Name: single-molecule analysis of sf9 purified superprocessive kinesin-3 family motors
Uploaded: 2022-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors at JoVE.com

V.S.와 P.S. Kristen J. Verhey 교수 (미시간 대학교, 앤아버, 미시건, 미국)와 Roop Mallik 교수 (인도 뭄바이의 인도 봄베이 공과 대학 (IITB))에게 연구 전반에 걸친 무조건적인 지원에 감사드립니다. 추신 : 프로젝트 전반에 걸쳐 그녀의 지원에 대해 Sivapriya Kirubakaran 박사에게 감사드립니다. VS는 DBT(보조금 번호: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 및 BT/RLF/재진입/45/2015) 및 DST-SERB(보조금 번호: ECR/2016/000913)를 통한 자금 지원을 인정합니다. PKN은 자금 조달을 위해 ICMR을 인정합니다 (보조금 번호 5 / 13 / 13 / 2019 / NCD-III). 추신 : DST (보조금 번호 : SR / WOS-A / LS-73 / 2017)의 자금 지원을 인정합니다. DJS는 IIT Gandhinagar의 친목을 인정합니다.

1. Sf9 배양, 형질감염 및 바이러스 생성
참고: 9°C에서 항생제/항진균제 없이 100mL 멸균 일회용 원추형 플라스크에 Sf-900/SFM 배지 30mL에 Sf28 세포를 유지합니다. 현탁액 배양물을 오비탈 쉐이커에서 90 rpm으로 유지한다. CO2 공급 및 습도 유지가 필요하지 않습니다. 세포는 일반적으로 4일째에 2.0 x 106 cells/mL 밀도에 도달하기 위해 0.5 x 106 cells/mL?...

<ol>
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Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템은 고처리량 단백질 생산을 위한 가장 다재다능하고 성공적인 방법 중 하나입니다 19,36,37. Sf9 세포의 번역후 변형 능력은 포유동물 시스템(15)과 매우 유사하다. 이 시스템을 사용할 때의 상당한 단점은 느리고 오염에 민감하다는 것입니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 Sf9 세포?...

