Name: measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ve Intramural Araştırma Programı (IRP), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) tarafından desteklenmiştir. N.B., Uzun Ömürlü Impetus Hibeleri ve Diyet Takviyeleri Ofisi (ODS) Bilim İnsanları Programı tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

pSILAC, çoklu hücresel koşullarda protein devir hızlarının küresel olarak ölçülmesini sağlayan güçlü bir tekniktir. Bu makale, yaşlanan ve sessiz hücrelerin hazırlanması, SILAC etiketlemesi ve toplanması ve nihayetinde DDA kütle spektrometrisi kullanılarak analiz edilmesi için talimatlar da dahil olmak üzere, yaşlanan ve sessiz hücreler arasındaki küresel protein yarı ömürlerini karşılaştırmak için pSILAC'ın kullanımını detaylandırmaktadır. Ek olarak, yaşlanma ile ilişkili proteinleri kodlayan bir mRNA panelinin SA-βGal ve RT-qPCR analizi kullanılarak yaşlanma fenotipinin doğrulanması için iki aşamalı bir test tanımlanmıştır. Tanımlanan iki yaklaşımla yaşlanmanın doğrulanmasına ek olarak, proteomik düzeyde yaşlanan ve sessiz hücreler arasındaki bilinen yaşlanma belirteçlerindeki değişiklikler aranarak kütle spektrometrisi analizini takiben yaşlılığın üçüncü bir doğrulaması gerçekleştirilebilir. Yükselmesi beklenen yaşlanma ile ilişkili proteinler, diğerlerinin yanı sıra44,45 başka bir yerde tanımlanan p16, p21 ve BCL2'yi içerir. Yukarıda açıklanan protokolde, iyonlaştırıcı radyasyon, durgun hücreler için yaşlanma ve serum açlığının indüklenmesi için kullanılmıştır. Yaşlanmanın indüksiyonu için birden fazla seçenek mevcuttur ve bunlar arasında41,42,46 önemli heterojenlik vardır. Şu anda, "en fizyolojik" olarak kabul edilen bir yaşlanma yöntemi yoktur, bu nedenle yaşlanan indükleyicinin seçimi büyük ölçüde deneyin bağlamına dayanmaktadır. Bununla birlikte, yaşlanma hakkında genel bir fenomeni belirtmek amacıyla yapılan deneylerin en az iki farklı yaşlılık indükleyicisi kullanması önerilir. Yaşlanma paradigmalarının aralığını tartışmak bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak yaşlanmayı indüklemek için bazı yaygın yöntemler arasında DNA hasarını tetiklemek (IR, doksorubisin, replikatif tükenme), onkojenik proteinleri eksprese etmek (HRAS, BRAF) ve mitokondri fonksiyonunu bozmak2.
Yaşlanan indükleyici seçimine ek olarak, kontrol hücrelerinin seçimi de eşit derecede önemli bir husustur. Yaşlanan hücreler, tanım gereği, süresiz büyüme durması altındadır, bu nedenle diğer büyüme durdurucu hücrelerle karşılaştırılması sıklıkla seçilir. pSILAC için, hücre döngüsü tutuklanmış hücreler genellikle tercih edilir, çünkü çoğalmazlar ve bu nedenle protein yarı ömür hesaplamaları için kullanımı daha kolaydır47. Bununla birlikte, kültürlenmiş hücreler genellikle bazı bölünen hücreleri tutacağından, hücre döngüsü durmasını indüklemek için kullanılan yöntemlerin, hala çoğalmakta olan hücrelerden gelen hataları en aza indirmek için mümkün olduğunca homojen bir yanıt üretmesi önemlidir. pSILAC kullanarak döngü hücreleri için protein bozunma oranlarını hesaplamak için, proteinin yavru hücrelere seyreltilme hızını telafi etmek için ek hesaplamalar gerekir27. Bununla birlikte, sessiz büyüme durmasının kendisi komplikasyonsuz değildir. Hücre döngüsü durması için iki genel yöntem vardır: serum yoksunluğu ve temas inhibisyonu48. Tüm hücreler temas inhibisyonu yoluyla sessiz hale getirilemez, ancak bazı fibroblastların49 kültürlenmesinden birkaç gün sonra sessizlik gösterdiği gösterilmiştir. Bu yöntem serum yoksunluğunu kullandı, çünkü yaşlanan hücrelerin karşılaştırılması için daha yaygın olarak kullanılıyor, ancak yaşlanan hücrenin doğru karşılaştırmalar için benzer şekilde serumdan mahrum bırakılmasını gerektiriyor. Serum, mTOR kompleksini aktive eder ve bu nedenle serum yoksunluğu, hücre döngüsü tutuklaması50'ye ek olarak hücre üzerinde çeşitli aşağı akış etkilerine sahiptir. Özellikle, yaşlanan hücrelerin serum yoksunluğu veya mTOR inhibisyonu51,52 üzerine azalmış bir SASP gösterdiği gösterilmiştir.
