Name: single-molecule analysis of sf9 purified superprocessive kinesin-3 family motors
Uploaded: 2022-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors at JoVE.com

VS og P.S. takker prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) og prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, Indien) for deres ubetingede støtte gennem hele undersøgelsen. P.S. takker Dr. Sivapriya Kirubakaran for hendes støtte gennem hele projektet. VS anerkender finansiering gennem DBT (tilskudsnr.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 og BT/RLF/Re-entry/45/2015) og DST-SERB (tilskudsnr.: ECR/2016/000913). P.K.N anerkender ICMR til finansiering (tilskud nr. 5/13/13/2019 / NCD-III). P.S. anerkender finansiering fra DST (tilskudsnr.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S anerkender fællesskab fra IIT Gandhinagar.

1. Sf9-kultur, transfektion og virusgenerering
BEMÆRK: Vedligehold Sf9-celler i 30 ml Sf-900 / SFM-medium i 100 ml steril, engangskonisk kolbe uden antibiotika / antimykotisk middel ved 28 ° C. Hold suspensionskulturen i en orbital shaker ved 90 o / min. Levering af CO2 og fugtighedsvedligeholdelse er ikke påkrævet. Celler subkultureres normalt hver fjerde dag ved at inokulere 0,5 x 10 6 celler / ml for at nå 2,0 x 106 celler / ml tæthed p...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112, 467-480 (2003).</li><li>Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+kinesin+superfamily:+insights+into+structure+and+function.">Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function.</a> Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).</li><li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Hirokawa, N., Takemura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+and+mechanisms+of+directional+transport+in+neurons.">Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).</li><li>Patel, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF13A+motors+are+regulated+by+Rab22A+to+function+as+weak+dimers+inside+the+cell.">KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell.</a> Scientific Advances. 7 (6), (2021).</li><li>Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-based+transport+-+basic+mechanisms,+traffic+rules+and+role+in+neurological+pathogenesis.">Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis.</a> Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).</li><li>Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+neurodegenerative+disease:+vesicle-motor+complex+formation+and+their+regulation.">Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation.</a> Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).</li><li>Rath, O., Kozielski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesins+and+cancer.">Kinesins and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).</li><li>Wang, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF14+promotes+cell+proliferation+via+activation+of+Akt+and+is+directly+targeted+by+miR-200c+in+colorectal+cancer.">KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer.</a> International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).</li><li>Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Run+length+distribution+of+dimerized+kinesin-3+molecular+motors:+comparison+with+dimeric+kinesin-1.">Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).</li><li>Scarabelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+processivity+determinants+of+the+Kinesin-3+motor+domain.">Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).</li><li>Soppina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+mammalian+kinesin-3+motors+results+in+superprocessive+motion.">Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).</li><li>Soppina, V., Verhey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+family-specific+K-loop+influences+the+microtubule+on-rate+but+not+the+superprocessivity+of+kinesin-3+motors.">The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors.</a> Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).</li><li>Soppina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-3+motors+are+fine-tuned+at+the+molecular+level+to+endow+distinct+mechanical+outputs.">Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs.</a> BMC Biology. , (2022).</li><li>Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+Expressed+in+insect+cells+improves+microtubule+in+vitro+gliding+performance,+long-term+stability+and+guiding+efficiency+in+nanostructures.">Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).</li><li>Schmidt, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+expression+systems+in+the+pharmaceutical+industry.">Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).</li><li>Kurland, C., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+of+heterologous+protein+expression.">Errors of heterologous protein expression.</a> Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).</li><li>Tao, L., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+assay+of+mitotic+motors.">Purification and assay of mitotic motors.</a> Methods. 51 (2), 233-241 (2010).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Felberbaum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+system:+A+commercial+manufacturing+platform+for+viral+vaccines+and+gene+therapy+vectors.">The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors.</a> Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).</li><li>Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).</li><li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+probes+for+bioimaging+applications.">Development of fluorescent probes for bioimaging applications.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).</li><li>Hassan, M., Klaunberg, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+fluorescence+imaging+in+vivo.">Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo.</a> Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).</li><li>Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+biological+imaging.">Super-resolution microscopy for biological imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+ROS+production.">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biology. 2, 368-376 (2014).</li><li>Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+Kinesin+molecules+in+the+cytoplasm+of+mammalian+cells.">Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).</li><li>Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+temperature+on+kinesin-driven+microtubule+gliding+and+kinesin+ATPase+activity.">Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity.</a> FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).</li><li>Porter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+microtubule+movement+produced+by+sea+urchin+egg+kinesin.">Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Verma, S., Kumar, N., Verma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+paclitaxel+on+critical+nucleation+concentration+of+tubulin+and+its+effects+thereof.">Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).</li><li>Parness, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxol+binds+to+polymerized+tubulin+in+vitro.">Taxol binds to polymerized tubulin in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).</li><li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol.">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li><li>Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+human+(pro)renin+receptor+in+insect+cells+using+baculovirus+expression+system.">Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system.</a> Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).</li><li>Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+baculovirus+expression+system+for+generation+of+virus-like+particles:+successes+and+challenges.">Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges.</a> Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+tag+protein+fusions:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).</li><li>Huang, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+paclitaxel+induces+fewer+hematopoietic+and+cardiovascular+complications+than+bioequivalent+doses+of+Taxol.">Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol.</a> International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).</li></ol>

