Name: single-molecule analysis of sf9 purified superprocessive kinesin-3 family motors
Uploaded: 2022-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors at JoVE.com

V.S.とP.S.は、Kristen J. Verhey教授(ミシガン大学、米国ミシガン州アナーバー)とRoop Mallik教授(インド工科大学ボンベイ校(IITB)、ムンバイ、インド)の研究を通して無条件の支援に感謝します。P.S. シヴァプリヤ・キルバカラン博士のプロジェクト全体を通しての支援に感謝します。V.S.は、DBT(助成金番号:BT/PR15214/BRB/10/1449/2015およびBT/RLF/再入国/45/2015)およびDST-SERB(助成金番号:ECR/2016/000913)を通じた資金提供を認めています。P.K.Nは、ICMRの資金提供を認めています(助成金番号5/13/13/2019/NCD-III)。P.S. は DST からの資金提供を認めます (助成金番号: SR/WOS-A/LS-73/2017)。D.J.SはIITガンディナガルからのフェローシップを認めています。

1. Sf9培養、トランスフェクション、ウイルス生成
注:抗生物質/抗真菌剤を含まない100 mLの滅菌済みコニカルフラスコ内の30 mLのSf-900 / SFM培地中のSf9細胞を28°Cに維持します。 懸濁培養液を90rpmのオービタルシェーカーに保ちます。CO2の供給と湿度の維持は必要ありません。細胞は通常、4日目に2.0 x 10 6細胞/ mLの密度に達するために0.5 x 106細胞/ mL...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112, 467-480 (2003).</li><li>Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+kinesin+superfamily:+insights+into+structure+and+function.">Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function.</a> Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).</li><li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Hirokawa, N., Takemura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+and+mechanisms+of+directional+transport+in+neurons.">Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).</li><li>Patel, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF13A+motors+are+regulated+by+Rab22A+to+function+as+weak+dimers+inside+the+cell.">KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell.</a> Scientific Advances. 7 (6), (2021).</li><li>Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-based+transport+-+basic+mechanisms,+traffic+rules+and+role+in+neurological+pathogenesis.">Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis.</a> Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).</li><li>Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+neurodegenerative+disease:+vesicle-motor+complex+formation+and+their+regulation.">Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation.</a> Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).</li><li>Rath, O., Kozielski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesins+and+cancer.">Kinesins and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).</li><li>Wang, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF14+promotes+cell+proliferation+via+activation+of+Akt+and+is+directly+targeted+by+miR-200c+in+colorectal+cancer.">KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer.</a> International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).</li><li>Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Run+length+distribution+of+dimerized+kinesin-3+molecular+motors:+comparison+with+dimeric+kinesin-1.">Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).</li><li>Scarabelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+processivity+determinants+of+the+Kinesin-3+motor+domain.">Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).</li><li>Soppina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+mammalian+kinesin-3+motors+results+in+superprocessive+motion.">Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).</li><li>Soppina, V., Verhey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+family-specific+K-loop+influences+the+microtubule+on-rate+but+not+the+superprocessivity+of+kinesin-3+motors.">The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors.</a> Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).</li><li>Soppina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-3+motors+are+fine-tuned+at+the+molecular+level+to+endow+distinct+mechanical+outputs.">Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs.</a> BMC Biology. , (2022).</li><li>Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+Expressed+in+insect+cells+improves+microtubule+in+vitro+gliding+performance,+long-term+stability+and+guiding+efficiency+in+nanostructures.">Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).</li><li>Schmidt, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+expression+systems+in+the+pharmaceutical+industry.">Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).</li><li>Kurland, C., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+of+heterologous+protein+expression.">Errors of heterologous protein expression.</a> Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).</li><li>Tao, L., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+assay+of+mitotic+motors.">Purification and assay of mitotic motors.</a> Methods. 51 (2), 233-241 (2010).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Felberbaum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+system:+A+commercial+manufacturing+platform+for+viral+vaccines+and+gene+therapy+vectors.">The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors.</a> Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).</li><li>Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).</li><li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+probes+for+bioimaging+applications.">Development of fluorescent probes for bioimaging applications.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).</li><li>Hassan, M., Klaunberg, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+fluorescence+imaging+in+vivo.">Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo.</a> Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).</li><li>Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+biological+imaging.">Super-resolution microscopy for biological imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+ROS+production.">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biology. 2, 368-376 (2014).</li><li>Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+Kinesin+molecules+in+the+cytoplasm+of+mammalian+cells.">Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).</li><li>Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+temperature+on+kinesin-driven+microtubule+gliding+and+kinesin+ATPase+activity.">Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity.</a> FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).</li><li>Porter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+microtubule+movement+produced+by+sea+urchin+egg+kinesin.">Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Verma, S., Kumar, N., Verma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+paclitaxel+on+critical+nucleation+concentration+of+tubulin+and+its+effects+thereof.">Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).</li><li>Parness, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxol+binds+to+polymerized+tubulin+in+vitro.">Taxol binds to polymerized tubulin in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).</li><li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol.">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li><li>Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+human+(pro)renin+receptor+in+insect+cells+using+baculovirus+expression+system.">Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system.</a> Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).</li><li>Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+baculovirus+expression+system+for+generation+of+virus-like+particles:+successes+and+challenges.">Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges.</a> Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+tag+protein+fusions:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).</li><li>Huang, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+paclitaxel+induces+fewer+hematopoietic+and+cardiovascular+complications+than+bioequivalent+doses+of+Taxol.">Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol.</a> International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).</li></ol>