pSILAC'ta göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli nokta, kaç zaman noktasının test edileceğidir. Bu protokol, hücreleri tek bir zaman noktasında (3 günlük hafif veya ağır etiketleme) topladı ve bu da ortaya çıkan analizi önemli ölçüde basitleştirdi. Zaman noktası seçimi, deneyin amacına dayanmalıdır. Küresel analiz için, 3 günün proteinlerin çoğunluğunu yakalaması beklenir, ancak 3 gün içinde tamamen devreden kısa ömürlü proteinlerin yarı ömürleri (tüm ışık sinyali kaybolur) bu zaman noktasında ölçülemez. Tersine, 3 gün içinde çok az ciroya sahip uzun ömürlü proteinlerin ölçülmesi de zordur ve genellikle çok az ağır sinyal birikiminin bir sonucu olan son derece büyük yarı ömürlere (haftalar sırasıyla) sahip olarak görünürler. Ağır ve hafif peptit sinyallerinin oranındaki doğrusal olmayan ilişki nedeniyle, daha kısa ve daha uzun zaman noktalarında yeni sentezlenen proteinin yüzdesi nedeniyle, yarı ömürlerin niceliği, ek etiketleme zaman noktaları eklenerek geliştirilebilir. İki hücre durumu arasındaki göreceli karşılaştırmalar için, bu protokolde olduğu gibi, yaklaşık bir yarı ömür yeterli olabilir, ancak nicel doğruluğu artırmak için ek zaman noktaları kullanılabilir.
Bu protokol, protein döngüsünün hedeflenmemiş DDA tabanlı bir analizinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Bununla birlikte, protein devir hızı hesaplamaları genellikle ağır ve hafif peptit çiftlerinin göreceli bolluğunu elde edebilen herhangi bir edinme şemasına uygulanabilir. Örneğin, veriden bağımsız edinme (DIA/SWATH) gibi MS2 tabanlı yöntemler de53 ciro oranlarının başarılı bir şekilde hesaplanması için uygulanabilir. Ek olarak, bu protokolde açıklananlar dışındaki enstrümantasyon ve yazılım boru hatları, DDA analizi, protein tanımlama ve protein niceliği gerçekleştirmek için kullanılabilir. Peptit tepe alanlarını çıkarmak için Skyline gibi protein niceleme yazılımı platformlarını kullanırken, belge çalışma alanında çıkarılan iyon kromatogramlarının manuel olarak incelenmesi, hatalı şekilde entegre edilmiş ve nicel olmayan zirvelerin belirlenmesi ve belgenin buna göre düzenlenmesi önerilir. Skyline (skyline.ms) için kapsamlı bir öğretici koleksiyonu çevrimiçi olarak mevcuttur.
pSILAC, üstün çoklama (proteom kapsamı) ve verim nedeniyle kültürlü hücrelerde protein yarı ömürlerinin küresel olarak ölçülmesi için en ideal yöntemlerden birini temsil eder. pSILAC doğrudan sentez veya bozulma oranları sağlamazken, hafif ve ağır sinyaldeki değişim faktörlerin bir araya gelmesinden kaynaklandığından, pSILAC koşullar ve farklı hücre tipleri arasındaki karşılaştırmalar için oldukça yararlıdır. Düşük verimli yöntemler genellikle iki tipe ayrılır: 1) protein sentezini bloke etmek için hücrelerin siklopeksimidle muamelesi ve çürümeyi izlemek için ilavelerden sonra zaman aralıklarında hasat edilmesi veya 2) hücrelerin protein çürümesi inhibitörü ile muamele edilmesi ve protein birikimini izlemek için ilavelerden sonra zaman aralıklarında hasat edilmesi, böylece protein çürüme oranlarının çıkarılması. Her iki yöntemin de sınırlılığı, bu tür tedavilerin kaçınılmaz olarak hücresel fizyolojide önemli değişikliklere neden olacağıdır. Buna karşılık, pSILAC önemli bir müdahale gerektirmez ve teorik olarak hücresel fizyoloji üzerinde tespit edilebilir bir etkiye sahip değildir, çünkü izotopik amino asitler izotopik olmayan muadillerinden sadece tek bir nötron ile farklılık gösterir. Bu nedenle, burada pSILAC için açıklanan yöntem, bölünmeyen hücrelerdeki en fizyolojik protein yarı ömürlerinin küresel ölçümü için basit bir protokolü temsil eder.
Protein döngüsündeki değişikliklerin yaşlanma, yaşa bağlı hastalıklar, nörodejenerasyon ve uzun ömürlülük ile yakın ilişkisi vardır54,55. Bu protokol, yaşlanma hücrelerinde protein devir hızlarını ölçmek için hücre kültüründeki amino asitlerin kararlı izotop etiketlemesini kullanarak bu ilişkileri sorgulamak için bir yöntem açıklar. Bununla birlikte, fareler gibi tüm organizmalarda in vivo yaşlanma ve nörodejenerasyon bağlamında çalışmalar yapmak için çok sayıda benzer yöntem mevcuttur. Nitekim, bu çalışmalar yaşa bağlı hastalıklar bağlamında protein devir hızlarının ölçülmesinin önemini vurgulamıştır56,57,58,59.
Bu çalışmada, ribozomal proteinler ve endoplazmik retikulumda bulunan proteinler, yaşlanan hücrelerde sırasıyla azalmış ve artmış yarı ömürlü iki protein kategorisi olarak öne çıkmıştır. Kesin sonuçlar için kararlı durum seviyelerinin daha fazla analizi gerekli olsa da, bu sonuçlar ayrıca yaşlanan hücrelerin ribozomal proteinlerin yarı ömürlerinin azalması yoluyla translasyonu benzersiz bir şekilde düzenleyebileceğini düşündürmektedir. İleriye dönük olarak, hücresel yaşlanma ve nörodejenerasyon in vivo in mouse modelleri arasındaki ilişkiyi incelemek için kararlı izotop etiketleme yaklaşımlarının uygulanması, bu protokol tarafından açıklanan izotop etiketleme yaklaşımının umut verici bir uzantısı olacaktır.