Sf9-baculovirusekspressionssystemet er en af de mest alsidige og succesrige metoder til proteinproduktion med høj kapacitet 19,36,37. Sf9-cellernes posttranslationelle modifikationsevne er meget sammenlignelig med pattedyrsystemet15. En væsentlig ulempe ved at bruge dette system er, at det er langsomt og følsomt over for forurening. Et af de mest kritiske trin er effektiv infektion og vellykket ekspres...

Et uhyre overfyldt cellemiljø udgør mange udfordringer ved sortering af bestemte proteiner og molekyler. Denne intense arbejdsbyrde med organisation og spatiotemporal fordeling af molekyler inden for cytoplasmaet lettes af molekylære motorer og cytoskeletale spor. Molekylære motorer er de enzymer, der hydrolyserer energivalutaerne som ATP og udnytter denne energi under bevægelses- og kraftgenerering1. Baseret på aminosyresekvensens lighed grupperes kinesiner i 14 familier, og på trods af denne lighed bidrager hver motor unikt til en celles funktion. Kinesin-3-familiemotorer udgør en af de største, der består af fem underfamilier (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 og KIF28)2, der er forbundet med forskellige cellulære og fysiologiske funktioner, herunder vesikeltransport, signalering, mitose, nuklear migration og udvikling 3,4,5. Svækkelse i kinesin-3 transportfunktion implicerer i mange neurodegenerative lidelser, udviklingsfejl og kræftsygdomme 6,7,8,9.
Nyligt arbejde har vist, at kinesin-3-motorer er monomerer, men gennemgår lastinduceret dimerisering og resulterer i hurtig og superprocessiv bevægelighed sammenlignet med konventionel kinesin10,11,12,13. Deres biokemiske og biofysiske karakterisering har brug for en stor mængde oprensede, aktive proteiner. Imidlertid resulterede deres produktion i det prokaryote ekspressionssystem i inaktive eller aggregerede motorer, formodentlig på grund af inkompatible proteinsyntese-, folde- og modifikationsmaskiner 14,15,16,17,18. For at omgå sådanne begrænsninger og øge udbyttet har vi her etableret et robust Sf9-baculovirus-ekspressionssystem til at udtrykke og rense disse motorer.
Baculovirusekspressionssystemet bruger Sf9-insektcellelinjer som værtssystem til eukaryot rekombinant proteinekspression med høj kapacitet19,20. Baculovirus besidder en stærk polyhedrinpromotor, der hjælper med heterolog genekspression og produktion af opløselige rekombinante proteiner17. På grund af dets omkostningseffektivitet, sikker at håndtere og høje mængde aktivt proteinudtryk er det blevet et kraftfuldt værktøj21. For at udtrykke et protein af interesse er et vigtigt skridt at generere et rekombinant bacmid. Da de kommercielt tilgængelige bacmid-genereringssæt er dyre, og vi vil arbejde med flere prøver, udviklede vi en intern protokol til både store og små indsatser af kinesin-3-motorer i bacmider. Sf9-oprensede kinesin-3-motorer blev brugt til at karakterisere in vitro-enkeltmolekyle og multimotoriske mikrotubuli-glideegenskaber ved anvendelse af total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Motorer er C-terminalt mærket med 3-tandem fluorescerende molekyler (3xmCit) for at give forbedret signal og nedsat fotobleaching. På grund af dets øgede signal-støj-forhold, mindre fototoksicitet og selektiv billeddannelse af et meget lille område tæt på dækslippet er TIRF-billeddannelse blevet brugt i vid udstrækning til at visualisere proteindynamik på enkeltmolekyleniveau in vivo og in vitro.
Denne undersøgelse diskuterer oprensning af kinesin-3-motorer ved at anvende Sf9-baculovirusekspressionssystem og in vitro-enkeltmolekylebilleddannelse og multimotorisk glideanalyse af motorer ved hjælp af TIRF-mikroskopi. Alt i alt viser denne undersøgelse, at bevægelighedsegenskaberne ved Sf9-rensede motorer er identiske med motorer fremstillet af pattedyrcellelysater. Derfor mener vi, at Sf9-baculovirus-systemet kan tilpasses til at udtrykke og rense ethvert motorprotein af interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sf9 culture and transfection materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M2 affinity</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>651502</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
			<td>For motility assay and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362100</td>
			<td>For Sf9 transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td>For motility assay mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Preparing lysing Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA 630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Preparing lysing buffer for Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td>For motility assay and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>For preparing lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>For preparing lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).</td>
			<td></td>
			<td>For baculovirs expression and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 culture bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4115-0125</td>
			<td>For suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900/SFM medium (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10902-096 -500ml</td>
			<td>For culturing Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td>Preparing lysing buffer for Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unsupplemented Grace&#8217;s media</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11595030 -500ml</td>
			<td>For Sf9 transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2647</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>For blocking motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For dissolving Rhodamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3777</td>
			<td>For preparing buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td>For microtubule polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767</td>
			<td>Preparing PIPES buffer pH 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubule gliding assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G&#160; needle</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td></td>
			<td>For shearing microtubules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3400</td>
			<td>For microtubule glidning assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobodies</td>
			<td>Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)</td>
			<td></td>
			<td>For attaching motors to the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46406</td>
			<td>For preparing labelling tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and other instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml&#160; disposable sterile pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul, 200ul, 1ml micropipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml concal tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm cell culture dish</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>15179-39</td>
			<td>For Sf9 culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td>0.01g-300g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop orbial shaking incubator</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 suspenculture at 28oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>EMCCD Andor iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging and acquesition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For making motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-548-5A</td>
			<td>size; 22X30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>For making motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Neuation</td>
			<td></td>
			<td>Dissolving paraffin wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti- U</td>
			<td></td>
			<td>To check protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasers</td>
			<td>488nm (100mW)</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sample freezing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary loading tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022491920</td>
			<td>For shearing microtubules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini spin</td>
			<td>Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd</td>
			<td></td>
			<td>For quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima UltraCentrifuge XE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coring 430</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette-boy</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST8R centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For microtubule polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>SW60Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Neuation</td>
			<td></td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V001228</td>
			<td>To seal motility chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule analysis of sf9 purified superprocessive kinesin-3 family motors

