Name: single-molecule analysis of sf9 purified superprocessive kinesin-3 family motors
Uploaded: 2022-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors at JoVE.com

V.S. e P.S. ringraziano il Prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) e il Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) per il loro sostegno incondizionato durante lo studio. P.S. ringrazia la dottoressa Sivapriya Kirubakaran per il suo supporto durante tutto il progetto. V.S. riconosce il finanziamento tramite DBT (Grant No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 e BT/RLF/Re-entry/45/2015) e DST-SERB (Grant No.: ECR/2016/000913). P.K.N riconosce ICMR per il finanziamento (sovvenzione n. 5/13/13/2019 / NCD-III). P.S. riconosce il finanziamento dell'ora legale (Grant No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S riconosce la fellowship di IIT Gandhinagar.

1. Cultura Sf9, trasfezione e generazione di virus
NOTA: Mantenere le cellule Sf9 in 30 mL di terreno Sf-900/SFM in matraccio conico sterile monouso da 100 mL senza antibiotico/antimicotico a 28 °C. Mantenere la coltura delle sospensioni in uno shaker orbitale a 90 giri/min. Non è richiesta la fornitura di CO2 e il mantenimento dell'umidità. Le cellule vengono solitamente subcoltivate ogni quarto giorno inoculando 0,5 x 10 6 cellule / ml per raggiungere...

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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+paclitaxel+induces+fewer+hematopoietic+and+cardiovascular+complications+than+bioequivalent+doses+of+Taxol.">Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol.</a> International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).</li></ol>

Il sistema di espressione del baculovirus Sf9 è uno dei metodi più versatili e di successo per la produzione di proteine ad alto rendimento 19,36,37. La capacità di modificazione post-traduzionale delle cellule Sf9 è altamente paragonabile al sistema dei mammiferi15. Uno svantaggio considerevole dell'utilizzo di questo sistema è che è lento e sensibile alla contaminazione. Uno dei passaggi più crit...