Yaşlanma ilk olarak, replikatif tükenmeye ulaştıktan sonra kültürlenmiş birincil hücreler tarafından sergilenen süresiz bir büyüme durması durumu olarak tanımlanmıştır1. O zamandan beri, yaşlanmanın, diğerlerinin yanı sıra genotoksik, mitokondriyal ve onkojenik stresler de dahil olmak üzere çok sayıda hücresel hakarete yanıt olarak ortaya çıkabileceği gösterilmiştir2. Yaşlanma, tümör baskılanması ve yara iyileşmesi gibi fizyolojik olarak önemli birçok role sahipken, yaşlanma sırasında yaşlanan hücrelerin birikmesi, çeşitli nörodejeneratif durumlar da dahil olmak üzere sağlık3 üzerinde bir dizi zararlı etki ile ilişkilidir 4,5,6. Hücresel yaşlanma, nöronlar 7,8,9,10, astrositler 11, mikroglia12 ve oligodendrosit öncülleri 13 dahil olmak üzere çoklu beyin hücresi tiplerinde görülür ve nörodejenerasyon ve bilişsel işlev bozukluğuna katkıda bulunur. Alzheimer hastalığı14'ün ayırt edici özelliklerinden biri olan amiloid beta oligomerlerinin nöronal yaşlanmayı hızlandırdığı gösterilmiştir13,15,16. Yaşlanan hücrelerin prevalansının artması, özellikle çevresel stresörlerden kaynaklanan Parkinson hastalığı17 ile de ilişkilendirilmiştir11,18. Önemli olarak, klinik öncesi modellerde yaşlanan hücrelerin seçici olarak ortadan kaldırılması ömrü uzatır ve yaşa bağlı çok sayıda hastalığı hafifletir 3,5,12 ve bilişsel eksiklikleri iyileştirir 8,11,12,13. Yaşlanan hücreler bu nedenle yaşa bağlı birçok durumun tedavisi için umut verici terapötik hedefler olarak ortaya çıkmıştır.
Yaşlanan hücrelerin zararlı etkilerinin çoğuna, yaşlanma hücreleri tarafından salgılanan biyoaktif moleküllerin karmaşık bir karışımı olan yaşlanma ile ilişkili sekretuar fenotipten (SASP) kaynaklanır ve bu da lokal inflamasyona, anjiyogeneze, hücre dışı matriksin tahrip olmasına ve çevredeki dokuda yaşlanmanın yayılmasına neden olabilir 19,20,21 . SASP ayrıca yaşlanmanın ilginç bir biyolojik fenomenini temsil eder, çünkü hücre döngüsü tutuklaması durumunda önemli bir transkripsiyonel ve translasyonel çaba gerektirir. Aslında, yaşlanan hücrelerin, protein sentezini azaltması gereken ribozom biyogenezi22,23,24'te azalmalar sergilediği gösterilmiştir. Bunun yerine, yaşlanan hücreler bazı proteinleri, özellikle SASP faktörlerini sağlam bir şekilde çevirir ve çevreleyen dokunun metabolizmasını etkiler25. Bu nedenle, kalıcı bir hücre döngüsü durması geçiren yaşlanan hücrelerin protein homeostazını korumaya devam ederken, aynı zamanda SASP faktörlerini ve diğer seçilmiş proteinleri sağlam bir şekilde ifade etmeye devam ettiğini anlamaya büyük ilgi vardır.
Bu yöntem, yaşlanan hücrelerdeki proteinlerin yarı ömürlerini proteom çapında bir ölçekte küresel olarak ölçmek için hücre kültüründeki amino asitler (pSILAC) tarafından kütle spektrometresinin ve darbeli kararlı izotop etiketlemesinin nasıl kullanılacağını açıklar. Geleneksel SILAC'ta, kültürlenmiş hücreler, protein bolluğunun aşağı akış analizi için amino asitlerin ağır ve hafif radyoaktif olmayan izotopları ile tamamen metabolik olarak etiketlenir. Bu yöntem daha önce kültürlü fibroblastların SASP'sinde bolluk değişikliklerini kapsamlı ve nicel olarak değerlendirmek için uygulanmıştır26. pSILAC'ta, hücreler benzer şekilde metabolik olarak, hafif izotop ile ön etiketlemeyi takip eden ağır izotop darbesi ile etiketlenir ve daha sonra bir veya daha fazla zaman aralığında toplanır. Önceden var olan hafif izotopa atıfta bulunarak ağır izotopun dahil edilme oranları daha sonra göreceli protein devir hızlarını hesaplamak için kullanılır. Genel olarak, arginin ve lizin izotopları kullanılır, çünkü tripsin bu kalıntılarda ayrılır; Böylece, standart sindirimden elde edilen tüm peptitler potansiyel olarak ağır etiketi içerecektir. Sadece ağır lizin veya arginin varlığı veya yokluğu ile farklılık gösteren peptit çiftleri kimyasal olarak aynıdır ve bir kütle spektrometresi ile ayırt edilebilir ve ölçülebilir. Kütle spektrometrisi analizini takiben, peptidler, ortaya çıkan peptid tanımlamalarında izotopik etiketin varlığına veya yokluğuna bağlı olarak yeni sentezlenmiş veya önceden var olan olarak tanımlanabilir. Protein devir hızları daha sonra, belirli bir protein için hafif (12C-14 N) peptitler üzerindeki ağır (13 C-15N) oranının, üstel büyüme veya bozunma için kinetik modellere 27,28 olarak uydurma ile belirlenebilir. pSILAC, 29,30,31,32 protein devir hızının çeşitli karşılaştırmalarında kullanılmıştır ve şu anda protein yarı ömürlerinin ölçümü için en kapsamlı ve yüksek verimli yöntemdir.