엄청나게 붐비는 세포 환경은 예정된 단백질과 분자를 분류하는 데 많은 문제를 제기합니다. 세포질 내 분자의 조직과 시공간 분포의 이러한 강렬한 작업량은 분자 모터와 세포 골격 트랙에 의해 촉진됩니다. 분자 모터는 ATP와 같은 에너지 통화를 가수분해하고 운동 및 힘 생성중에 해당 에너지를 활용하는 효소입니다1. 아미노산 서열 유사성에 따라 키네신은 14 개의 패밀리로 그룹화되며 이러한 유사성에도 불구하고 각 모터는 세포의 기능에 고유하게 기여합니다. Kinesin-3 제품군 모터는 소포 수송, 신호 전달, 유사분열, 핵 이동 및 발달 3,4,5를 포함한 다양한 세포 및 생리적 기능과 관련된 5개의 하위 패밀리(KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 및 KIF28)2로 구성된 가장 큰 모터 중 하나입니다. 키네신-3 수송 기능의 손상은 많은 신경퇴행성 장애, 발달 결함 및암 질환과 관련이 있습니다6,7,8,9.
최근 연구에 따르면 키네신-3 모터는 단량체이지만 화물 유도 이량체화를 거쳐 기존 키네신10,11,12,13에 비해 빠르고 초공정 운동성을 초래합니다. 그들의 생화학 적 및 생물 물리학 적 특성화에는 많은 양의 정제 된 활성 단백질이 필요합니다. 그러나, 원핵 생물 발현 시스템에서의 이들의 생산은 아마도 호환되지 않는 단백질 합성, 접힘 및 변형 기계 14,15,16,17,18로 인해 비활성 또는 응집 된 모터를 초래했다. 이러한 한계를 우회하고 수율을 높이기 위해 여기에서 우리는 이러한 모터를 발현하고 정제하는 강력한 Sf9-baculovirus 발현 시스템을 구축했습니다.
바쿨로바이러스 발현 시스템은 Sf9 곤충 세포주를 고처리량 진핵생물 재조합 단백질 발현19,20을 위한 숙주 시스템으로 사용합니다. Baculovirus는 이종 유전자 발현 및 가용성 재조합 단백질17의 생산을 돕는 강력한 다면체 프로모터를 보유한다. 비용 효율성, 취급 안전성 및 다량의 활성 단백질 발현으로 인해 강력한 도구21이되었습니다. 관심있는 단백질을 발현하기 위해, 핵심 단계는 재조합 bacmid를 생성하는 것이다. 상업적으로 이용 가능한 bacmid 생성 키트는 비싸고 더 많은 샘플로 작업 할 것이기 때문에 우리는 bacmids에 kinesin-3 모터의 크고 작은 삽입물 모두를위한 사내 프로토콜을 개발했습니다. Sf9-정제된 키네신-3 모터는 전반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 시험관 내 단일 분자 및 다중 모터 미세소관 글라이딩 특성을 특성화하는 데 사용되었습니다. 모터는 향상된 신호를 제공하고 광퇴색을 줄이기 위해 3-직렬 형광 분자(3xmCit)로 C 단자 태그가 지정됩니다. TIRF 이미징은 증가 된 신호 대 잡음비, 적은 광독성 및 커버 슬립에 가까운 매우 작은 영역의 선택적 이미징으로 인해 생체 내 및 시험관 내에서 단일 분자 수준에서 단백질 역학을 시각화하는 데 널리 사용되었습니다.
이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템과 TIRF 현미경을 사용한 모터의 체외 단일 분자 이미징 및 다중 모터 글라이딩 분석을 사용하여 키네신-3 모터의 정제에 대해 논의합니다. 전체적으로, 이 연구는 Sf9 정제된 모터의 운동성 특성이 포유류 세포 용해물로부터 제조된 모터의 그것과 동일하다는 것을 보여준다. 따라서 우리는 Sf9-baculovirus 시스템이 관심있는 모든 운동 단백질을 발현하고 정제하도록 적응할 수 있다고 믿습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sf9 culture and transfection materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M2 affinity</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>651502</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
			<td>For motility assay and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362100</td>
			<td>For Sf9 transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td>For motility assay mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Preparing lysing Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA 630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Preparing lysing buffer for Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td>For motility assay and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>For preparing lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>For preparing lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).</td>
			<td></td>
			<td>For baculovirs expression and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 culture bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4115-0125</td>
			<td>For suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900/SFM medium (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10902-096 -500ml</td>
			<td>For culturing Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td>Preparing lysing buffer for Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unsupplemented Grace&#8217;s media</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11595030 -500ml</td>
			<td>For Sf9 transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2647</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>For blocking motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For dissolving Rhodamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3777</td>
			<td>For preparing buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td>For microtubule polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767</td>
			<td>Preparing PIPES buffer pH 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubule gliding assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G&#160; needle</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td></td>
			<td>For shearing microtubules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3400</td>
			<td>For microtubule glidning assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobodies</td>
			<td>Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)</td>
			<td></td>
			<td>For attaching motors to the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46406</td>
			<td>For preparing labelling tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and other instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml&#160; disposable sterile pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul, 200ul, 1ml micropipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml concal tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm cell culture dish</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>15179-39</td>
			<td>For Sf9 culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td>0.01g-300g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop orbial shaking incubator</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 suspenculture at 28oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>EMCCD Andor iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging and acquesition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For making motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-548-5A</td>
			<td>size; 22X30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>For making motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Neuation</td>
			<td></td>
			<td>Dissolving paraffin wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti- U</td>
			<td></td>
			<td>To check protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasers</td>
			<td>488nm (100mW)</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sample freezing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary loading tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022491920</td>
			<td>For shearing microtubules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini spin</td>
			<td>Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd</td>
			<td></td>
			<td>For quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima UltraCentrifuge XE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coring 430</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette-boy</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST8R centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For microtubule polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>SW60Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Neuation</td>
			<td></td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V001228</td>
			<td>To seal motility chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule analysis of sf9 purified superprocessive kinesin-3 family motors