Et komplekst cellulært miljø udgør udfordringer for enkeltmolekylemotilitetsanalyse. Imidlertid har fremskridt inden for billeddannelsesteknikker forbedret enkeltmolekylestudier og har vundet enorm popularitet i detektion og forståelse af den dynamiske opførsel af fluorescerende mærkede molekyler. Her beskriver vi en detaljeret metode til in vitro enkeltmolekylestudier af kinesin-3 familiemotorer ved hjælp af total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Kinesin-3 er en stor familie, der spiller kritiske roller i cellulære og fysiologiske funktioner lige fra intracellulær godstransport til celledeling til udvikling. Vi har tidligere vist, at konstitutivt aktive dimere kinesin-3-motorer udviser hurtig og superprocessiv bevægelighed med høj mikrotubuliaffinitet på enkeltmolekyleniveau ved anvendelse af cellelysater fremstillet ved at udtrykke motor i pattedyrceller. Vores laboratorium studerer kinesin-3-motorer og deres reguleringsmekanismer ved hjælp af cellulære, biokemiske og biofysiske tilgange, og sådanne undersøgelser kræver oprensede proteiner i stor skala. Ekspression og oprensning af disse motorer ved hjælp af pattedyrceller ville være dyrt og tidskrævende, mens ekspression i et prokaryot ekspressionssystem resulterede i signifikant aggregeret og inaktivt protein. For at overvinde begrænsningerne ved bakterielle rensningssystemer og pattedyrcellelysat har vi etableret et robust Sf9-baculovirusekspressionssystem til at udtrykke og rense disse motorer. Kinesin-3-motorerne er C-terminalt mærket med 3-tandem fluorescerende proteiner (3xmCitirine eller 3xmCit), der giver forbedrede signaler og nedsat fotobleaching. In vitro enkeltmolekyle og multimotorisk glideanalyse af Sf9 oprensede proteiner viser, at kinesin-3 motorer er hurtige og superprocessive i lighed med vores tidligere undersøgelser ved hjælp af pattedyrcellelysater. Andre applikationer, der bruger disse assays, omfatter detaljeret viden om oligomerforhold for motorer, specifikke bindingspartnere parallelt med biokemiske undersøgelser og deres kinetiske tilstand.