Bu protokol, yaşlanan hücrelerin kültürdeki benzer şekilde büyüme durduran sessiz hücrelere paralel olarak hazırlanmasını ve ardından pSILAC ile metabolik etiketlemeyi detaylandırır. Hücreler daha sonra toplanır, lizatlara homojenize edilir ve kütle spektrometresi edinimi ve analizi için işlenir. Kütle spektrometresinden elde edilen veriler daha sonra, bir elektronik tabloda gerçekleştirilen tek bir zaman noktası ve yarı ömür hesaplamaları kullanan basitleştirilmiş bir nicel yöntem kullanılarak protein yarı ömürlerini belirlemek için kullanılır. Bu yaklaşımı kullanarak, protein yarı ömürlerinin tahminleri, bozulmamış hücresel koşullar için, protein sentezi veya cirosunun blokerlerini kullanan protokollerden daha otantik olan kapsamlı ve nicel bir şekilde ölçülebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammacel 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td></td>
			<td>Cesium Irradiator for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMR-90 primary lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iRT Kit (indexed retention time)</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td>Indexed Retention Time Peptide Standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>423835000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Mascot Daemon 2.8</td>
			<td>Proteomic database searching software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano LC System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q Exactive HF Orbitrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>327110025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline</td>
			<td>University of Washington</td>
			<td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td>
			<td>Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator waterbath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-516R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Referred to as phenol in text; hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPle Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (sequencing grade)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS grade)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>AH365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein turnover rates in senescent and non-dividing cultured cells with metabolic labeling and mass spectrometry

Artan kanıtlar, merkezi sinir sisteminde yaşlanan hücrelerin birikmesinin, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları gibi nörodejeneratif bozukluklara katkıda bulunduğunu göstermiştir. Hücresel yaşlanma, tipik olarak ölümcül altı streslere maruz kalmaya yanıt olarak ortaya çıkan kalıcı bir hücre döngüsü durması durumudur. Bununla birlikte, diğer bölünmeyen hücreler gibi, yaşlanan hücreler metabolik olarak aktif kalır ve benzersiz transkripsiyonel ve translasyonel talepler ve hücre içi ve salgılanan proteomlarda yaygın değişiklikler gerektiren birçok işlevi yerine getirir. Yaşlanma sırasında protein sentezinin ve çürüme oranlarının nasıl değiştiğini anlamak, hücresel yaşlanmanın altında yatan mekanizmaları aydınlatabilir ve yaşlanan hücreler tarafından şiddetlenen hastalıklar için potansiyel terapötik yollar bulabilir. Bu yazıda, kütle spektrometrisi ile birlikte hücre kültüründeki amino asitler (pSILAC) tarafından darbeli kararlı izotop etiketlemesi kullanılarak bölünmeyen hücrelerde protein yarı ömürlerinin proteom ölçeğinde değerlendirilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. pSILAC, amino asitlerin kararlı ağır izotop içeren versiyonları ile hücrelerin metabolik etiketlenmesini içerir. Modern kütle spektrometresi yaklaşımlarıyla birleştiğinde, pSILAC karmaşık karışımlarda yüzlerce veya binlerce proteinin protein döngüsünün ölçülmesini sağlar. Metabolik etiketlemeden sonra, proteinlerin devir dinamikleri, kütle spektrometrisi ile tespit edilen peptitlerdeki ağır izotopların göreceli zenginleşmesine dayanarak belirlenebilir. Bu protokolde, yaşlanan fibroblast kültürlerinin ve benzer şekilde tutuklanan sessiz fibroblastların oluşturulması için bir iş akışı ve beklenen protein devir hızlarının kapsamını en üst düzeye çıkaran basitleştirilmiş, tek zamanlı nokta pSILAC etiketleme zaman kursu tanımlanmıştır. Ayrıca, pSILAC kütle spektrometresi verilerinin analizi ve elektronik tablolar kullanılarak protein bozunma oranlarının kullanıcı dostu hesaplanması için bir boru hattı sunulmaktadır. Bu protokolün uygulanması, yaşlanan hücrelerin ötesinde, nöronlar gibi bölünmeyen kültürlü hücrelere genişletilebilir.

Bu protokol, pSILAC ve minimum zaman noktaları kullanarak yaşlanan ve bölünmeyen, sessiz kontrol hücreleri arasındaki protein yarı ömürlerini küresel olarak karşılaştırmak için bir yöntem açıklamaktadır. Bu protokol, kültürde yaşlanan ve sessiz hücrelerin üretimini, 3 gün boyunca arginin ve lizinin stabil izotoplarına sahip hücrelerin metabolik etiketlemesini, ağır ve hafif peptit izotoplarının göreceli bolluklarını kütle spektrometrisi ile ölçmeyi ve elektronik tablo formülleri kullanılarak protein yarı ömürlerinin basit ve erişilebilir bir hesaplamasını detaylandırır (Şekil 1). Bu yöntem oldukça esnektir ve çok sayıda hücre tipine ve koşuluna uyarlanabilir.
