Name: measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) och Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). OBS stöddes av Longevity Impetus Grants och Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Figur 1 skapades med BioRender.com.

Författarna har inga avslöjanden.

pSILAC är en kraftfull teknik som möjliggör global kvantifiering av proteinomsättningshastigheter över flera cellulära förhållanden. Detta dokument beskriver användningen av pSILAC för att jämföra globala proteinhalveringstider mellan senescenta och vilande celler, inklusive instruktioner för beredning av senescenta och vilande celler, SILAC-märkning och skörd och slutligen analys med DDA-masspektrometri. Dessutom beskrivs ett tvåstegstest för validering av senescensfenotypen med användning av SA-βGal- och RT-qPCR-analys av en panel av mRNA som kodar för senescensassocierade proteiner. Förutom validering av åldrande med de två beskrivna metoderna kan en tredje validering av senescens utföras efter masspektrometrianalys genom att leta efter förändringar i kända senescensmarkörer mellan senescenta och vilande celler på proteomisk nivå. Senescensassocierade proteiner som förväntas vara förhöjda inkluderar bland annat p16, p21 och BCL2, som beskrivs någon annanstans44,45. I protokollet som beskrivits ovan användes joniserande strålning för induktion av åldrande och serumsvält för vilande celler. För induktion av åldrande finns det flera alternativ tillgängliga och det finns betydande heterogenitet bland dem 41,42,46. För närvarande finns det ingen senescent metod som anses vara den "mest fysiologiska", så valet av senescent inducerare är till stor del baserat på experimentets sammanhang. Experiment med målet att ange ett allmänt fenomen om senescens rekommenderas dock att använda minst två olika senescenta inducerare. Att diskutera utbudet av senescensparadigmer ligger utanför ramen för detta papper, men några vanliga metoder för att inducera åldrande inkluderar att utlösa DNA-skador (IR, doxorubicin, replikativ utmattning), uttrycka onkogena proteiner (HRAS, BRAF) och störa mitokondriernas funktion2.
Förutom valet av senescent inducerare är valet av kontrollceller ett lika viktigt övervägande. Senescenta celler är per definition under obestämd tillväxtstopp, så en jämförelse med andra tillväxtstoppade celler väljs ofta. För pSILAC är cellcykelarresterade celler i allmänhet att föredra eftersom de inte replikerar och därmed är lättare att använda för beräkningar av proteinhalveringstiden47. Men eftersom odlade celler ofta behåller vissa delande celler är det viktigt att de metoder som används för att inducera cellcykelstopp ger ett så homogent svar som möjligt för att minimera fel från celler som fortfarande förökar sig. För att beräkna proteinnedbrytningshastigheter för cykelceller med pSILAC krävs ytterligare beräkningar för att kompensera för den hastighet med vilken protein späds ut i dotterceller27. Vilande tillväxtstopp i sig är emellertid inte utan komplikationer. Det finns två allmänna metoder för cellcykelstopp: serumbrist och kontakthämning48. Inte alla celler kan göras vilande genom kontakthämning, även om vissa fibroblaster har visat sig visa lugn efter flera dagars odling49. Denna metod använde serumbrist eftersom den oftare används för jämförelser av senescenta celler, även om det kräver att den senescenta cellen på samma sätt serumberövas för exakta jämförelser. Serum aktiverar mTOR-komplexet, och därmed har serumbrist flera nedströms effekter på cellen utöver cellcykelstopp50. I synnerhet har senescenta celler visat sig uppvisa en minskad SASP vid serumbrist eller mTOR-hämning51,52.
En annan viktig punkt att tänka på i pSILAC är hur många tidpunkter som ska testas. Detta protokoll samlade celler vid en enda tidpunkt (3 dagars lätt eller tung märkning), vilket väsentligt förenklar den resulterande analysen. Valet av tidpunkt bör baseras på experimentets mål. För global analys förväntas 3 dagar fånga en majoritet av proteinerna, men halveringstider för kortlivade proteiner som helt omsätter inom 3 dagar (all ljussignal går förlorad) kan inte mätas vid denna tidpunkt. Omvänt är långlivade proteiner med mycket liten omsättning på 3 dagar också svåra att kvantifiera och verkar ofta ha extremt stora halveringstider (i veckors ordning) som vanligtvis bara är en följd av mycket liten tung signalackumulering. På grund av det icke-linjära förhållandet i förhållandet mellan tunga och lätta peptidsignaler jämfört med andelen nysyntetiserat protein vid kortare och längre tidpunkter kan kvantitationen av halveringstider förbättras genom att lägga till ytterligare märkningstidpunkter. För relativa jämförelser mellan två celltillstånd, som i detta protokoll, kan en ungefärlig halveringstid vara tillräcklig, men ytterligare tidpunkter kan användas för att förbättra kvantitativ noggrannhet.