For at udtrykke og rense aktive og funktionelle rekombinante motorproteiner i stor skala ved hjælp af Sf9-baculovirusekspressionen har systemet brug for generering af virale partikler, der stabilt bærer en kodende sekvens for at inficere Sf9-celler. For at opnå dette blev Sf9-celler transficeret med rekombinant bacmidkodning KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG. Efter 72 timer viste en signifikant population af celler ekspression af grønt fluorescerende protein (mCitrine) med forstørrede celler og kerner (figur <strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors at JoVE.com

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

Denne undersøgelse beskriver oprensning af KIF1A (1-393LZ), et medlem af kinesin-3-familien, ved hjælp af Sf9-baculovirusekspressionssystem. In vitro enkeltmolekyle og multimotorisk glideanalyse af disse oprensede motorer udviste robuste bevægelighedsegenskaber, der kan sammenlignes med motorer fra pattedyrcellelysat. Således er Sf9-baculovirus-systemet egnet til at udtrykke og rense motorprotein af interesse.

Enkeltmolekyleanalyse af Sf9 rensede superprocessive Kinesin-3-familiemotorer

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Protokollen tilbyder en enkel metode til rensning af aktive molekylære motorer ved hjælp af Sf9 baculovirussystem. Det beskriver også enkeltmolekylemotilitet og multimotoriske glidende assays for at studere reguleringsmekanismen for motorproteiner. Alt det traditionelle vektorudtryk Sf9 baculovirusekspression og enkelttrins affinitetsoprensning vil føre rent og aktivt motorprotein til at studere de mekanistiske detaljer af superprocessive kinesiner i enkeltmolekyle og multimotoriske systemer.Ud over Kinesin-motorer kan protokollen anvendes til at studere biokemiske og biofysiske egenskaber af andre cytoskeletale baserede proteiner såsom dionine og myosin. Protokollen er detaljeret og let at følge. Nogle forslag er at håndtere Sf9-celler omhyggeligt, da de er tilbøjelige til forurening, og at følge noter i protokollen.Visuel demonstration er yderst effektiv, let at følge og forstå de kritiske trin, især for dem, der aldrig har udført disse assays. Pushpanjali Soppina og Dipeshwari Shewale, ph.d.-studerende, der arbejder sammen med mig og Pradeep Naik, demonstrerer proceduren. Til at begynde med frø cellerne i en 35 ml skål med en tæthed på 4,5 gange 10 til de femte celler pr. Milliliter.Efter 24 timer blandes et mikrogram bacmid-DNA og 100 mikroliter ikke-suppleret Graces medier i et rør. Bland seks mikroliter transfektionsreagens i et andet rør med 100 mikroliter ikke-suppleret Graces medier. Overfør forsigtigt indholdet af det første rør til det andet rør.Bland dem og inkuber blandingen i 45 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt 0,8 ml usuppleret Graces medie til blandingen. Bland og aspirer Sf900 SFM-mediet fra cellerne.Tilsæt det forberedte transfektionsmedie dråbevis på toppen af cellerne og inkuber pladen i seks timer. Fjern derefter forsigtigt transfektionsblandingen. Tilsæt to milliliter SF900 SFM-medier og inkuber yderligere ved 28 grader Celsius i 48 timer.Kontroller derefter motorproteinekspressionen under et omvendt fluorescensmikroskop. Høst mediet med inficerede celler, og drej i fem minutter ved 500 G.Saml supernatanten og fastfrys aliquoterne. Tilsæt 10 ml SF900 SFM-medier med celler og en milliliter P-nul-viruslager i en steril, 100 milliliter, konisk kolbe.Inkuberes ved 28 grader Celsius med konstant omrystning ved 90 o / min. Efter 72 timer skal du dreje cellerne ned i et 15 milliliter, sterilt konisk rør ved 500 G i fem minutter og samle supernatanten. For storskala proteinudtryk inficeres 30 ml af suspensionskulturen med en milliliter P1-stamvirus.72 timer efter infektion kontrolleres cellerne for proteinekspression og cellerne samles i sterile, 50 milliliter, koniske rør. Efter spinding kasseres supernatanten og opsamles cellepellet. For at lyse cellerne tilsættes tre milliliter iskold lysisbuffer til cellepelleten.Drej cellelysatet ved 150.000 G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Saml supernatanten og bland den med 40 mikroliter 50% ANTI-FLAG M2 