Bu protokol için yaşlanan hücrelerin üretilmesinin bir parçası olarak, iki yaşlanma doğrulama yöntemi kullanılır: mikroskopi ile görselleştirilen SA-βGal-pozitif hücreler ve RT-qPCR analizi kullanılarak ölçülen yaşlanan belirteçlerin artan seviyeleri. Yaşlılık belirteçlerinin ölçümü, iki hücre popülasyonunun karşılaştırmasının geçerli sayılması için sessiz ve yaşlanan hücreler arasında net ayrımlar yapmalıdır. SA-βGal aktivitesi için, yaşlanan hücreler mavi görünürken, sessiz kontrol hücreleri hiç renge sahip olmamalı veya çok az renge sahip olmalıdır (Şekil 2A). Bu tahlil, pozitif, mavi lekeli hücreleri toplam hücre sayısının bir yüzdesi olarak sayarak ve daha sonra sessiz kontrol ve yaşlanan hücreler arasındaki yüzde pozitiflik oranını karşılaştırarak ölçülebilir. Her iki hücre durumunun karşılaştırılması için bu protokolün aynı anda yapılması önemlidir; SA-βGal aktivitesi, boyama çözeltisinin pH'ına dayanır, bu nedenle sonuçlar tahliller arasında önemli ölçüde değişebilir ve kalitatif bir ölçüm olarak düşünülmelidir.
Yaşlılık belirteçlerinin RT-qPCR analizi, çoğu yaşlanan modelde SASP faktörlerini (IL6, CXCL8, IL1B) kodlayan mRNA'ların ve hücre döngüsü inhibitörlerinin (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21) yüksek seviyelerini gösterecektir. Hücre tipine, kültür durumuna ve yaşlılık indükleyicisi41,42'ye bağlı olarak bazı varyasyonlar beklenmesine rağmen, çoğu yaşlanan hücre, sessiz kontrol hücrelerine kıyasla beş kat daha yüksek IL6, CXCL8 ve CDKN1A / p21 mRNA seviyeleri gösterir; tersine, proliferasyon belirteçlerini kodlayan LMNB1 ve PCNA mRNA'larının seviyeleri, yaşlanan hücrelerde sessiz hücrelere kıyasla düşük veya hiç olmamalıdır (Şekil 2B). Birlikte ele alındığında, SA-βGal pozitifliğinin önemli bir yüzdesi ve yaşlanma ile ilişkili mRNA belirteçlerinin bir panelinin beklenen ekspresyonu, bir deneyde yaşlanmanın indüklenmesini doğrulamak için yeterlidir.
Kütle spektrometresi analizi için protein numunelerinin işlenmesi, çözelti içi çürütme (2 gün) ve katı faz ekstraksiyonundan (4-6 saat) oluşur. Hedeflenmemiş proteomik analiz yapmak için, elde edilen peptitler veriye bağımlı edinme (DDA) kullanılarak LC-MS / MS analizi için gönderilir. Orbitrap cihazlarında, kütle spektrometresi cihazı yazılım yöntemi düzenleyicisinde bir DDA yöntemi belirtilebilir. Bu çalışmada kullanılan kütle spektrometresi ayarları Şekil 3A'da gösterilmiştir. Sıvı kromatografisi ayarları yöntem editöründe de belirtilebilir. Bu çalışmada organik fazı (asetonitril) artan 90 dakikalık lineer gradyan kullanılmıştır (Şekil 3B). Başarılı bir kazanımı takiben, toplam iyon akımı (TIC), yöntemin doğrusal gradyan kısmı sırasında yoğun bir sinyal içermelidir (Şekil 3C). Bu protokol, bir Orbitrap cihazındaki örnek bir protokolü tanımlar, ancak protein yarı ömürlerinin hesaplanması, çeşitli cihaz türlerinde (örneğin, Orbitrap'lar ve uçuş zamanı aletleri) ve satıcılarda bulunan DDA modunda toplanan herhangi bir kütle spektrometresinden elde edilen veriler üzerinde gerçekleştirilebilir. Edinme ayarları, kullanılan cihazın türüne ve konfigürasyonuna özgü olacaktır ve kütle spektrometresi tesisi tarafından önerilen ayarların kullanılması önerilir. Bu yöntem, ağır ve hafif pikler için nicel kromatografik tepe alanları ham veri dosyalarından çıkarılabildiği ve elektronik tablo formüllerine girilebildiği sürece, DDA olmayan yöntemlerle (SRM, PRM, DIA) de uyumludur.
Ham kütle spektrometresi dosyaları, peptitleri ve proteinleri tanımlamak için mevcut birçok proteomik veritabanı arama aracından biriyle aranır. Örneğin, bu çalışmada Mascot43 arama motoru kullanılmıştır. Ağır ve hafif peptitlerin nicelleştirilmesi için kromatografik tepe alanları elde etmek için, veritabanı arama sonuçları Skyline39,40 gibi kromatografik tepe alanları yapabilen proteomik bir yazılıma aktarılır. Peptitlerin ekstrakte edilen iyon kromatogramlarının incelenmesi (Şekil 4), ağır ve hafif peptit sinyallerinin göreceli oranını ortaya çıkaracaktır. Yaşlanan hücrelerde hafif peptit sinyaline göre daha düşük bir ağır peptit sinyali oranı, daha yavaş bir protein devir hızını gösterir (Şekil 4A) ve ışığa göre daha yüksek bir ağır peptit sinyali, daha hızlı bir protein devir hızını gösterir (Şekil 4B). Etiketlenmemiş numuneler çok az ağır peptit sinyali göstermeli veya hiç göstermemelidir. Etiketlenmemiş numunelerdeki görünür herhangi bir ağır peptit sinyali, arka plan gürültüsü olarak kabul edilir ve son hesaplamalar sırasında çıkarılır. Tüm arıtma ve etiketleme koşulları için hafif ve ağır peptitler için kromatografik pik alanların miktarının belirlenmesi, protein devir hızlarının daha sonra hesaplanması ve istatistiksel analiz için ihraç edilmelidir.