Detta protokoll beskriver hur man utför en oriktad DDA-baserad analys av proteinomsättning. Beräkningarna av proteinomsättningen kan emellertid tillämpas generellt på alla förvärvsscheman som kan härleda det relativa överflödet av tunga och lätta peptidpar. Exempelvis kan MS2-baserade metoder såsom dataoberoende förvärv (DIA/SWATH) också tillämpas för beräkning av omsättningshastigheter framgångsrikt53. Dessutom kan andra instrumenterings- och programvarupipelines än de som beskrivs i detta protokoll användas för att utföra DDA-analys, proteinidentifiering och proteinkvantifiering. När du använder programvaruplattformar för proteinkvantifiering som Skyline för att extrahera peptidtoppområden är det lämpligt att manuellt inspektera extraherade jonkromatogram i dokumentarbetsytan, identifiera toppar som felaktigt integrerades och icke-kvantitativa toppar och kurera dokumentet i enlighet därmed. En omfattande samling självstudier finns tillgängliga online för Skyline (skyline.ms).
pSILAC representerar en av de mest idealiska metoderna för global kvantifiering av proteinhalveringstider i odlade celler på grund av överlägsen multiplexering (proteomtäckning) och genomströmning. Medan pSILAC inte ger direkta syntes- eller nedbrytningshastigheter, eftersom förändringen i lätt och tung signal beror på ett sammanflöde av faktorer, är pSILAC mycket användbart för jämförelser mellan förhållanden och olika celltyper. Metoder med låg genomströmning faller ofta i två typer: 1) behandling av celler med cykloheximid för att blockera proteinsyntes och skörda med tidsintervall efter tillsats för att övervaka sönderfall, eller 2) behandling av celler med en hämmare av proteinförfall och skörd vid tidsintervall efter tillsats för att övervaka ackumuleringen av protein, vilket härleder proteinförfallshastigheter. Begränsningen av båda metoderna är att sådana behandlingar oundvikligen kommer att orsaka betydande förändringar i cellulär fysiologi. Däremot kräver pSILAC ingen väsentlig intervention och har teoretiskt inga detekterbara effekter på cellulär fysiologi eftersom isotopaminosyror skiljer sig med endast en enda neutron från sina icke-isotopiska motsvarigheter. Således representerar metoden som beskrivs här för pSILAC ett enkelt protokoll för global mätning av de mest fysiologiska proteinhalveringstiderna i icke-delande celler.
Förändringar i proteinomsättningen har ett nära samband med åldrande, åldersrelaterade sjukdomar, neurodegeneration och livslängd 54,55. Detta protokoll beskriver en metod för att förhöra dessa relationer genom att använda stabil isotopmärkning av aminosyror i cellodling för att mäta proteinomsättningshastigheter i senescensceller. Det finns emellertid många analoga metoder för att utföra studier i samband med åldrande och neurodegeneration in vivo i hela organismer som möss. Faktum är att dessa studier har betonat vikten av att mäta proteinomsättningshastigheter i samband med åldersrelaterade sjukdomar 56,57,58,59.
I denna studie stod ribosomala proteiner och proteiner som finns i endoplasmatisk retikulum ut som två kategorier av proteiner med minskade respektive ökade halveringstider i senescenta celler. Medan ytterligare analys av steady-state-nivåer krävs för definitiva slutsatser, tyder dessa resultat vidare på att senescenta celler unikt kan reglera översättning genom minskade halveringstider för ribosomala proteiner. Framöver kommer tillämpning av stabila isotopmärkningsmetoder för att studera förhållandet mellan cellulär senescens och neurodegeneration in vivo i musmodeller att vara en lovande förlängning av isotopmärkningsmetoden som beskrivs av detta protokoll.