Sf9-バキュロウイルス発現システムは、ハイスループットタンパク質生産のための最も用途が広く成功した方法の1つです19、36、37。Sf9細胞の翻訳後修飾能は、哺乳動物系15と非常に同等である。このシステムを使用することのかなりの欠点は、それが遅く、汚染に敏感であることです。最も重要なステッ?...

非常に混雑した細胞環境は、運命のタンパク質や分子を選別する際に多くの課題をもたらします。細胞質内の分子の組織化と時空間分布のこの激しい作業負荷は、分子モーターと細胞骨格トラックによって促進されます。分子モーターは、ATPなどのエネルギー通貨を加水分解し、運動や力の生成中にそのエネルギーを利用する酵素です1。アミノ酸配列の類似性に基づいて、キネシンは14のファミリーにグループ化され、この類似性にもかかわらず、各モーターは細胞の機能に一意に貢献します。キネシン3ファミリーモーターは、5つのサブファミリー(KIF1、KIF13、KIF14、KIF16、KIF28)2からなる最大のモーターの1つであり、小胞輸送、シグナル伝達、有糸分裂、核移動、発生など、多様な細胞および生理学的機能に関連しています3,4,5。キネシン-3輸送機能の障害は、多くの神経変性疾患、発達障害、および癌疾患に関与しています6,7,8,9。
最近の研究では、キネシン-3モーターはモノマーであるが、貨物誘起二量体化を受け、従来のキネシン10,11,12,13と比較して高速で超加工的な運動性をもたらすことが実証されている。それらの生化学的および生物物理学的特性評価には、大量の精製された活性タンパク質が必要です。しかし、原核生物発現系におけるそれらの産生は、おそらく不適合なタンパク質合成、折り畳みおよび修飾機構のために、不活性または凝集したモーターをもたらした14,15,16,17,18。このような制限を回避し、収量を増やすために、ここでは、これらのモーターを発現および精製するための堅牢なSf9バキュロウイルス発現システムを確立しました。
バキュロウイルス発現システムは、ハイスループット真核生物組換えタンパク質発現のための宿主系としてSf9昆虫細胞株を使用する19,20。バキュロウイルスは、異種遺伝子発現と可溶性組換えタンパク質の産生を補助する強力なポリヘドリンプロモーターを持っています17。その費用対効果、取り扱いが安全で、かつ大量の活性タンパク質発現のために、それは強力なツール21となっている。目的のタンパク質を発現させるための重要なステップは、組換えバクミドを生成することです。市販のバクミド生成キットは高価であり、より多くのサンプルを扱うため、キネシン-3モーターをバクミドに大小両方のインサートするための社内プロトコルを開発しました。Sf9精製されたキネシン-3モーターを使用して、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用してin vitroの単一分子およびマルチモーター微小管滑走特性を特徴付けました。モーターは、3タンデム蛍光分子(3xmCit)でC末端にタグ付けされており、シグナルを強化し、光退色を低減します。TIRFイメージングは、シグナル対ノイズ比の増加、光毒性の低減、カバーガラスに近い非常に小さな領域の選択的イメージングにより、in vivoおよびin vitroで単一分子レベルでタンパク質動態を視覚化するために広く使用されています。
本研究では、Sf9バキュロウイルス発現系を用いたキネシン3モーターの精製と、TIRF顕微鏡を用いたモーターの in vitro 単一分子イメージングおよびマルチモーター滑空解析について説明します。全体として、この研究は、Sf9精製モーターの運動特性が哺乳類細胞溶解物から調製されたモーターの運動特性と同一であることを示しています。したがって、Sf9-バキュロウイルスシステムは、目的のモータータンパク質を発現および精製するように適応できると考えています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sf9 culture and transfection materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M2 affinity</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>651502</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
			<td>For motility assay and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362100</td>
			<td>For Sf9 transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td>For motility assay mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Preparing lysing Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA 630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Preparing lysing buffer for Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td>For motility assay and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>For preparing lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>For preparing lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).</td>
			<td></td>
			<td>For baculovirs expression and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 culture bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4115-0125</td>
			<td>For suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900/SFM medium (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10902-096 -500ml</td>
			<td>For culturing Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td>Preparing lysing buffer for Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unsupplemented Grace&#8217;s media</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11595030 -500ml</td>
			<td>For Sf9 transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2647</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>For blocking motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For dissolving Rhodamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3777</td>
			<td>For preparing buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td>For microtubule polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767</td>
			<td>Preparing PIPES buffer pH 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubule gliding assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G&#160; needle</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td></td>