Tek zaman noktası analizi kullanılarak, protein yarı ömürlerinin nicelleştirilmesinin gerçekleştirilmesi kolaydır ve elektronik tablolarda rahatça yapılabilir. Tablo 3'te, kütle spektrometrisi analizinden tanımlanan 695 proteinin yarı ömürleri hesaplanmıştır. Numunelerdeki her protein için protein seviyesindeki ağır ve hafif izotop bolluklarından başlayarak ( 1) Ham Veri sayfası için girdi), yüzde bir ağır izotop (Oran, R olarak adlandırılır) daha sonra 2) H Oranı başlıklı sayfada otomatik olarak hesaplanır | H + L. Bu adımda, ağır etiketli numunelerden R, sessiz ve yaşlanan üçlüler için son bir R üretmek üzere etiketsiz numunelerden R'nin çıkarılmasıyla normalleştirilir. Etiketlenmemiş numunelerin eksojen olarak eklenmiş ağır izotopu olmaması gerektiğinden, arka plan sinyalini ortadan kaldırmak için kullanılırlar. R'den, kdeg (devir hızı) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
Yarılanma ömrü (H, gün cinsinden), sessiz kontroldeki her protein ve yaşlanan üçlü ( sayfa başlıklı 3) Yarılanma Ömrü (gün)) için aşağıdaki formül kullanılarak belirlenir:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
Bu yarılanma ömürleri daha sonra, her protein için bir p-değerinin yanı sıra sessiz ve yaşlanan ortalama yarı ömür üretmek için sessiz ve yaşlanan üçlüler arasında ortalamaya alınır. Hesaplanan yarılanma ömürleri daha sonra negatif olan değerler için filtrelenir; bu, ışık etiketli hücrelerden (arka plan) gelen ağır sinyal, ağır etiketli hücrelerden gelen ağır sinyalden daha büyük olduğunda ortaya çıkar. Bu filtreleme, burada sunulan sonuçlar için geçerli yarı ömürlerle tanımlanan 841'den 707 protein ile sonuçlandı.
Yarılanma ömrü daha sonra sessiz kontrol hücrelerine (log2FC ) göre yaşlılığın log 2 oranı olarak rapor edilir ve bir volkan grafiğinde çizilir (Şekil 5). Örneğin, 5) Analiz sayfasına bakıldığında, pıhtılaşma II trombin reseptörü (F2R) proteininin, 0.51 günlük (B sütunu) sessiz hücrelerde bir yarı ömre ve 1.07 günlük yaşlanan hücrelerde (C sütunu) bir yarı ömre sahip olduğu görülebilir ve bu da 0.001 p değerine sahip ~1.06 (D sütunu) log2FC verir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> Şekil 1: Yaşlanan ve sessiz kontrol hücreleri için pSILAC iş akışının diyagramı. İnsan IMR-90 fibroblastları, protein yarı ömürlerinin karşılaştırılması için sessiz (düşük serum) veya yaşlanan (IR) hücre kültürlerini hazırlamak için kullanıldı. Hücreler daha sonra 3 gün boyunca izotopik arginin ve lizin içeren SILAC Light veya SILAC Heavy media ile etiketlendi. Lisatlar hücrelerden ekstrakte edildi, sindirildi, tuzdan arındırıldı ve kütle spektrometrisi kullanılarak analiz edildi. Ağır ve hafif peptit izotop zirveleri, sırasıyla yeni sentezlenmiş ve önceden var olan peptitlere karşılık gelir. Yarılanma ömürleri, üstel bozunma için bir denklem kullanılarak hesaplandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> Şekil 2: SA-βGal ve RT-qPCR analizleri kullanılarak yaşlanan fenotiplerin doğrulanması. (A) Yaşlanan ve sessiz hücreler hasat sırasında 6 delikli bir plakaya yeniden kaplanır ve SA-βGal boyama kiti kullanılarak SA-βGal için boyanır. Hücre gövdesindeki mavi renk yaşlanma için pozitiftir. Görüntüler parlak alanda, 10x büyütmede renkte, kırmızı boyut işaretleyicisiyle çekilir. (B) RT-qPCR analizi, yaşlanan hücreleri (kırmızı) ve döngü hücrelerini (gri) ilgisiz bir deneyden karşılaştırır. CDKN1A / p21, CXCL8 ve IL6 mRNA seviyelerindeki artışlar, LMNB1 mRNA seviyelerindeki azalma gibi yaşlanmanın göstergesidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> Şekil 3: Q-Exactive HF orbitrap kütle spektrometresi üzerindeki pSILAC kültürlerinin veriye bağımlı edinim (DDA) taramaları ve sıvı kromatografi gradyanı için temsili yöntemler. (A) Bir pSILAC deneyinden tüm hücre lizatlarının veriye bağlı analizi için cihaz yazılımında önerilen cihaz ayarları. (B) Örnek sıvı kromatografisi akış gradyanı yöntem ayarları. Peptitler,% 5 ila% 35 tampon B (% 0.2 formik asit ve% 99.8 asetonitril) arasında değişen 90 dakikalık bir doğrusal gradyan üzerinde salınır, ardından% 80 tampon B ile 10 dakikalık bir yıkama ve% 5 tampon B ile 25 dakikalık bir denge sağlanır. (C) Belirtilen ayarlarla elde edilen IMR-90 fibroblast peptitlerinin kütle spektrometrisi kazanımının temsili bir toplam iyon kromatogramı (TIC). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> Şekil 4: Yaşlanma sırasında değişmiş ciroya sahip peptitlerin temsili ekstrakte iyon kromatogramları . (A) Yaşlanan ve yaşlanmayan hücrelerde protein DnaJ homolog alt ailesi B üyesi 11'den (DNAJB11) peptid FQMTQEVVCDECPNVK ++ 'ın kromatografik tepe alanları. SILAC'ın 3 gününü takiben, yaşlanan hücreler, hafif peptide (kırmızı) göre ağır izotop içeren peptidin (mavi) tepe alanındaki bir azalma ile gösterildiği gibi, bu peptide sessiz (yaşlanmayan) hücrelere kıyasla daha az ağır izotop içerir, bu da bu peptidin yaşlanan hücrelerde ciroyu azalttığını gösterir. (B) Yaşlanan ve yaşlanmayan hücrelerde protein Ekleme Faktörü 3a Alt Birim 1'den (SF3A1) peptid VQAQVIQETIVPK ++ 'ın kromatografik tepe alanları. SILAC'ın 3 gününü takiben, yaşlanan hücreler, hafif peptide (kırmızı) göre ağır izotop içeren peptidin (mavi) tepe alanındaki bir azalma ile gösterildiği gibi, bu peptide sessiz (yaşlanmayan) hücrelere kıyasla daha yüksek oranda ağır izotop içerir ve bu peptidin yaşlanan hücrelerde ciroyu arttırdığını gösterir. Etiketlenmemiş (Gün 0) koşullar, beklendiği gibi, her iki peptit için de ağır izotop dahil edilmediğini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> Şekil 5: pSILAC etiketlemesinden belirlenen yaşlanan ve sessiz hücrelerdeki protein yarı ömürlerinin karşılaştırılması. (A) Tanımlanan 695 proteinin her biri için yaşlılık/kontrol (sessiz) oranının log2 oranını gösteren volkan grafiği; Bu deneyde, Hafif ve Ağır etiketleme ortamı glikoz ve fenol kırmızısı içermiyordu. (B) Durgun hücrelerde yaşlanan hücrelere karşı en fazla artmış veya azalmış yarı ömre sahip ilk 10 proteini gösteren tablolar (sırasıyla sol ve sağ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan ortam ve arabellekler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 2: Bu protokolde kullanılan RT-qPCR primerleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 3: Protein yarı ömürlerinin, kıvrım değişikliklerinin ve t-testlerinin hesaplanması için SILAC analiz çalışma kitabı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry at JoVE.com

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Bu protokol, yaşlanan ve bölünmeyen hücrelerin darbeli SILAC, hedefsiz kütle spektrometrisi analizi ve protein yarı ömürlerinin kolaylaştırılmış bir hesaplaması ile metabolik etiketlenmesi için iş akışını açıklar.

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Hücrelerin protein homeostazını nasıl koruduğu, hücresel stres ve yaşlanma bağlamında iyi anlaşılmamıştır. Bu protokolde, canlı hücrelerde protein homeostazının önemli bir bileşeni olan protein döngüsünü hesaplamak için basit ve doğru bir yol sunuyoruz. Pulse SILAC, bir deneyciye bireysel proteinler ve tüm proteom için protein döngüsünü, biyolojik sistemlere diğer yöntemlerden daha otantik olan yüksek verimli bir şekilde ölçme yeteneği verir.Bu yöntemin ilkeleri, tüm organizmalar da dahil olmak üzere metabolik olarak etiketlenebilen herhangi bir sisteme uygulanabilir. Bu yöntem aynı zamanda hücresel yaşlanma, yaşlanma ve nörodejeneratif hastalık hakkında içgörülere yol açabilir. Kütle-spektrometri analizi, deterjanlar gibi bazı kimyasal kirleticilere karşı oldukça hassastır.Yüksek kaliteli veri toplama sağlamak için bu prosedür boyunca LC-MS sınıfı reaktifler kullanın. Hücrelerin metabolik etiketlemesine başlamak için, yaşlanan ve sessiz hücrelerin her biri için üç plaka için medyayı 30 mililitre SILAC Light ortamı ile değiştirin. Ayrı olarak, üç yaşlanan ve üç sessiz plaka için ortamı 30 mililitre SILAC Heavy ile değiştirin.Ortamı değiştirmeden hücreleri üç gün boyunca büyütün. Hücreleri kültür plakalarından ayırmak için, her plakaya beş mililitre önceden ısıtılmış tripsin reaktifi ekleyin ve plakaları 37 santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, ayrılan hücreleri, kültür için kullanılan aynı ortamın beş mililitresinde toplam 10 mililitre hacme kadar yeniden askıya alın.Daha sonra, hücreleri buza aktarın ve hücreleri dört santigrat derecede 300 kez G'de santrifüj yapın. Peleti iki kez yıkadıktan sonra, hücreleri tekrar döndürün ve peleti 150 mikrolitre taze hazırlanmış sekiz molar üre ve 50 milimolar amonyum bikarbonat lizis tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı çıkarın. Tüpün içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.Aliquot 50 mikrogram protein numunesini yeni bir tüpe dönüştürür ve numuneleri lizis tamponu ile eşit hacimlere getirir. Daha sonra tüpe 20 milimolar nihai konsantrasyona dithiothreitol ekleyin ve numuneyi sallayarak 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 40 milimolarlık son konsantrasyona iyodoasetamid eklemeden ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmeden önce numunenin oda sıcaklığında 10 dakika soğumasını bekleyin.Daha sonra numuneyi 50 milimolar amonyum bikarbonat tamponu ile bir molar ürenin altına seyreltin. 