복잡한 세포 환경은 단일 분자 운동성 분석에 어려움을 야기합니다. 그러나 이미징 기술의 발전으로 단일 분자 연구가 개선되었으며 형광 태그 분자의 동적 거동을 감지하고 이해하는 데 엄청난 인기를 얻었습니다. 여기에서는 TIRF(전반사 형광) 현미경을 사용하여 kinesin-3 계열 모터의 체외 단일 분자 연구에 대한 자세한 방법을 설명합니다. Kinesin-3는 세포 내 화물 수송에서 세포 분열, 발달에 이르기까지 세포 및 생리적 기능에 중요한 역할을 하는 대가족입니다. 우리는 이전에 구성 활성 이량 체 키네신 -3 모터가 포유류 세포에서 모터를 발현하여 제조 된 세포 용해물을 사용하여 단일 분자 수준에서 높은 미세 소관 친화력으로 빠르고 초 프로세스 운동성을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 우리 실험실은 세포, 생화학 및 생물 물리학 적 접근법을 사용하여 kinesin-3 모터와 조절 메커니즘을 연구하며, 이러한 연구는 대규모로 정제 된 단백질을 요구합니다. 포유류 세포를 사용하여 이러한 모터의 발현 및 정제는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 반면, 원핵생물 발현 시스템에서의 발현은 상당히 응집되고 비활성 단백질을 초래했습니다. 박테리아 정제 시스템과 포유류 세포 용해물의 한계를 극복하기 위해 당사는 이러한 모터를 발현하고 정제하는 강력한 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 구축했습니다. kinesin-3 모터는 향상된 신호를 제공하고 광퇴색을 감소시키는 3-탠덤 형광 단백질(3xmCitirine 또는 3xmCit)로 C-말단 태그가 지정되어 있습니다. Sf9 정제 단백질의 시험관 내 단일 분자 및 다중 모터 글라이딩 분석은 키네신-3 모터가 포유류 세포 용해물을 사용한 이전 연구와 유사하게 빠르고 초공정적임을 보여줍니다. 이러한 분석을 사용하는 다른 응용 분야에는 모터의 올리고머 조건, 생화학 연구를 병행하는 특정 결합 파트너 및 운동 상태에 대한 자세한 지식이 포함됩니다.

Sf9-바쿨로바이러스 발현을 사용하여 활성 및 기능성 재조합 모터 단백질을 대규모로 발현하고 정제하려면 시스템이 Sf9 세포를 감염시키기 위해 코딩 서열을 안정적으로 운반하는 바이러스 입자를 생성해야 합니다. 이를 달성하기 위해, Sf9 세포를 KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG를 코딩하는 재조합 바크미드로 형질감염시켰다. 72시간 후, 상당한 세포 집단이 확대된 세포와 핵(그림 1 및...

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Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