			<td>For shearing microtubules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3400</td>
			<td>For microtubule glidning assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobodies</td>
			<td>Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)</td>
			<td></td>
			<td>For attaching motors to the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46406</td>
			<td>For preparing labelling tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and other instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml&#160; disposable sterile pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul, 200ul, 1ml micropipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml concal tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm cell culture dish</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>15179-39</td>
			<td>For Sf9 culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td>0.01g-300g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop orbial shaking incubator</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 suspenculture at 28oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>EMCCD Andor iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging and acquesition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For making motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-548-5A</td>
			<td>size; 22X30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>For making motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Neuation</td>
			<td></td>
			<td>Dissolving paraffin wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti- U</td>
			<td></td>
			<td>To check protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasers</td>
			<td>488nm (100mW)</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sample freezing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary loading tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022491920</td>
			<td>For shearing microtubules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini spin</td>
			<td>Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd</td>
			<td></td>
			<td>For quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima UltraCentrifuge XE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coring 430</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette-boy</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST8R centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For microtubule polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>SW60Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Neuation</td>
			<td></td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V001228</td>
			<td>To seal motility chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule analysis of sf9 purified superprocessive kinesin-3 family motors

複雑な細胞環境は、単一分子の運動性解析に課題をもたらします。しかし、イメージング技術の進歩により、単一分子の研究が改善され、蛍光タグ付き分子の動的挙動の検出と理解において絶大な人気を得ています。ここでは、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いたキネシン-3ファミリーモーターのin vitro 単一分子研究の詳細な方法について説明します。キネシン-3は、細胞内貨物輸送から細胞分裂、発生に至るまで、細胞および生理学的機能において重要な役割を果たす大きなファミリーです。我々はこれまで、構成的に活性な二量体キネシン-3モーターが、哺乳類細胞でモーターを発現させて調製した細胞ライセートを用いて、1分子レベルで高い微小管親和性を有する高速かつ超加工的な運動性を示すことを示した。私たちの研究室では、キネシン3モーターとその制御機構を細胞学的、生化学的、生物物理学的アプローチを用いて研究しており、そのような研究では大規模な精製タンパク質が必要です。哺乳類細胞を用いたこれらのモーターの発現および精製は高価で時間がかかるが、原核生物発現系での発現は有意に凝集し、不活性なタンパク質をもたらした。細菌精製システムと哺乳類細胞ライセートによってもたらされる制限を克服するために、これらのモーターを発現および精製するための堅牢なSf9バキュロウイルス発現システムを確立しました。キネシン-3モーターは、シグナルを増強し、光退色を減少させる3タンデム蛍光タンパク質(3xmシチリンまたは3xmCit)でC末端にタグ付けされています。Sf9精製タンパク質の in vitro 単一分子およびマルチモーター滑走分析は、キネシン-3モーターが哺乳類細胞溶解物を用いた以前の研究と同様に高速で超加工的であることを示しています。これらのアッセイを使用する他のアプリケーションには、モーターのオリゴマー条件、生化学的研究と並行している特異的結合パートナー、およびそれらの速度論的状態に関する詳細な知識が含まれます。

