает несколько последующих эффектов на клетку в дополнение к остановке клеточного цикла50. Примечательно, что стареющие клетки демонстрируют снижение SASP при депривации сыворотки или ингибировании mTOR51,52.
Еще один важный момент, который следует учитывать в pSILAC, - это количество временных точек для тестирования. Этот протокол собирал клетки в один момент времени (3 дня легкой или тяжелой маркировки), что существенно упрощает полученный анализ. Выбор временной точки должен основываться на цели эксперимента. Для глобального анализа ожидается, что 3 дня захватят большинство белков, хотя периоды полураспада для короткоживущих белков, которые полностью меняются в течение 3 дней (весь световой сигнал теряется), не могут быть измерены в этот момент времени. И наоборот, долгоживущие белки с очень небольшим оборотом за 3 дня также трудно поддаются количественной оценке и часто появляются как имеющие чрезвычайно большие периоды полураспада (порядка недель), которые, как правило, являются просто следствием очень небольшого накопления тяжелых сигналов. Из-за нелинейной зависимости в соотношении тяжелых и легких пептидных сигналов к проценту вновь синтезированного белка в более коротких и длинных временных точках количественное определение периодов полураспада может быть улучшено путем добавления дополнительных временных точек маркировки. Для относительных сравнений между двумя состояниями клеток, как в этом протоколе, приблизительного периода полураспада может быть достаточно, но дополнительные временные точки могут быть использованы для повышения количественной точности.
Этот протокол описывает, как выполнить нецелевой анализ оборота белка на основе DDA. Однако расчеты оборота белка могут быть применены в целом к любой схеме приобретения, которая способна вывести относительное изобилие тяжелых и легких пептидных пар. Например, методы на основе MS2, такие как независимый от данных сбор (DIA/SWATH), также могут быть применены для успешного расчета коэффициентов текучести кадров53. Кроме того, инструментальные и программные конвейеры, отличные от описанных в этом протоколе, могут использоваться для выполнения анализа DDA, идентификации белка и количественной оценки белка. При использовании программных платформ для количественной оценки белка, таких как Skyline, для извлечения пептидных пиковых областей, рекомендуется вручную проверять извлеченные ионные хроматограммы в рабочем пространстве документа, выявлять пики, которые были ошибочно интегрированы, и неколичественные пики и соответствующим образом курировать документ. Обширная коллекция учебных пособий доступна онлайн для Skyline (skyline.ms).
pSILAC представляет собой один из наиболее идеальных методов глобальной количественной оценки периодов полураспада белка в культивируемых клетках благодаря превосходному мультиплексированию (протеомному покрытию) и пропускной способности. В то время как pSILAC не обеспечивает прямых скоростей синтеза или деградации, поскольку изменение легкого и тяжелого сигнала происходит из-за слияния факторов, pSILAC очень полезен для сравнения условий и различных типов клеток. Низкопроизводительные методы часто делятся на два типа: 1) обработка клеток циклогексимидом для блокирования синтеза белка и сбора через промежутки времени после добавления для мониторинга распада или 2) обработка клеток ингибитором распада белка и сбор через промежутки времени после добавления для мониторинга накопления белка, таким образом, выводя скорость распада белка. Ограничение обоих методов заключается в том, что такие методы лечения неизбежно вызовут существенные изменения в клеточной физиологии. Напротив, pSILAC не требует существенного вмешательства и теоретически не оказывает обнаруживаемого влияния на клеточную физиологию, поскольку изотопные аминокислоты отличаются только одним нейтроном от своих неизотопных аналогов. Таким образом, метод, описанный здесь для pSILAC, представляет собой простой протокол для глобального измерения наиболее физиологических периодов полураспада белка в неделящихся клетках.
Изменения в обороте белка имеют тесную связь со старением, возрастными заболеваниями, нейродегенерацией и долголетием54,55. Этот протокол описывает метод опроса этих отношений с использованием стабильной изотопной маркировки аминокислот в клеточной культуре для измерения скорости оборота белка в клетках старения. Тем не менее, существует множество аналогичных методов для проведения исследований в контексте старения и нейродегенерации in vivo у целых организмов, таких как мыши. Действительно, эти исследования подчеркнули важность измерения показателей оборота белка в контексте возрастных заболеваний 56,57,58,59.
В этом исследовании рибосомные белки и белки, находящиеся в эндоплазматическом ретикулуме, выделялись как две категории белков с уменьшенным и увеличенным периодом полураспада в стареющих клетках соответственно. Хотя для окончательных выводов требуется дальнейший анализ стационарных уровней, эти результаты также свидетельствуют о том, что стареющие клетки могут однозначно регулировать трансляцию через уменьшение периодов полураспада рибосомных белков. В будущем применение подходов к маркировке стабильных изотопов для изучения взаимосвязи между клеточным старением и нейродегенерацией in vivo в мышиных моделях станет многообещающим расширением подхода к маркировке изотопов, описанного в этом протоколе.