이 프로토콜은 Sf9 바쿨로바이러스 시스템을 사용하여 활성 분자 모터를 정제하는 간단한 방법을 제공합니다. 또한 운동 단백질의 조절 메커니즘을 연구하기 위한 단일 분자 운동성 및 다중 모터 글라이딩 분석에 대해 자세히 설명합니다. 기존의 모든 벡터 발현 Sf9 바쿨로바이러스 발현 및 단일 단계 친화성 정제는 순수하고 활동적인 운동 단백질을 이끌고 단일 분자 및 다중 모터 시스템에서 초공정 키네신의 기계론적 세부 사항을 연구할 것입니다.Kinesin 모터 외에도 이 프로토콜을 적용하여 디오닌 및 미오신 같은 다른 세포골격계 단백질의 생화학적 및 생물물리학적 특성을 연구할 수 있습니다. 프로토콜은 상세하고 따르기 쉽습니다. 몇 가지 제안은 Sf9 세포가 오염되기 쉽기 때문에 조심스럽게 다루고 프로토콜에 제공된 참고 사항을 따르는 것입니다.시각적 시연은 매우 효과적이며, 특히 이러한 분석을 수행한 적이 없는 사람들에게 중요한 단계를 따르고 이해하기 쉽습니다. 절차를 시연하는 것은 Pushpanjali Soppina와 Dipeshwari Shewale, 나와 Pradeep Naik과 함께 일하는 박사 과정 학생입니다. 시작하려면 35 밀리리터 접시에 세포를 4.5 배의 밀도로 밀리리터 당 10-5 번째 세포로 씨를 뿌립니다.24 시간 후, 1 마이크로 그램의 bacmid DNA와 100 마이크로 리터의 보충되지 않은 그레이스 배지를 튜브에 섞습니다. 다른 튜브에 6 마이크로 리터의 형질 주입 시약을 100 마이크로 리터의 보충되지 않은 Grace 's 배지와 혼합합니다. 첫 번째 튜브의 내용물을 두 번째 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.이들을 혼합하고 혼합물을 실온에서 45 분 동안 배양한다. 보충되지 않은 Grace 배지 0.8ml를 혼합물에 첨가하십시오. 셀에서 Sf900 SFM 배지를 혼합하고 흡인합니다.준비된 형질주입 배지를 세포의 상부에 적가하고, 플레이트를 6시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 형질 주입 혼합물을 조심스럽게 제거하십시오. SF900 SFM 배지 2밀리리터를 넣고 섭씨 28도에서 48시간 동안 더 배양합니다.다음으로, 도립 형광 현미경으로 운동 단백질 발현을 확인합니다. 감염된 세포로 배지를 수확하고 500G에서 5분 동안 회전합니다.상청액을 수집하고 분취량을 스냅 동결합니다. 멸균된 100밀리리터 원뿔형 플라스크에 세포가 있는 SF900 SFM 배지 10밀리리터와 P-제로 바이러스 스톡 1밀리리터를 추가합니다.섭씨 28도에서 90rpm으로 일정하게 흔들면서 배양합니다. 72시간 후, 세포를 500G의 15밀리리터 멸균 원추형 튜브에서 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 수집한다. 대규모 단백질 발현의 경우, 30 밀리리터의 현탁액 배양을 1 밀리리터의 P1 스톡 바이러스로 감염시킵니다.감염 후 72 시간, 단백질 발현을 위해 세포를 확인하고 멸균 된 50 밀리리터의 원추형 튜브에서 세포를 수집하십시오. 방사 후, 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 수집한다. 세포를 용해하려면 3 밀리리터의 얼음 냉 용해 완충액을 세포 펠릿에 첨가하십시오.세포 용해물을 섭씨 4도에서 30 분 동안 150, 000G에서 회전시킵니다. 상청액을 수집하고 40 마이크로 리터의 50 % ANTI-FLAG M2 친화성 수지와 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 종단 간 텀블링과 함께 3시간 동안 배양합니다.이제 섭씨 4도에서 1분 동안 500G에서 회전하여 FLAG 수지를 펠릿화합니다. FLAG 수지 펠릿을 얼음처럼 차가운 세척 완충액으로 세 번 세척합니다. 