Sf9バキュロウイルス発現を用いて活性型および機能的組換えモータータンパク質を大規模に発現・精製するためには、Sf9細胞に感染するためのコード配列を安定に保持するウイルス粒子の生成が必要です。これを達成するために、Sf9細胞にKIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAGをコードする組換えバクミドをトランスフェクトした。72時間後、有意な細胞集団が細胞および核の拡大を伴う緑色蛍光タンパク質(mC...

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Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

本研究では、キネシン-3ファミリーのメンバーであるKIF1A(1-393LZ)をSf9-バキュロウイルス発現系を用いて精製する。これらの精製モーターの in vitro 単一分子およびマルチモーターグライディング分析は、哺乳類細胞ライセートからのモーターに匹敵する堅牢な運動特性を示しました。したがって、Sf9-バキュロウイルス系は、目的のモータータンパク質を発現および精製するのに適している。

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

このプロトコルは、Sf9バキュロウイルスシステムを使用して活性分子モーターを精製するための簡単な方法を提供します。また、モータータンパク質の調節メカニズムを研究するための単一分子運動およびマルチモーターグライディングアッセイについても詳しく説明します。従来のベクター発現Sf9バキュロウイルス発現とシングルステップアフィニティー精製はすべて、純粋で活性なモータータンパク質を、単一分子およびマルチモーターシステムにおけるスーパープロセシティブキネシンの機構の詳細を研究するように導きます。キネシンモーターに加えて、このプロトコルは、ジオニンやミオシンなどの他の細胞骨格ベースのタンパク質の生化学的および生物物理学的特性の研究に適用できます。プロトコルは詳細でわかりやすいです。いくつかの提案は、Sf9細胞は汚染されやすいため慎重に取り扱い、プロトコルで提供されているメモに従うことです。視覚的なデモンストレーションは非常に効果的で、特にこれらのアッセイを実行したことがない人にとって、重要なステップに従いやすく理解しやすいです。手順を実演するのは、私とプラディープ・ナイクと一緒に働いている博士課程の学生であるプシュパンジャリ・ソッピーナとディペシュワリ・シェワレです。はじめに、細胞を35ミリリットルの皿に、1ミリリットルあたり10から5番目の細胞に4.5倍の密度で播種します。24時間後、1マイクログラムのバクミドDNAと100マイクロリットルの未添加グレース培地をチューブに入れて混合します。6マイクロリットルのトランスフェクション試薬を別のチューブに入れて、100マイクロリットルの未添加のグレース培地と混合します。最初のチューブの内容物を2番目のチューブに慎重に移します。それらを混合し、室温で45分間混合物をインキュベートする。0.8ミリリットルの未添加グレース培地を混合物に加える。細胞からSf900 SFM培地を混合して吸引します。調製したトランスフェクション培地を細胞の上部に滴下し、プレートを6時間インキュベートします。その後、トランスフェクション混合物を慎重に除去します。2ミリリットルのSF900 SFM培地を加え、さらに摂氏28度で48時間インキュベートします。次に、倒立蛍光顕微鏡でモータータンパク質発現を確認する。感染した細胞を含む培地を回収し、500 Gで5分間回転させ、上清を収集し、アリコートをスナップフリーズします。細胞を含む10ミリリットルのSF900 SFM培地と1ミリリットルのPゼロウイルスストックを、滅菌済みの100ミリリットルの円錐フラスコに入れます。摂氏28度でインキュベートし、90rpmで絶えず振とうします。72時間後、15ミリリットルの滅菌コニカルチューブで500 Gで5分間細胞をスピンダウンし、上清を収集します。大規模なタンパク質発現のために、30ミリリットルの浮遊培養物を1ミリリットルのP1ストックウイルスに感染させます。感染後72時間で、細胞のタンパク質発現をチェックし、滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に細胞を採取します。