Senescens identifierades först som ett tillstånd av obestämd tillväxtstopp som uppvisades av odlade primära celler efter att ha nått replikativ utmattning1. Det har sedan dess visat sig att senescens kan uppstå som svar på många cellulära förolämpningar, inklusive genotoxiska, mitokondriella och onkogena påfrestningar, bland andra2. Medan senescens har flera fysiologiskt viktiga roller, såsom tumörundertryckning och sårläkning, är ackumuleringen av senescenta celler under åldrandet associerad med en mängd skadliga effekter på hälsan3, inklusive flera neurodegenerativa tillstånd 4,5,6. Cellulär senescens förekommer i flera hjärncelltyper, inklusive neuroner 7,8,9,10, astrocyter11, mikroglia12 och oligodendrocytprekursorer13, och bidrar till neurodegeneration och kognitiv dysfunktion. Amyloid beta-oligomerer, ett av kännetecknen för Alzheimers sjukdom14, har visat sig påskynda neuronal senescens 13,15,16. En ökad förekomst av senescenta celler har också associerats med Parkinsons sjukdom17, särskilt till följd av miljöstressorer11,18. Viktigt är att den selektiva elimineringen av senescenta celler i prekliniska modeller förlänger livslängden och mildrar en mängd åldersrelaterade sjukdomar 3,5,12 och förbättrar kognitiva underskott 8,11,12,13. Senescenta celler har således framträtt som lovande terapeutiska mål för behandling av många åldersrelaterade tillstånd.
Mycket av den skadliga effekten av senescenta celler orsakas av den senescensassocierade sekretoriska fenotypen (SASP), en komplex blandning av bioaktiva molekyler utsöndrade av senescenta celler som kan orsaka lokal inflammation, angiogenes, förstörelse av den extracellulära matrisen och förökning av åldrande i omgivande vävnad 19,20,21 . SASP representerar också ett intressant biologiskt fenomen av senescens eftersom det kräver en betydande transkriptionell och translationell ansträngning under ett tillstånd av cellcykelstopp. Faktum är att senescenta celler har visat sig uppvisa minskningar i ribosobiogenes 22,23,24 som bör minska proteinsyntesen. Istället översätter senescenta celler robust vissa proteiner, särskilt SASP-faktorer, och påverkar metabolismen av omgivande vävnad25. Således finns det ett stort intresse för att förstå hur senescenta celler som genomgår ett permanent cellcykelstopp fortsätter att upprätthålla proteinhomeostas samtidigt som de robust uttrycker SASP-faktorer och andra utvalda proteiner.
Denna metod beskriver hur man använder masspektrometri och pulserad stabil isotopmärkning av aminosyror i cellodling (pSILAC) för att globalt mäta halveringstiderna för proteiner i senescenta celler i proteomomfattande skala. I traditionell SILAC är odlade celler helt metaboliskt märkta med tunga och lätta icke-radioaktiva isotoper av aminosyror för nedströms analys av proteinöverflöd. Denna metod har tidigare tillämpats för att bedöma förändringar i överflöd på ett omfattande och kvantitativt sätt i SASP för odlade fibroblaster26. I pSILAC är celler på samma sätt metaboliskt märkta med en puls av tung isotop som följer förmärkning med lätt isotop och skördas sedan med ett eller flera tidsintervaller. Inkorporeringshastigheterna för tung isotop med hänvisning till befintlig ljusisotop används sedan för att beräkna relativa proteinomsättningshastigheter. I allmänhet används isotoper av arginin och lysin eftersom trypsin klyver vid dessa rester; således kommer alla peptider från standard matsmältning potentiellt att innehålla den tunga etiketten. Par av peptider som endast skiljer sig åt genom närvaron eller frånvaron av tungt lysin eller arginin är kemiskt identiska och kan differentieras och kvantifieras med en masspektrometer. Efter masspektrometrianalys kan peptider identifieras som nysyntetiserade eller redan existerande baserat på närvaron eller frånvaron av isotopetiketten i de resulterande peptididentifieringarna. Proteinomsättningshastigheter kan sedan bestämmas genom att anpassa förhållandet mellan tunga (13 C-15N) över lätta (12 C-14N) peptider för ett givet protein till kinetiska modeller för exponentiell tillväxt eller sönderfall27,28. pSILAC har använts i flera jämförelser av proteinomsättningshastigheter 29,30,31,32 och är för närvarande den mest omfattande metoden med hög genomströmning för mätning av proteinhalveringstider.