affinitetsharpiks. Inkuber blandingen ved fire grader Celsius i tre timer med ende-til-ende tumling.Pellet nu FLAG-harpiksen ved at dreje ved 500 G i et minut ved fire grader Celsius. Vask FLAG-harpikspellet tre gange med iskold vaskebuffer. Og efter den tredje vask skal vaskebufferen forsigtigt tømmes.Derefter tilsættes 70 mikroliter vaskebuffer indeholdende 100 mikrogram pr. milliliter FLAG-peptid til harpikspilleren, og inkuberes natten over ved fire grader Celsius, som vist tidligere. Efter spinding samles supernatanten indeholdende renset protein i et frisk rør. Forbered en polymerisationsblanding som beskrevet i manuskriptet, og tilsæt 10 mikroliter tubulin til polymerisationsblandingen.Overfør røret til en varmeblok, forvarmet ved 37 grader Celsius, og inkuber i 30 minutter. Efter fremstilling af mikrotubulusstabiliseringsbufferen opvarmes den og tilsættes den til de polymeriserede mikrotubuli. Når bevægelighedsstrømcellekammeret er forberedt, strømmer 30 mikroliter fortyndet mikrotubulusopløsning gennem kammeret.Efter 30 minutter strømmer 40 til 50 mikroliter blokerende buffer og inkuberer den. Forbered en motilitetsblanding og tilsæt en mikroliter af den rensede motor til den. Bland godt og flow opløsningen ind i bevægelighedskammeret.Forsegl begge ender af bevægelighedskammeret og billedet under TIRF-belysning. Fokuser på de enkelte mCitirine mærkede motorer, der bevæger sig processivt. Bland rhodamin mærket tubulin med umærket tubulin i et forhold på en til 10.Efter 30 minutters polymerisation tilsættes forsigtigt 30 mikroliter forvarmet mikrotubulistabiliseringsbuffer og inkuberes yderligere i fem minutter ved 37 grader Celsius. Forskydning af mikrotubuli ved at pipettere med kapillærbelastningsspidsen. Efter forberedelse af bevægelighedsstrømningskammeret strømmer 50 mikroliter Sf9 rensede GFP-nanolegemer og inkuberes i 30 minutter.Bloker dækslets glideoverflade ved at flyde 50 mikroliter blokbuffer. Forbered 50 mikroliter af motorblandingen. Flow det ind i kammeret efter forsigtig blanding af opløsningen og inkuberes i 30 minutter.Vask kammeret to gange med 50 mikroliter P12-kasein. Forbered glideassayblandingen og bland den forsigtigt, inden den strømmer ind i bevægelighedskammeret. Forsegl enderne af bevægelighedskammeret, og billedmikrotubulus glider under TIRF-belysning.Efter 48 timers transfektion fremstår de utransficerede celler små, runde og fastgjorte. Imidlertid var de transinficerede celler, der udtrykte protein, løst fastgjort til overfladen og viste forstørret cellediameter. Efter 72 timer udtrykte mere end 90% af Sf9-cellerne fluorescerende mærket, kinesin-3-motor KIF1A, og celler var løst bundet til overfladen.Kinesin-3 motorprotein blev oprenset fra de transinficerede Sf9-celler. Kymografen viser kinesin-3 motor, der går processivt langs mikrotubulusoverfladen. Motilitetshændelser viste en gennemsnitlig hastighed og løbelængde på henholdsvis ca. 2,44 mikrometer i sekundet og 10,79 mikrometer.Kymografen indikerer glat mikrotubuliglidning af kinesin-3-motorerne med en gennemsnitlig hastighed på ca. 1,37 mikrometer pr. Sekund. Det vigtigste er at tilføje stabiliseringsbufferen uden at forstyrre mikrotubulusblandingen og ikke at skære mikrotubuli. Protokollen ville være nyttig til andre anvendelser, såsom ATPase-målinger, biofysisk analyse, mekanismer, in vitro-rekonstitutionsassays osv.Ved hjælp af sf9 rensede motorer har vi for nylig demonstreret, at kinesin-3-motorer er hurtige og superprocessive. Interessant nok udviser disse motorer høje ATP-omsætningshastigheder sammenlignet med velkarakteriseret motor, Kinesin-1.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Enkelt-molekyle Manipulation af G-quadruplexes af magnetiske pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Ved hjælp af trefarvet enkelt-molekyle FRET at studere sammenhængen af Protein interaktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Konventionelle BODIPY konjugatter til Live-Cell Super-Resolution mikroskopi og Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En In Vitro Single-Molecule Imaging Assay til analyse af cap-afhængige oversættelse kinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...