Un ambiente cellulare immensamente affollato pone molte sfide nella selezione di proteine e molecole destinate. Questo intenso carico di lavoro di organizzazione e distribuzione spaziotemporale delle molecole all'interno del citoplasma è facilitato dai motori molecolari e dalle tracce citoscheletriche. I motori molecolari sono gli enzimi che idrolizzano le valute energetiche come l'ATP e utilizzano quell'energia durante la generazione di movimento e forza1. Sulla base della somiglianza della sequenza di aminoacidi, le chinesine sono raggruppate in 14 famiglie e, nonostante questa somiglianza, ogni motore contribuisce in modo univoco al funzionamento di una cellula. I motori della famiglia Kinesin-3 costituiscono uno dei più grandi, comprendente cinque sottofamiglie (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 e KIF28)2, associate a diverse funzioni cellulari e fisiologiche, tra cui il trasporto delle vescicole, la segnalazione, la mitosi, la migrazione nucleare e lo sviluppo 3,4,5. La compromissione della funzione di trasporto della chinesina-3 è implicata in molti disturbi neurodegenerativi, difetti dello sviluppo e malattie tumorali 6,7,8,9.
Recenti lavori hanno dimostrato che i motori della chinesina-3 sono monomeri ma subiscono una dimerizzazione indotta dal carico e determinano una motilità rapida e superprocessiva rispetto alla chinesina convenzionale10,11,12,13. La loro caratterizzazione biochimica e biofisica richiede una grande quantità di proteine attive purificate. Tuttavia, la loro produzione nel sistema di espressione procariotica ha portato a motori inattivi o aggregati, presumibilmente a causa di incompatibili meccanismi di sintesi proteica, ripiegamento e modifica 14,15,16,17,18. Per aggirare tali limitazioni e aumentare la resa, qui abbiamo stabilito un robusto sistema di espressione del baculovirus Sf9 per esprimere e purificare questi motori.
Il sistema di espressione del baculovirus utilizza linee cellulari di insetti Sf9 come sistema ospite per l'espressione della proteina ricombinante eucariotica ad alto rendimento 19,20. Il baculovirus possiede un forte promotore della poliedrina che assiste nell'espressione genica eterologa e nella produzione di proteine ricombinanti solubili17. Grazie alla sua economicità, alla sicurezza da maneggiare e all'elevata quantità di espressione proteica attiva, è diventato uno strumento potente21. Per esprimere una proteina di interesse, un passo fondamentale è generare un bacmide ricombinante. Poiché i kit di generazione di bacmidi disponibili in commercio sono costosi e lavoreremo con più campioni, abbiamo sviluppato un protocollo interno per inserti grandi e piccoli di motori kinesin-3 nei batteridi. I motori kinesin-3 purificati con sf9 sono stati utilizzati per caratterizzare in vitro le proprietà di scorrimento dei microtubuli a singola molecola e multimotore utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). I motori sono marcati C-terminalmente con molecole fluorescenti a 3 tandem (3xmCit) per fornire un segnale migliorato e una riduzione del fotosbiancamento. Grazie al suo maggiore rapporto segnale-rumore, alla minore fototossicità e all'imaging selettivo di un'area molto piccola vicino al vetrino, l'imaging TIRF è stato ampiamente utilizzato per visualizzare la dinamica delle proteine a livello di singola molecola in vivo e in vitro.
Questo studio discute la purificazione dei motori kinesin-3 impiegando il sistema di espressione del baculovirus Sf9 e l'imaging a singola molecola in vitro e l'analisi multi-motore dei motori utilizzando la microscopia TIRF. Nel complesso, questo studio mostra che le proprietà di motilità dei motori purificati Sf9 sono identiche a quelle dei motori preparati da lisati cellulari di mammifero. Pertanto, riteniamo che il sistema Sf9-baculovirus possa essere adattato per esprimere e purificare qualsiasi proteina motoria di interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sf9 culture and transfection materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M2 affinity</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>651502</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
			<td>For motility assay and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362100</td>
			<td>For Sf9 transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td>For motility assay mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Preparing lysing Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA 630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Preparing lysing buffer for Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td>For motility assay and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>For preparing lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>For preparing lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).</td>
			<td></td>
			<td>For baculovirs expression and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 culture bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4115-0125</td>
			<td>For suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900/SFM medium (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10902-096 -500ml</td>
			<td>For culturing Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td>Preparing lysing buffer for Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unsupplemented Grace&#8217;s media</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11595030 -500ml</td>
			<td>For Sf9 transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2647</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>For blocking motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For dissolving Rhodamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3777</td>
			<td>For preparing buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td>For microtubule polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767</td>
			<td>Preparing PIPES buffer pH 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubule gliding assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G&#160; needle</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td></td>
			<td>For shearing microtubules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3400</td>
			<td>For microtubule glidning assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobodies</td>
			<td>Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)</td>
			<td></td>
			<td>For attaching motors to the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46406</td>
			<td>For preparing labelling tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and other instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml&#160; disposable sterile pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul, 200ul, 1ml micropipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml concal tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm cell culture dish</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>15179-39</td>
			<td>For Sf9 culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td>0.01g-300g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop orbial shaking incubator</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 suspenculture at 28oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>EMCCD Andor iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging and acquesition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For making motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-548-5A</td>
			<td>size; 22X30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>For making motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Neuation</td>
			<td></td>
			<td>Dissolving paraffin wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti- U</td>
			<td></td>
			<td>To check protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasers</td>
			<td>488nm (100mW)</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sample freezing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary loading tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022491920</td>
			<td>For shearing microtubules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini spin</td>
			<td>Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd</td>
			<td></td>
			<td>For quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima UltraCentrifuge XE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coring 430</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette-boy</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST8R centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For microtubule polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>SW60Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Neuation</td>
			<td></td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V001228</td>
			<td>To seal motility chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule analysis of sf9 purified superprocessive kinesin-3 family motors

Un ambiente cellulare complesso pone sfide per l'analisi della motilità di singole molecole. Tuttavia, i progressi nelle tecniche di imaging hanno migliorato gli studi sulle singole molecole e hanno guadagnato un'immensa popolarità nel rilevare e comprendere il comportamento dinamico delle molecole marcate con fluorescenza. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per studi in vitro a singola molecola di motori della famiglia kinesin-3 utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). Kinesin-3 è una grande famiglia che svolge ruoli critici nelle funzioni cellulari e fisiologiche che vanno dal trasporto intracellulare del carico alla divisione cellulare allo sviluppo. Abbiamo dimostrato in precedenza che i motori della chinesina-3 dimerica costitutivamente attivi mostrano una motilità veloce e superprocessiva con elevata affinità microtubulare a livello di singola molecola utilizzando lisati cellulari preparati esprimendo motori in cellule di mammifero. Il nostro laboratorio studia i motori della chinesina-3 e i loro meccanismi di regolazione utilizzando approcci cellulari, biochimici e biofisici, e tali studi richiedono proteine purificate su larga scala. L'espressione e la purificazione di questi motori utilizzando cellule di mammifero sarebbe costosa e richiederebbe molto tempo, mentre l'espressione in un sistema di espressione procariotica ha portato a proteine significativamente aggregate e inattive. Per superare i limiti posti dai sistemi di purificazione batterica e dal lisato cellulare di mammifero, abbiamo stabilito un robusto sistema di espressione del baculovirus Sf9 per esprimere e purificare questi motori. I motori kinesin-3 sono marcati C-terminalmente con proteine fluorescenti 3-tandem (3xmCitirine o 3xmCit) che forniscono segnali potenziati e diminuzione del fotosbiancamento. L'analisi in vitro di scorrimento a singola molecola e multimotore di proteine purificate Sf9 dimostra che i motori della kinesina-3 sono veloci e superprocessivi simili ai nostri studi precedenti che utilizzano lisati cellulari di mammifero. Altre applicazioni che utilizzano questi saggi includono una conoscenza dettagliata delle condizioni oligomeriche dei motori, partner di legame specifici paralleli agli studi biochimici e il loro stato cinetico.