Detta protokoll beskriver beredningen av senescenta celler parallellt med liknande tillväxtstoppade vilande celler i odling, följt av metabolisk märkning med pSILAC. Celler skördas sedan, homogeniseras till lysater och bearbetas för förvärv och analys av masspektrometri. Data som erhålls från masspektrometri används sedan för att bestämma proteinhalveringstider med hjälp av en förenklad kvantitativ metod som använder en enda tidpunkt och halveringstidsberäkningar utförda i ett kalkylblad. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan uppskattningar av proteinhalveringstider mätas på ett omfattande och kvantitativt sätt som är mer autentiskt för ostörda cellulära förhållanden än protokoll som använder blockerare av proteinsyntes eller omsättning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammacel 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td></td>
			<td>Cesium Irradiator for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-90 primary lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iRT Kit (indexed retention time)</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td>Indexed Retention Time Peptide Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>423835000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Mascot Daemon 2.8</td>
			<td>Proteomic database searching software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q Exactive HF Orbitrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>327110025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline</td>
			<td>University of Washington</td>
			<td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td>
			<td>Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator waterbath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-516R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Referred to as phenol in text; hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPle Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (sequencing grade)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry

Monteringsbevis har visat att ackumuleringen av senescenta celler i centrala nervsystemet bidrar till neurodegenerativa störningar som Alzheimers och Parkinsons sjukdomar. Cellulär senescens är ett tillstånd av permanent cellcykelstopp som vanligtvis uppstår som svar på exponering för subletala påfrestningar. Liksom andra icke-delande celler förblir emellertid senescenta celler metaboliskt aktiva och utför många funktioner som kräver unika transkriptions- och translationella krav och utbredda förändringar i de intracellulära och utsöndrade proteomerna. Att förstå hur proteinsyntes och sönderfallshastigheter förändras under senescens kan belysa de underliggande mekanismerna för cellulär senescens och hitta potentiella terapeutiska vägar för sjukdomar som förvärras av senescenta celler. Denna uppsats beskriver en metod för proteomskala utvärdering av proteinhalveringstider i icke-delande celler med hjälp av pulserad stabil isotopmärkning av aminosyror i cellodling (pSILAC) i kombination med masspektrometri. pSILAC involverar metabolisk märkning av celler med stabila tunga isotophaltiga versioner av aminosyror. Tillsammans med moderna masspektrometrimetoder möjliggör pSILAC mätning av proteinomsättning av hundratals eller tusentals proteiner i komplexa blandningar. Efter metabolisk märkning kan omsättningsdynamiken hos proteiner bestämmas baserat på den relativa anrikningen av tunga isotoper i peptider detekterade genom masspektrometri. I detta protokoll beskrivs ett arbetsflöde för generering av senescenta fibroblastkulturer och liknande arresterade vilande fibroblaster, liksom en förenklad, engångspunkt pSILAC-märkningstidskurs som maximerar täckningen av förväntade proteinomsättningshastigheter. Vidare presenteras en pipeline för analys av pSILAC-masspektrometridata och användarvänlig beräkning av proteinnedbrytningshastigheter med hjälp av kalkylblad. Tillämpningen av detta protokoll kan utvidgas bortom senescenta celler till alla icke-delande odlade celler såsom neuroner.

Detta protokoll beskriver en metod för att globalt jämföra proteinhalveringstider mellan senescenta och icke-delande, vilande kontrollceller med hjälp av pSILAC och minimala tidpunkter. Detta protokoll beskriver generering av senescenta och vilande celler i odling, metabolisk märkning av celler med stabila isotoper av arginin och lysin under 3 dagar, kvantifiering av de relativa överflöden av tunga och lätta peptidisotoper genom masspektrometri och en enkel och tillgänglig beräkning av proteinhalveringstider med hjälp av kalkylarkformler (Figur 1). Denna metod är mycket flexibel och kan anpassas till många celltyper och förhållanden.
Som en del av genereringen av senescenta celler för detta protokoll används två metoder för senescensvalidering: SA-βGal-positiva celler visualiserade med mikroskopi och ökade nivåer av senescenta markörer kvantifierade med hjälp av RT-qPCR-analys. Mätningen av senescenta markörer bör ge tydliga skillnader mellan vilande och senescenta celler för att jämförelser av de två cellpopulationerna ska anses vara giltiga. För SA-βGal-aktivitet bör senescenta celler visas blå medan vilande kontrollceller har ingen eller mycket liten färg (figur 2A). Denna analys kan kvantifieras genom att räkna de positiva, blåfärgade cellerna som en procentandel av det totala antalet celler och sedan jämföra den procentuella positivitetsgraden mellan vilande kontroll och senescenta celler. Det är viktigt att detta protokoll utförs samtidigt för jämförelse av båda celltillstånden; SA-βGal-aktiviteten är beroende av färglösningens pH, så resultaten kan variera väsentligt mellan analyserna och bör betraktas som ett kvalitativt mått.