50 mikrogram başlangıç proteini için veya numuneye 1:50 tripsin / protein oranında bir mikrogram tripsin ekleyin. Numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, proteinleri peptitlere sindirmek için sallayın.Ertesi gün, protein sindirimini söndürmek için numunenin hacmine göre% 1'e formik asit ekleyin. Numune temizliği için, üreticinin yönergelerine uygun olarak, her numune için bir ekstraksiyon kartuşu kullanarak, bir vakum manifoldu üzerine katı fazlı bir ekstraksiyon kartuşu yerleştirin. Ekstraksiyondan sonra, peptit numunelerini vakum manifoldundan çıkarın ve bir vakum yoğunlaştırıcısında tamamen kurulayın.Kurutma yaklaşık üç saat sürer. Kütle spektrometrisi veya MS analizi için, peptid numunesini% 0.2'lik bir formik asit tamponunda mikrolitre başına 400 nanogram konsantrasyonunda yeniden askıya alın. Peptitleri çözündürmek için, numuneyi beş dakika karıştırın.Ardından, bir su banyosu sonicator'da beş dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra, çözünmeyen malzemeleri peletlemek için numuneyi santrifüj edin ve peptid süpernatantlarını MS şişelerine aktarın. Sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisi veya LC-MS-MS kullanarak proteomik analiz için numuneleri gönderin.Kütle spektrometresi tesisi tarafından hedeflenmemiş analiz için önerilen ayarları kullanın. Peptitleri organik ve inorganik çözücülerin bir karışımı kullanarak 90 dakikalık doğrusal bir gradyan üzerinde süzmek için numuneleri dakikada 400 nanolitre akış hızına sahip analitik bir sütuna yükleyin, organik çözücü% 5 ila% 35 arasında değişir Kütle spektrometrisi verilerini veriye bağımlı modda, sürekli bir MS1 anket taraması döngüsü ve ardından HCD parçalanması ile 20 veriye bağımlı MS2 taraması elde edin. Proteom Quantitation yazılım aracında ağır ve hafif peptidler için peptid tepe alanlarını ölçün.Ardından, ağır ve hafif peptit tepe bölgelerini dışa aktarın. Protein yarılanma ömürlerinin hesaplanması için, SILAC Analiz Çalışma Kitabını Ham Veri adlı ilk sayfaya açın ve UniProt ID'lerini, gen adlarını, ağır ve hafif tepe alanlarını belirtilen sütunlara yapıştırın. Ardından, Çözümleme adlı dördüncü sayfayı açın ve G ve H sütunlarının örneğin aralık dışında olduğunu gösterdiği satırları kaldırın ve aralık içinde okuyan satırları tutun.Yaşlanan fenotipler, yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz aktivitesi ve RT-qPCR analizi kullanılarak doğrulandı. Beta-galaktosidaz aktivitesi için, yaşlanan hücreler mavi görünürken, sessiz kontrol hücreleri hiç renge sahip değildi veya minimal renge sahipti. RT-qPCR analizinde, yaşlanan hücreler, sessiz hücrelere kıyasla daha yüksek interlökin-6, CXCL8 ve CDKN1A-P21 mRNA'ları gösterdi.Tersine, proliferasyon belirteci için lamin B1 kodlama seviyesi, yaşlanan hücrelerde düşüktü veya yoktu. Peptitlerin ekstrakte edilen iyon kromatogramları, ağır ve hafif peptit sinyallerinin göreceli oranını ortaya çıkardı. Hafif yaşlanan hücrelere göre daha düşük bir ağır peptit sinyali oranı, daha yavaş bir protein devir hızına işaret etti ve ışığa göre daha yüksek bir ağır peptit sinyali, daha hızlı bir protein devir hızına işaret etti.Etiketlenmemiş numuneler çok az veya hiç ağır peptit sinyali göstermedi. Kütle spektrometresi analizinden tanımlanan 695 proteinin yarı ömürleri hesaplandı. Yarılanma ömrü, sessiz hücreler üzerinde yaşlanan log-iki oranı olarak rapor edilir ve bir volkan grafiğinde çizilir.Yaşlanan hücrelerde protein devir hızlarının hesaplanmasını takiben, aşağı akış analizi, proteostaz mekanizmaları tarafından düzenlenen aday biyolojik yolları ortaya çıkarabilir. Pulse SILAC, araştırmacıların protein dinamiklerini benzeri görülmemiş granülerlik ve verimle incelemelerinin yolunu açtı ve birçok bireysel proteinde protein homeostazındaki değişiklikleri incelememizi sağladı.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize<em&gt; İn Vitro</em&gt; Hücre Kültürleri

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...