Per esprimere e purificare le proteine motorie ricombinanti attive e funzionali su larga scala utilizzando l'espressione del baculovirus Sf9, il sistema ha bisogno della generazione di particelle virali che trasportano stabilmente una sequenza codificante per infettare le cellule Sf9. Per raggiungere questo obiettivo, le cellule Sf9 sono state trasfettate con bacmide ricombinante codificante KIF1A (1-393LZ)-3xmCit-FLAG. Dopo 72 ore, una popolazione significativa di cellule ha mostrato espressione di proteina fluorescente...

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Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

Questo studio descrive in dettaglio la purificazione di KIF1A (1-393LZ), un membro della famiglia kinesin-3, utilizzando il sistema di espressione del baculovirus Sf9. L'analisi in vitro di scorrimento monomolecola e multimotore di questi motori purificati ha mostrato robuste proprietà di motilità paragonabili ai motori del lisato cellulare di mammifero. Pertanto, il sistema Sf9-baculovirus è suscettibile di esprimere e purificare la proteina motoria di interesse.

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Il protocollo offre un metodo semplice per purificare i motori molecolari attivi utilizzando il sistema baculovirus Sf9. Descrive anche la motilità di singole molecole e saggi di scorrimento multi-motore per studiare il meccanismo di regolazione delle proteine motorie. Tutta l'espressione tradizionale del vettore Sf9 di espressione del baculovirus e la purificazione dell'affinità a singolo passo, porteranno la proteina motoria pura e attiva a studiare i dettagli meccanicistici delle chinesine superprocessive in sistemi monomolecolari e multi-motori.Oltre ai motori Kinesin, il protocollo può essere applicato per studiare le proprietà biochimiche e biofisiche di altre proteine a base citoscheletrica come la dionina e la miosina. Il protocollo è dettagliato e facile da seguire. Alcuni suggerimenti sono di maneggiare attentamente le cellule Sf9 in quanto sono soggette a contaminazione e di seguire le note fornite nel protocollo.La dimostrazione visiva è altamente efficace, facile da seguire e comprendere i passaggi critici, soprattutto per coloro che non hanno mai eseguito questi test. A dimostrare la procedura saranno Pushpanjali Soppina e Dipeshwari Shewale, dottorandi che lavorano con me e Pradeep Naik. Per iniziare, seminare le cellule in un piatto da 35 millilitri, ad una densità di 4,5 volte 10 alla quinta cella per millilitro.Dopo 24 ore, mescolare un microgrammo di DNA bacmidico e 100 microlitri di supporti Grace non integrati in un tubo. Mescolare sei microlitri di reagente di trasfezione in un'altra provetta con 100 microlitri di supporto Grace non integrato. Trasferire con attenzione il contenuto del primo tubo nel secondo tubo.Mescolarli e incubare il composto per 45 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 0,8 millilitri di supporti Grace non integrati alla miscela. Miscelare e aspirare il fluido SFM Sf900 dalle celle.Aggiungere il mezzo di trasfezione preparato goccia a goccia sulla parte superiore delle cellule e incubare la piastra per sei ore. Quindi rimuovere con attenzione la miscela di trasfezione. Aggiungere due millilitri di materiale SF900 SFM e incubare ulteriormente a 28 gradi Celsius per 48 ore.Quindi, controllare l'espressione della proteina motoria al microscopio a fluorescenza invertita. Raccogliere il terreno con le cellule infette e girare per cinque minuti, a 500 G.Raccogliere il surnatante e congelare le aliquote. Aggiungere 10 millilitri di materiale SFM SF900 con cellule e un millilitro di materiale virale P-zero, in un matraccio conico sterile da 100 millilitri.Incubare a 28 gradi Celsius con agitazione costante a 90 giri / min. Dopo 72 ore, ruotare le cellule in un tubo conico sterile da 15 millilitri a 500 G per cinque minuti e raccogliere il surnatante. Per l'espressione proteica su larga scala, infettare 30 millilitri della coltura in sospensione con un millilitro di virus stock P1.72 ore dopo l'infezione, controllare le cellule per l'espressione proteica e raccogliere le cellule in tubi conici sterili, 50 millilitri. Dopo la centrifuga, scartare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare. Per lisare le cellule, aggiungere tre millilitri di tampone di lisi ghiacciato al pellet cellulare.Ruotare il lisato cellulare a 150.000 G per 30 minuti, a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante e mescolarlo con 40 microlitri di resina di affinità 50% ANTI-FLAG M2. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius per tre ore con caduta end-to-end.Ora pellettare la resina FLAG ruotando a 500 G per un minuto a quattro gradi Celsius. Lavare il pellet di resina FLAG tre volte con tampone di lavaggio ghiacciato. E dopo il terzo lavaggio, drenare accuratamente il tampone di lavaggio.Quindi, aggiungere 70 microlitri di tampone di lavaggio contenente 100 microgrammi per millilitro di peptide FLAG, al pellet di resina, e incubare per una notte a quattro gradi Celsius, come dimostrato in precedenza. Dopo la centrifuga, raccogliere il surnatante contenente proteine purificate in un tubo fresco. Preparare una miscela di polimerizzazione come descritto nel manoscritto e aggiungere 10 microlitri di tubulina alla miscela di polimerizzazione.Trasferire il tubo in un blocco termico, preriscaldato a 37 gradi Celsius, e incubare per 30 minuti. Dopo aver preparato il tampone di stabilizzazione dei microtubuli, riscaldarlo e aggiungerlo ai microtubuli polimerizzati. Una volta preparata la camera della cella di flusso della motilità, far scorrere 30 microlitri di soluzione di microtubuli diluiti attraverso la camera.Dopo 30 minuti, far scorrere da 40 a 50 microlitri di tampone bloccante e incubarlo. Preparare una miscela di motilità e aggiungere un microlitro del motore purificato ad esso. Mescolare bene e far scorrere la soluzione nella camera di motilità.Sigillare entrambe le estremità della camera di motilità e dell'immagine sotto l'illuminazione TIRF. Concentrati sui singoli motori etichettati mCitirine, che si muovono in modo elaborativo. Mescolare la tubulina marcata con rodamina con tubulina non etichettata in un rapporto di uno a 10.Dopo 30 minuti di polimerizzazione, aggiungere delicatamente 30 microlitri di tampone di stabilizzazione dei microtubuli preriscaldato e incubare ulteriormente, per cinque minuti, a 37 gradi Celsius. Tagliare i microtubuli mediante pipettaggio con la punta di carico capillare. Dopo aver preparato la camera di flusso della motilità, far scorrere 50 microlitri di nanocorpi GFP purificati Sf9 e incubare per 30 minuti.Bloccare la superficie di scorrimento del coperchio facendo scorrere 50 microlitri di tampone del blocco. Preparare 50 microlitri della miscela del motore. Farlo scorrere nella camera dopo aver mescolato delicatamente la soluzione e incubare per 30 minuti.Lavare la camera, due volte, con 50 microlitri di P12-caseina. Preparare la miscela di saggio scorrevole e mescolarla delicatamente, prima di farla scorrere nella camera di motilità. Sigillare le estremità della camera di motilità e visualizzare i microtubuli che scivolano sotto l'illuminazione TIRF.Dopo 48 ore di trasfezione, le cellule non trasfettate appaiono piccole, rotonde e saldamente attaccate. Tuttavia, le cellule trasfettate che esprimevano proteine, erano vagamente attaccate alla superficie e mostravano un diametro cellulare allargato. Dopo 72 ore, oltre il 90% delle cellule Sf9 esprimeva il motore KIF1A con tag fluorescente, la kinesina-3 e le cellule erano debolmente legate alla superficie.La proteina motoria kinesina-3 è stata purificata dalle cellule Sf9 trasfettate. Il cimografo raffigura il motore della kinesina-3 che cammina in modo elaborativo, lungo la superficie del microtubulo. Gli eventi di motilità hanno mostrato una velocità media e una lunghezza di corsa di circa 2,44 micrometri al secondo e 10,79 micrometri rispettivamente.Il cimografo indica lo scorrimento regolare dei microtubuli da parte dei motori della kinesina-3, con una velocità media di circa 1,37 micrometri al secondo. La cosa più importante è aggiungere il tampone di stabilizzazione senza disturbare la miscela di microtubuli e non tagliare il microtubulo. Il protocollo sarebbe utile per altre applicazioni, come misure di ATPasi, analisi biofisiche, meccanismi, saggi di ricostituzione in vitro, eccetera.Utilizzando motori purificati sf9, abbiamo recentemente dimostrato che i motori kinesin-3 sono veloci e superprocessivi. È interessante notare che questi motori presentano alti tassi di turnover ATP rispetto al motore ben caratterizzato, Kinesin-1.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Ricerca

Biochimica

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