RT-qPCR-analysen av senescenta markörer kommer att visa höga nivåer av de mRNA som kodar för SASP-faktorer (IL6, CXCL8, IL1B) och cellcykelhämmarna (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) i de flesta senescenta modeller. Även om viss variation förväntas baserat på celltyp, odlingstillstånd och senescent inducerare 41,42, visar de flesta senescenta celler större än fem gånger högre nivåer av IL6, CXCL8 och CDKN1A / p21 mRNA jämfört med vilande kontrollceller; Omvänt bör nivåerna av LMNB1- och PCNA-mRNA, som kodar för proliferationsmarkörer, vara låga eller frånvarande i senescenta celler jämfört med vilande celler (figur 2B). Sammantaget är en signifikant procentandel av SA-βGal-positivitet och det förväntade uttrycket av en panel av senescensassocierade mRNA-markörer tillräckliga för att bekräfta induktionen av senescens i ett experiment.
Bearbetning av proteinprover för masspektrometrianalys består av matsmältning i lösningen (2 dagar) och extraktion i fast fas (4-6 timmar). För att utföra oriktad proteomisk analys skickas de resulterande peptiderna in för LC-MS/MS-analys med hjälp av databeroende förvärv (DDA). På Orbitrap-instrument kan en DDA-metod specificeras i redigeraren för masspektrometriinstrumentets programvarumetod. De masspektrometerinställningar som används i denna studie visas i figur 3A. Vätskekromatografiinställningar kan också anges i metodredigeraren. För denna studie användes en 90 min linjär gradient med ökande organisk fas (acetonitril) (figur 3B). Efter ett lyckat förvärv bör den totala jonströmmen (TIC) innehålla en intensiv signal under den linjära gradientdelen av metoden (figur 3C). Detta protokoll beskriver ett exempelprotokoll på ett Orbitrap-instrument, men beräkningen av proteinhalveringstider kan utföras på data som erhållits från vilken masspektrometer som helst som samlades in i DDA-läge, vilket är tillgängligt på flera typer av instrument (t.ex. Orbitraps och time-of-flight-instrument) och leverantörer. Förvärvsinställningarna kommer att vara unika för typen och konfigurationen av det instrument som används, och det rekommenderas att använda de inställningar som föreslås av masspektrometrianläggningen. Denna metod är också kompatibel med icke-DDA-metoder (SRM, PRM, DIA), så länge kvantitativa kromatografiska toppområden för tunga och lätta toppar kan extraheras från rådatafilerna och skrivas in i kalkylbladsformlerna.
Råa masspektrometrifiler söks med ett av de många tillgängliga proteomiska databassökningsverktygen för att identifiera peptider och proteiner. Till exempel använde denna studie sökmotorn Mascot43. För att erhålla kromatografiska toppområden för kvantifiering av tunga och lätta peptider importeras databassökresultat till en proteomisk programvara som kan kromatografiska toppområden som Skyline39,40. Undersökning av de extraherade jonkromatogrammen av peptider (figur 4) kommer att avslöja den relativa andelen tunga och lätta peptidsignaler. En lägre andel tung peptidsignal i förhållande till ljuspeptidsignal i senescenta celler indikerar en långsammare proteinomsättningshastighet (figur 4A), och en högre tung peptidsignal i förhållande till ljus indikerar en snabbare proteinomsättningshastighet (Figur 4B). De omärkta proverna ska visa liten eller ingen tung peptidsignal. Varje uppenbar tung peptidsignal i de omärkta proverna betraktas som bakgrundsbrus och kommer att subtraheras under de slutliga beräkningarna. Kvantifiering av kromatografiska toppområden för lätta och tunga peptider för alla behandlings- och märkningsförhållanden måste exporteras för efterföljande beräkning av proteinomsättningshastigheter och statistisk analys.