Старение было впервые идентифицировано как состояние неопределенной остановки роста, проявляемой культивируемыми первичными клетками после достижения репликативного истощения1. С тех пор было показано, что старение может возникать в ответ на многочисленные клеточные нарушения, включая генотоксические, митохондриальные и онкогенные стрессы, среди прочих2. В то время как старение имеет несколько физиологически важных ролей, таких как подавление опухоли и заживление ран, накопление стареющих клеток во время старения связано с множеством вредных последствий для здоровья3, включая несколько нейродегенеративных состояний 4,5,6. Клеточное старение происходит в нескольких типах клеток мозга, включая нейроны 7,8,9,10, астроциты11, микроглию12 и предшественники олигодендроцитов13, и способствует нейродегенерации и когнитивной дисфункции. Было показано, что бета-амилоидные олигомеры, один из признаков болезни Альцгеймера14, ускоряют старение нейронов 13,15,16. Повышенная распространенность стареющих клеток также была связана с болезнью Паркинсона17, особенно возникающей из-за экологических стрессоров 11,18. Важно отметить, что селективная элиминация стареющих клеток в доклинических моделях продлевает продолжительность жизни и смягчает множество возрастных заболеваний 3,5,12 и улучшает когнитивный дефицит 8,11,12,13. Таким образом, стареющие клетки стали перспективными терапевтическими мишенями для лечения многих возрастных состояний.
Большая часть вредного эффекта стареющих клеток вызвана секреторным фенотипом, связанным со старением (SASP), сложной смесью биологически активных молекул, секретируемых стареющими клетками, которые могут вызвать местное воспаление, ангиогенез, разрушение внеклеточного матрикса и распространение старения в окружающих тканях 19,20,21 . SASP также представляет собой интересный биологический феномен старения, поскольку он требует значительных транскрипционных и трансляционных усилий во время остановки клеточного цикла. Фактически, было показано, что стареющие клетки демонстрируют снижение биогенеза рибосом 22,23,24, что должно снизить синтез белка. Вместо этого стареющие клетки надежно транслируют некоторые белки, в частности факторы SASP, и влияют на метаболизм окружающих тканей25. Таким образом, существует значительный интерес к пониманию того, как стареющие клетки, подвергающиеся остановке постоянного клеточного цикла, продолжают поддерживать белковый гомеостаз, в то же время надежно экспрессируя факторы SASP и другие избранные белки.
Этот метод описывает, как использовать масс-спектрометрию и импульсно-стабильную изотопную маркировку аминокислотами в клеточной культуре (pSILAC) для глобального измерения периодов полураспада белков в стареющих клетках в масштабе протеома. В традиционном SILAC культивируемые клетки полностью метаболически маркируются тяжелыми и легкими нерадиоактивными изотопами аминокислот для последующего анализа обилия белка. Этот метод ранее применялся для всесторонней и количественной оценки изменений численности в SASP культивируемых фибробластов26. В pSILAC клетки аналогичным образом метаболически мечуются импульсом тяжелого изотопа, который следует за предварительной маркировкой легким изотопом, а затем собирают через один или несколько временных интервалов. Скорость включения тяжелого изотопа по отношению к ранее существовавшему легкому изотопу затем используется для расчета относительных скоростей оборота белка. Как правило, изотопы аргинина и лизина используются, поскольку трипсин расщепляется на эти остатки; таким образом, все пептиды из стандартного пищеварения потенциально будут содержать тяжелую этикетку. Пары пептидов, которые отличаются только наличием или отсутствием тяжелого лизина или аргинина, химически идентичны и могут быть дифференцированы и количественно определены масс-спектрометром. После масс-спектрометрического анализа пептиды могут быть идентифицированы как вновь синтезированные или ранее существовавшие на основе наличия или отсутствия изотопной метки в полученных идентификациях пептидов. Затем скорость оборота белка может быть определена путем сопоставления соотношения тяжелых (13 C-15N) над легкими (12 C-14N) пептидами для данного белка кинетическим моделям экспоненциального роста или распада27,28. pSILAC использовался в нескольких сравнениях скоростей оборота белка 29,30,31,32 и в настоящее время является наиболее полным и высокопроизводительным методом измерения периодов полураспада белка.