그리고 세 번째 세척 후 세척 버퍼를 조심스럽게 배출하십시오.다음으로, 밀리리터 FLAG 펩티드 당 100 마이크로그램을 함유하는 70 마이크로리터의 세척 완충액을 수지 펠릿에 첨가하고, 앞에서 설명한 바와 같이 섭씨 4도에서 밤새 배양한다. 방사 후, 정제 된 단백질을 함유 한 상청액을 신선한 튜브에 모으십시오. 원고에 기재된 바와 같이 중합 혼합물을 제조하고, 중합 혼합물에 10 마이크로 리터의 튜 불린을 첨가한다.튜브를 열 블록으로 옮기고 섭씨 37도에서 예열하고 30 분 동안 배양합니다. 미세소관 안정화 완충액을 준비한 후, 이를 가온하고, 중합된 미세소관에 첨가한다. 운동성 유동 세포 챔버가 준비되면, 30 마이크로리터의 희석된 미세소관 용액을 챔버를 통해 유동시킨다.30분 후, 40 내지 50 마이크로리터의 블로킹 완충액을 흘려주고 이를 배양한다. 운동성 혼합물을 준비하고 정제 된 모터 1 마이크로 리터를 첨가하십시오. 잘 혼합하고 용액을 운동성 챔버로 흘립니다.TIRF 조명 하에서 운동성 챔버와 이미지의 양쪽 끝을 밀봉합니다. 프로세스적으로 움직이는 개별 mCitirine 태그가 지정된 모터에 중점을 둡니다. 로다민으로 표지된 튜불린과 표지되지 않은 튜불린을 1:10의 비율로 혼합합니다.중합 30분 후, 예열된 미세소관 안정화 완충액 30마이크로리터를 부드럽게 첨가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 추가로 배양한다. 모세관 로딩 팁으로 피펫팅하여 미세소관을 전단합니다. 운동성 유동 챔버를 준비한 후, 50 마이크로리터의 Sf9 정제된 GFP 나노바디를 흘려주고 30분 동안 배양한다.50 마이크로리터의 블록 완충액을 흘려줌으로써 커버 슬립 표면을 차단한다. 50 마이크로 리터의 모터 믹스를 준비하십시오. 용액을 부드럽게 혼합한 후 챔버 내로 흐르게 하고 30분 동안 배양한다.50 마이크로 리터의 P12- 카제인으로 챔버를 두 번 씻으십시오. 활공 분석 혼합물을 준비하고 운동성 챔버로 흐르기 전에 부드럽게 혼합하십시오. 운동성 챔버의 끝을 밀봉하고 TIRF 조명 하에서 활공하는 이미지 미세소관.형질주입 48시간 후, 형질주입되지 않은 세포는 작고 둥글며 단단히 부착된 것처럼 보입니다. 그러나, 단백질을 발현하는 형질감염된 세포는, 표면에 느슨하게 부착되었고, 확대된 세포 직경을 보였다. 72 시간 후, Sf9 세포의 90 % 이상이 형광 태그, 키네신 -3 모터 KIF1A를 발현했으며 세포는 표면에 느슨하게 결합되었습니다.키네신-3 운동 단백질을 형질감염된 Sf9 세포로부터 정제하였다. 키모 그래프는 미세 소관 표면을 따라 과정적으로 걷는 키네 신 -3 모터를 묘사합니다. 운동성 이벤트는 각각 초당 약 2.44 마이크로미터 및 10.79 마이크로미터의 평균 속도 및 실행 길이를 나타내었다.키모그래프는 키네신-3 모터에 의한 부드러운 미세소관 활공을 나타내며 평균 속도는 초당 약 1.37마이크로미터입니다. 가장 중요한 것은 미세소관 혼합을 방해하지 않고 안정화 완충액을 추가하고 미세소관을 전단하지 않는 것입니다. 이 프로토콜은 ATPase 측정, 생물 물리학 적 분석, 메커니즘, 체외 재구성 분석 등과 같은 다른 응용 분야에 유용합니다.sf9 정제 모터를 사용하여 최근에 kinesin-3 모터가 빠르고 초공정적이라는 것을 입증했습니다. 흥미롭게도 이러한 모터는 특성이 잘 지정된 모터인 Kinesin-1에 비해 높은 ATP 회전율을 나타냅니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

연구

생화학

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...