紡糸後、上清を捨て、細胞ペレットを回収する。細胞を溶解するには、3ミリリットルの氷冷溶解バッファーを細胞ペレットに加えます。細胞溶解液を150, 000 Gで摂氏4度で30分間回転させます。上清を採取し、40マイクロリットルの50%ANTI-FLAG M2アフィニティ樹脂と混合します。混合物を摂氏4度で3時間インキュベートし、エンドツーエンドのタンブリングを行います。次に、摂氏4度で500Gで1分間回転させてFLAG樹脂をペレット化します。FLAG樹脂ペレットを氷冷洗浄バッファーで3回洗浄します。そして、3回目の洗浄後、洗浄バッファーを慎重に排出します。次に、1ミリリットルあたり100マイクログラムのFLAGペプチドを含む70マイクロリットルの洗浄バッファーを樹脂ペレットに加え、前述のように摂氏4度で一晩インキュベートします。紡糸後、精製タンパク質を含む上清を新鮮なチューブに集める。原稿に記載されているように重合混合物を調製し、重合混合物に10マイクロリットルのチューブリンを加える。チューブをヒートブロックに移し、摂氏37度に予熱し、30分間インキュベートします。微小管安定化バッファーを調製した後、それを温め、重合した微小管に加える。運動性フローセルチャンバーが準備されたら、30マイクロリットルの希釈微小管溶液をチャンバーに流します。30分後、40〜50マイクロリットルのブロッキングバッファーを流し、インキュベートします。運動性混合物を調製し、それに1マイクロリットルの精製モーターを加える。よく混合し、溶液を運動チャンバーに流します。運動チャンバーの両端をTIRF照明下で密封し、画像を密封する。個々のmCitirineタグ付きモーターに焦点を当て、処理的に動きます。ローダミン標識チューブリンと非標識チューブリンを1対10の比率で混合します。30分間の重合後、予め温めた微小管安定化バッファー30マイクロリットルを穏やかに加え、さらに摂氏37度で5分間インキュベートします。毛細管ローディングチップでピペッティングして微小管をせん断します。運動性フローチャンバーを調製した後、50マイクロリットルのSf9精製GFPナノボディを流し、30分間インキュベートする。50マイクロリットルのブロックバッファーを流してカバースリップ面をブロックします。50マイクロリットルのモーターミックスを準備します。溶液を穏やかに混合した後、それをチャンバーに流し、30分間インキュベートする。チャンバーを50マイクロリットルのP12-カゼインで2回洗浄します。グライディングアッセイ混合物を調製し、穏やかに混合してから、運動チャンバーに流します。運動性チャンバーの端部をシールし、TIRF照明下で微小管を滑走させる画像を撮影した。トランスフェクションから 48 時間後、トランスフェクションされていない細胞は小さく、丸く、しっかりと付着しているように見えます。しかし、タンパク質を発現するトランスフェクトされた細胞は、表面に緩く付着し、拡大した細胞径を示した。72時間後、Sf9細胞の90%以上が蛍光タグ、キネシン-3モーターKIF1Aを発現し、細胞は表面に緩く結合した。キネシン-3モータータンパク質は、トランスフェクトされたSf9細胞から精製されました。キモグラフは、微小管表面に沿ってキネシン-3モーターが処理的に歩く様子を描いています。運動イベントは、それぞれ毎秒約2.44マイクロメートルと10.79マイクロメートルの平均速度と実行長を示しました。キモグラフは、キネシン-3モーターによる滑らかな微小管滑走を示し、平均速度は約1.37マイクロメートル/秒です。最も重要なことは、微小管ミックスを乱すことなく安定化バッファーを添加し、微小管を剪断しないことです。このプロトコルは、ATPase測定、生物物理学的分析、メカニズム、in vitro再構成アッセイなどの他のアプリケーションに役立ちます。sf9精製モーターを使用して、最近、kinesin-3モーターが高速で超処理可能であることを実証しました。興味深いことに、これらのモーターは、特性の良いモーターであるKinesin-1と比較して、高いATP回転率を示します。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

リボソームタンパク質合成の単一分子蛍光エネルギー転移研究

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...