Этот протокол детализирует подготовку стареющих клеток параллельно с аналогичными остановленными ростом покоящимися клетками в культуре с последующей метаболической маркировкой pSILAC. Затем клетки собирают, гомогенизируют в лизаты и обрабатывают для получения и анализа масс-спектрометрии. Данные, полученные в результате масс-спектрометрии, затем используются для определения периодов полураспада белка с использованием упрощенного количественного метода, использующего одну точку времени и расчеты периода полураспада, выполненные в электронной таблице. Используя этот подход, оценки периодов полураспада белка могут быть измерены всеобъемлющим и количественным образом, который более аутентичен для ненарушенных клеточных условий, чем протоколы, использующие блокаторы синтеза или оборота белка.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammacel 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td></td>
			<td>Cesium Irradiator for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-90 primary lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iRT Kit (indexed retention time)</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td>Indexed Retention Time Peptide Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>423835000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Mascot Daemon 2.8</td>
			<td>Proteomic database searching software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q Exactive HF Orbitrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>327110025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline</td>
			<td>University of Washington</td>
			<td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td>
			<td>Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator waterbath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-516R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Referred to as phenol in text; hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPle Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (sequencing grade)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry

Растущие данные показали, что накопление стареющих клеток в центральной нервной системе способствует нейродегенеративным расстройствам, таким как болезни Альцгеймера и Паркинсона. Клеточное старение — это состояние остановки постоянного клеточного цикла, которое обычно происходит в ответ на воздействие сублетальных стрессов. Однако, как и другие неделящиеся клетки, стареющие клетки остаются метаболически активными и выполняют множество функций, требующих уникальных транскрипционных и трансляционных требований и широко распространенных изменений во внутриклеточных и секретируемых протеомах. Понимание того, как синтез белка и скорость распада изменяются во время старения, может пролить свет на основные механизмы клеточного старения и найти потенциальные терапевтические пути для заболеваний, усугубляемых стареющими клетками. В данной работе описан метод протеомной оценки периодов полураспада белка в неделящихся клетках с использованием импульсной метки стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре (pSILAC) в сочетании с масс-спектрометрией. pSILAC включает метаболическую маркировку клеток стабильными тяжелыми изотопсодержащими версиями аминокислот. В сочетании с современными подходами масс-спектрометрии pSILAC позволяет измерять оборот белков сотен или тысяч белков в сложных смесях. После метаболической маркировки динамику оборота белков можно определить на основе относительного обогащения тяжелых изотопов в пептидах, обнаруженных масс-спектрометрией. В этом протоколе описан рабочий процесс для генерации стареющих культур фибробластов и аналогично арестованных покоящихся фибробластов, а также упрощенный, одноточечный тайм-курс маркировки pSILAC, который максимизирует охват ожидаемых скоростей оборота белка. Далее представлен конвейер для анализа данных масс-спектрометрии pSILAC и удобного для пользователя расчета скорости деградации белка с использованием электронных таблиц. Применение этого протокола может быть распространено за пределы стареющих клеток на любые неделящиеся культивируемые клетки, такие как нейроны.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Этот протокол описывает рабочий процесс метаболической маркировки стареющих и неделящихся клеток с помощью импульсного SILAC, нецелевого масс-спектрометрического анализа и упрощенного расчета периодов полураспада белка.

Измерение скорости оборота белка в стареющих и неделящихся культивируемых клетках с помощью метаболической маркировки и масс-спектрометрии

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Как клетки поддерживают белковый гомеостаз, не совсем понятно в контексте клеточного стресса и старения. В этом протоколе мы предоставляем простой и точный способ расчета оборота белка, который является ключевым компонентом гомеостаза белка в живых клетках. Pulse SILAC дает экспериментатору возможность измерять оборот белка для отдельных белков и всего протеома с высокой пропускной способностью, которая также более аутентична для биологических систем, чем другие методы.Принципы этого метода могут быть применены к любой системе, которая может быть метаболически маркирована, включая целые организмы. Этот метод также может привести к пониманию клеточного старения, старения и нейродегенеративных заболеваний. Масс-спектрометрический анализ очень чувствителен к определенным химическим загрязнителям, таким как моющие средства.Используйте реагенты класса LC-MS на протяжении всей этой процедуры, чтобы обеспечить высококачественный сбор данных. Чтобы начать метаболическую маркировку клеток, замените среду для трех пластин каждой из стареющих и покоящихся клеток 30 миллилитрами среды SILAC Light. Отдельно замените среду для трех стареющих и трех покоящихся пластин на 30 миллилитров SILAC Heavy.