Genom att använda enstaka tidspunktsanalys är kvantifieringen av proteinhalvätningstider enkel att utföra och kan göras bekvämt i kalkylblad. I tabell 3 beräknades halveringstider för 695 proteiner som identifierats från masspektrometrianalysen. Med utgångspunkt från proteinnivå tunga och lätta isotopöverflöd för varje protein i proverna (ingång för 1) Rådatablad ) beräknas sedan en procent tung isotop (benämnt Ratio, R) automatiskt på arket med titeln 2) Förhållande H | H + L. I detta steg normaliseras R från tunga märkta prover genom att subtrahera R från omärkta prover för att producera en slutlig R för de vilande och senescerande trelikaten. Eftersom omärkta prover inte bör ha någon exogent tillsatt tung isotop, används de för att eliminera bakgrundssignalen. Från R beräknas kdeg (omsättningshastighet) med följande formel:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
Halveringstiden (H, i dagar) bestäms för varje protein i den vilande kontrollen och senescenta trelikat (blad med titeln 3) Halveringstid (dagar)) med användning av följande formel:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
Dessa halveringstider är sedan i genomsnitt bland de vilande och senescenta tre exemplaren för att generera en vilande och senescent genomsnittlig halveringstid för varje protein samt ett p-värde. Beräknade halveringstider filtreras sedan för värden som är negativa, vilket inträffar när den tunga signalen från ljusmärkta celler (bakgrunden) är större än den tunga signalen från tungmärkta celler. Denna filtrering resulterade i 707 proteiner från 841 identifierade med giltiga halveringstider för de resultat som presenteras här.
Halveringstiden rapporteras sedan som ett log2-förhållande av senescent över vilande kontrollceller (log2FC) och plottas i ett vulkandiagram (figur 5). Genom att titta på analysbladet 5) kan till exempel koagulation II-trombinreceptorproteinet (F2R) ses ha en halveringstid i vilande celler på 0,51 dagar (kolumn B) och en halveringstid i senescenta celler på 1,07 dagar (kolumn C) som gav en logg2FC på ~ 1,06 (kolumn D) med ett p-värde på 0,001.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> Figur 1: Diagram över pSILAC-arbetsflöde för senescenta och vilande kontrollceller. Humana IMR-90-fibroblaster användes för att bereda vilande (lågserum) eller senescenta (IR) cellkulturer för jämförelse av proteinhalveringstider. Cellerna märktes sedan med SILAC Light eller SILAC Heavy media med isotoparginin och lysin i 3 dagar. Lysater extraherades från celler, smältes, avsaltades och analyserades med hjälp av masspektrometri. Tunga och lätta peptidisotoptoppar motsvarar nyligen syntetiserade respektive befintliga peptider. Halveringstider beräknades med hjälp av en ekvation för exponentiellt sönderfall. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> Figur 2: Validering av senescenta fenotyper med hjälp av SA-βGal- och RT-qPCR-analyser. (A) Senescenta och vilande celler ompläteras vid skördetillgången till en 6-brunnsplatta och färgas för SA-βGal med hjälp av SA-βGal-färgningssatsen. Blå färg i cellkroppen är positiv för senescens. Bilderna är tagna i ljusfält med färg vid 10x förstoring, storleksmarkör i rött. (B) RT-qPCR-analys som jämför senescenta celler (röda) och cykelceller (grå) från ett orelaterat experiment. Ökningar av nivåerna av CDKN1A / p21, CXCL8 och IL6 mRNA är en indikation på åldrande, liksom minskningen av LMNB1 mRNA-nivåer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> Figur 3: Representativa metoder för databeroende förvärvsskanningar (DDA) och vätskekromatografigradient av pSILAC-kulturer på Q-Exactive HF orbitrap masspektrometer. (A) Rekommenderade instrumentinställningar i instrumentprogramvaran för databeroende analys av helcellslysat från ett pSILAC-experiment. (B) Exempel på inställningar för flödesgradientmetod för vätskekromatografi. Peptider elueras över en 90-minuters linjär gradient som sträcker sig från 5% till 35% buffert B (0,2% myrsyra och 99,8% acetonitril), följt av en 10 min tvätt med 80% buffert B och 25 min jämvikt med 5% buffert B. (C) Ett representativt totalt jonkromatogram (TIC) av ett masspektrometriförvärv av IMR-90 fibroblastpeptider förvärvade med de angivna inställningarna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> Figur 4: Representativa extraherade jonkromatogram av peptider med förändrad omsättning under senescens. (A) Kromatografiska toppområden av peptiden FQMTQEVVCDECPNVK++ från proteinet DnaJ homolog underfamilj B-medlem 11 (DNAJB11) i senescenta