Выращивайте клетки в течение трех дней без изменения среды. Чтобы отделить клетки от культуральных пластин, добавьте пять миллилитров предварительно разогретого трипсинового реагента в каждую пластину и инкубируйте пластины в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. Позже повторно суспендируют отсоединенные клетки в пяти миллилитрах той же среды, используемой для культивирования, до общего объема 10 миллилитров.Затем перенесите клетки на лед и центрифугируйте клетки в 300 раз G при четырех градусах Цельсия. После промывки гранулы дважды, снова раскрутите клетки и удалите супернатант перед повторным использованием гранулы в 150 микролитрах свежеприготовленной восьмимолярной мочевины и 50-миллимолярного буфера лизиса бикарбоната аммония. Перемешайте содержимое трубки путем пипетки вверх и вниз.Aliquot 50 мкг образца белка попадает в новую пробирку и доводит образцы до равных объемов с буфером лизиса. Затем добавляют дитиотрейтол до конечной концентрации 20-миллимолярной в пробирку и инкубируют образец при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут с встряхиванием. Дайте образцу остыть при комнатной температуре в течение 10 минут, прежде чем добавить йодоацетамид до конечной концентрации 40-миллимоляра и инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.Затем разбавляют образец до уровня ниже одномолярной мочевины с 50-миллимолярным буфером бикарбоната аммония. Добавьте один микрограмм трипсина на 50 микрограммов исходного белка или при соотношении трипсина к белку 1:50 к образцу. Инкубируйте образец в течение ночи при 37 градусах Цельсия с встряхиванием, чтобы переварить белки в пептиды.На следующий день добавьте муравьиную кислоту до 1% от объема образца, чтобы погасить переваривание белка. Для очистки образца поместите твердофазный экстракционный картридж на вакуумный коллектор, используя один экстракционный картридж для каждого образца, в соответствии с рекомендациями производителя. После экстракции извлеките образцы пептидов из вакуумного коллектора и полностью высушите их в вакуумном концентраторе.Сушка занимает около трех часов. Для масс-спектрометрии или анализа MS повторно суспендируют образец пептида в концентрации 400 нанограммов на микролитр в буфере 0,2% муравьиной кислоты. Чтобы повторно растворить пептиды, перемешайте образец в течение пяти минут.Затем в течение пяти минут настаивайте ультразвуком на водяной бане. Затем центрифугируйте образец, чтобы гранулировать нерастворимые материалы и перенести пептидные супернатанты во флаконы MS. Отправьте образцы для протеомного анализа с использованием жидкостной хроматографической тандемной масс-спектрометрии, или LC-MS-MS.Используйте настройки, рекомендованные для нецелевого анализа масс-спектрометрией. Загрузите образцы в аналитическую колонну со скоростью потока 400 нанолитров в минуту для элюирования пептидов в течение 90-минутного линейного градиента с использованием смеси органических и неорганических растворителей, причем органический растворитель колеблется от 5 до 35% Получение данных масс-спектрометрических данных в режиме, зависящем от данных, с непрерывным циклом сканирования MS1 с последующим 20 зависящими от данных сканирования MS2 с фрагментацией HCD. Количественная оценка пиковых областей пептидов для тяжелых и легких пептидов в программном инструменте Proteome Quantitation.Затем экспортируйте тяжелые и легкие пептидные пиковые области. Для расчета периодов полураспада белка откройте книгу анализа SILAC на первом листе под названием Raw Data и вставьте идентификаторы UniProt, названия генов, тяжелые и легкие пиковые области в указанные столбцы. Затем откройте четвертый лист с именем Analysis и удалите строки, в которых столбцы G и H указывают, что образец находится вне диапазона, и сохраните строки, которые читаются в пределах диапазона.Фенотипы старения были подтверждены с использованием активности бета-галактозидазы, связанной со старением, и анализа RT-qPCR. Для активности бета-галактозидазы стареющие клетки казались синими, в то время как покоящиеся контрольные клетки не имели или имели минимальный цвет. В анализе RT-qPCR стареющие клетки показали более высокие мРНК интерлейкина-6, CXCL8 и CDKN1A-P21 по сравнению с покоящимися клетками.И наоборот, уровень ламина B1, кодирующего маркер пролиферации, был низким или отсутствовал в стареющих клетках. Извлеченные ионные хроматограммы пептидов выявили относительную пропорцию тяжелых и легких пептидных сигналов. Более низкая доля тяжелых пептидных сигналов по сравнению с легкими стареющими клетками указывала на более медленную скорость оборота белка, а более высокий тяжелый пептидный сигнал по сравнению со светом указывал на более высокую скорость оборота белка.Немаркированные образцы показали мало или вообще не показали тяжелый пептидный сигнал. Были рассчитаны периоды полураспада для 695 белков, идентифицированных в результате масс-спектрометрического анализа. Период полураспада сообщается как логарифмическое отношение стареющих над покоящимися клетками и строится на графике вулкана.После расчета скорости оборота белка в стареющих клетках последующий анализ может выявить потенциальные биологические пути, которые регулируются механизмами протеостаза. Pulse SILAC проложил путь для исследователей к изучению динамики белка с беспрецедентной зернистостью и пропускной способностью, что позволило нам изучить изменения в гомеостазе белка во многих отдельных белках.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Масс-спектрометрия и люминогенные подходы, основанные на Охарактеризуйте Фазу I метаболических компетентности в<em&gt; In Vitro</em&gt; Клеточные культуры

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Измерение и интерпретации показателей потребления кислорода в целом летать головы сегментов

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...