och icke-senescenta celler. Efter 3 dagars SILAC införlivar senescenta celler mindre tung isotop i denna peptid jämfört med vilande (icke-senescenta) celler, vilket indikeras av en minskning av topparean av tung isotopinnehållande peptid (blå) i förhållande till ljuspeptiden (röd), vilket indikerar att denna peptid har minskad omsättning i senescenta celler. (B) Kromatografiska toppområden av peptiden VQAQVIQETIVPK++ från proteinet Splicing Factor 3a Subunit 1 (SF3A1) i senescenta och icke-senescenta celler. Efter 3 dagars SILAC införlivar senescenta celler en högre andel tung isotop i denna peptid jämfört med vilande (icke-senescenta) celler, vilket indikeras av en minskning av topparean av tung isotopinnehållande peptid (blå) i förhållande till ljuspeptiden (röd), vilket indikerar att denna peptid har ökad omsättning i senescenta celler. De omärkta (dag 0) förhållandena visar ingen inkorporering av tung isotop för båda peptiderna, som förväntat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> Figur 5: Jämförelse av proteinhalveringstider i senescenta och vilande celler bestämda från pSILAC-märkning. (A) Vulkandiagram som visar log2-förhållandet mellan senescent / kontroll (vilande) för vart och ett av de 695 identifierade proteinerna; i detta experiment innehöll lätta och tunga märkningsmedier ingen glukos och ingen fenolröd. (B) Tabeller som visar de 10 mest proteiner som har flest ökade eller minskade halveringstider i vilande celler jämfört med senescenta celler (vänster respektive höger). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Tabell 1: Media och buffertar som används i detta protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 2: RT-qPCR-primers som används i detta protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 3: Silac-analysarbetsbok för beräkning av proteinhalveringstider, vikförändringar och t-tester. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Detta protokoll beskriver arbetsflödet för metabolisk märkning av senescenta och icke-delande celler med pulserad SILAC, oriktad masspektrometrianalys och en strömlinjeformad beräkning av proteinhalveringstider.

Mätning av proteinomsättningshastigheter i senescenta och icke-delande odlade celler med metabolisk märkning och masspektrometri

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Hur celler upprätthåller proteinhomeostas är inte väl förstått i samband med cellulär stress och senescens. I detta protokoll tillhandahåller vi ett enkelt och exakt sätt att beräkna proteinomsättningen, vilket är en nyckelkomponent i proteinhomeostas i levande celler. Pulse SILAC ger en experimenter möjlighet att mäta proteinomsättning för enskilda proteiner och hela proteomet på ett sätt med hög genomströmning som också är mer autentiskt för biologiska system än andra metoder.Principerna för denna metod kan tillämpas på alla system som kan metaboliskt märkas, inklusive hela organismer. Denna metod kan också leda till insikter i cellulär senescens, åldrande och neurodegenerativ sjukdom. Masspektrometrianalys är mycket känslig för vissa kemiska föroreningar, såsom tvättmedel.Använd reagenser av LC-MS-kvalitet under hela denna procedur för att säkerställa datainsamling av hög kvalitet. För att påbörja den metaboliska märkningen av cellerna, ersätt mediet för tre plattor vardera av senescenta och vilande celler med 30 ml SILAC Light media. Byt ut mediet separat för tre senescenta och tre vilande plattor med 30 ml SILAC Heavy.Växa cellerna i tre dagar utan att ändra mediet. För att lossa cellerna från odlingsplattorna, tillsätt fem milliliter förvärmt trypsinreagens till varje platta och inkubera plattorna i fem minuter vid 37 grader Celsius. Senare återuppstjäna de fristående cellerna i fem milliliter av samma medium som används för odling till en total volym av 10 ml.Överför sedan cellerna till is och centrifugera cellerna vid 300 gånger G vid fyra grader Celsius. Efter att ha tvättat pelletsen två gånger, snurra ner cellerna igen och ta bort supernatanten innan du återanvänder pelletsen i 150 mikroliter nyberedd åtta molär urea och 50 millimolär ammoniumbikarbonatlysbuffert. Blanda innehållet i röret genom pipettering upp och ner.Alikvot 50 mikrogram av proteinprovet i ett nytt rör och tar prover upp till lika stora volymer med lysbuffert. Tillsätt sedan dithiothreitol till en slutlig koncentration av 20 millimolar till röret och inkubera provet vid 37 grader Celsius i 30 minuter med skakning. Låt provet svalna vid rumstemperatur i 10 minuter innan du tillsätter jodoacetamid till en slutlig koncentration av 40 millimolar och inkuberar vid rumstemperatur i mörkret i 30 minuter.Späd sedan provet till under en molär urea med en 50-millimolär ammoniumbikarbonatbuffert. Tillsätt ett mikrogram trypsin för 50 mikrogram startprotein eller vid 1:50 trypsin till proteinförhållande till provet. Inkubera provet över natten vid 37 grader Celsius med skakning för att smälta proteiner i peptider.Nästa dag tillsätt myrsyra till 1 volymprocent av provet för att släcka proteinförtunningen. För provrensning, placera en fastfas extraktionspatron på ett vakuumgrenrör med en extraktionspatron för varje prov, enligt tillverkarens riktlinjer. Efter extraktionen, ta bort peptidproverna från vakuumgrenröret och torka dem helt i en vakuumkoncentrator.Torkning tar ungefär tre timmar. För masspektrometri, eller MS-analys, återsuspendera peptidprovet i en koncentration av 400 nanogram per mikroliter i en 0,2% myrsyrabuffert. För att resolubilisera peptiderna, blanda provet i fem minuter.Sedan, sonicate i fem minuter i ett vattenbad sonicator. Centrifugera sedan provet för att pelletera de olösliga materialen och överföra peptidsupernatanterna till MS-injektionsflaskor. Skicka in proverna för proteomisk analys med hjälp av vätskekromatografi tandemmasspektrometri, eller LC-MS-MS.Använd de inställningar som rekommenderas för oriktad analys av masspektrometrianläggningen. Ladda proverna på en analytisk kolonn med en flödeshastighet på 400 nanoliter per minut för att eluera peptiderna över en 90-minuters linjär gradient med en blandning av organiska och oorganiska lösningsmedel, med det organiska lösningsmedlet som sträcker sig från 5 till 35% Förvärva masspektrometridata i databeroende läge, med en kontinuerlig cykel av MS1-undersökningsskanningar följt av 20 databeroende MS2-skanningar med HCD-fragmentering. Kvantifiera peptidtoppområdena för tunga och lätta peptider i programvaruverktyget Proteome Quantitation.Exportera sedan de tunga och lätta peptidtoppområdena. För beräkning av proteinhalveringstider öppnar du SILAC Analysis Workbook till det första arket med namnet Raw Data och klistrar in UniProt-ID:er, gennamn, tunga och lätta toppområden i de angivna kolumnerna. Öppna sedan det fjärde arket med namnet Analys och ta bort raderna där kolumnerna G och H anger att provet är utanför intervallet och behåll rader som läser inom intervallet.De senescenta fenotyperna validerades med hjälp av den senescensassocierade beta-galaktosidasaktiviteten och RT-qPCR-analysen. För beta-galaktosidasaktiviteten verkade de senescenta cellerna blåa, medan de vilande kontrollcellerna hade ingen eller minimal färg. I RT-qPCR-analysen visade de senescenta cellerna högre interleukin-6, CXCL8 och CDKN1A-P21 mRNA jämfört med de vilande cellerna.Omvänt var nivån av lamin B1-kodning för proliferationsmarkör låg eller frånvarande i de senescenta cellerna. De extraherade jonkromatogrammen av peptider avslöjade den relativa andelen tunga och lätta peptidsignaler. En lägre andel tunga peptidsignaler i förhållande till lätta senescenta celler indikerade en långsammare proteinomsättningshastighet, och en högre tung peptidsignal i förhållande till ljus indikerade en snabbare proteinomsättningshastighet.De omärkta proverna visade liten eller ingen tung peptidsignal. Halveringstider för 695 proteiner som identifierats från masspektrometrianalysen beräknades. Halveringstiden rapporteras som ett log-två-förhållande av senescent över vilande celler och plottas i en vulkanplot.Efter beräkningen av proteinomsättningshastigheter i senescenta celler kan nedströmsanalys avslöja kandidatbiologiska vägar som regleras av proteostasmekanismer. Pulse SILAC banade väg för forskare att studera proteindynamik med oöverträffad granularitet och genomströmning, vilket gjorde det möjligt för oss att studera förändringar i proteinhomeostas i många enskilda proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless kapillärelektrofores-masspektrometri för Metabolic Profiling av biologiska prover

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Masspektrometri och luminogent baserade metoder för att karaktärisera Fas I Metabolic kompetens<em&gt; In Vitro</em&gt; Cellkulturer

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturläsning och DNA reparation Assay använder Single Nucleotide förlängning och MALDI-TOF-masspektrometri.

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Mäta och tolka syre förbrukning helt flyga Head segment

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...