Name: single-molecule analysis of sf9 purified superprocessive kinesin-3 family motors
Uploaded: 2022-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors at JoVE.com

VS ve PS, Prof. Kristen J. Verhey'e (Michigan Üniversitesi, Ann Arbor, MI, ABD) ve Prof. Roop Mallik'e (Hindistan Teknoloji Enstitüsü Bombay (IITB), Mumbai, Hindistan) çalışma boyunca koşulsuz destekleri için teşekkür eder. Not: Proje boyunca verdiği destek için Dr. Sivapriya Kirubakaran'a teşekkür eder. V.S., DBT (Hibe No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 ve BT/RLF/Re-entry/45/2015) ve DST-SERB (Hibe No.: ECR/2016/000913) aracılığıyla finansman sağlamaktadır. P.K.N, ICMR'yi finansman için kabul etmektedir (Hibe No. 5/13/13/2019/NCD-III). Not: DST'den fon kabul etmektedir (Hibe No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S, IIT Gandhinagar'ın bursunu kabul eder.

1. Sf9 kültürü, transfeksiyonu ve virüs üretimi
NOT: Sf9 hücrelerini, 28 °C'de herhangi bir antibiyotik/antimikotik olmadan 100 mL steril, tek kullanımlık konik şişede 30 mL Sf-900/SFM ortamında muhafaza edin. Süspansiyon kültürünü yörüngesel bir çalkalayıcıda 90 rpm'de tutun. CO2 ve nem bakımı gerekli değildir. Hücreler genellikle dördüncü günde 2.0 x 10 6 hücre / mL yoğunluğa ulaşmak için 0.5 x 106 hücre / m...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112, 467-480 (2003).</li><li>Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+kinesin+superfamily:+insights+into+structure+and+function.">Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function.</a> Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).</li><li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Hirokawa, N., Takemura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+and+mechanisms+of+directional+transport+in+neurons.">Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).</li><li>Patel, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF13A+motors+are+regulated+by+Rab22A+to+function+as+weak+dimers+inside+the+cell.">KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell.</a> Scientific Advances. 7 (6), (2021).</li><li>Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-based+transport+-+basic+mechanisms,+traffic+rules+and+role+in+neurological+pathogenesis.">Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis.</a> Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).</li><li>Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+neurodegenerative+disease:+vesicle-motor+complex+formation+and+their+regulation.">Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation.</a> Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).</li><li>Rath, O., Kozielski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesins+and+cancer.">Kinesins and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).</li><li>Wang, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF14+promotes+cell+proliferation+via+activation+of+Akt+and+is+directly+targeted+by+miR-200c+in+colorectal+cancer.">KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer.</a> International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).</li><li>Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Run+length+distribution+of+dimerized+kinesin-3+molecular+motors:+comparison+with+dimeric+kinesin-1.">Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).</li><li>Scarabelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+processivity+determinants+of+the+Kinesin-3+motor+domain.">Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).</li><li>Soppina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+mammalian+kinesin-3+motors+results+in+superprocessive+motion.">Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).</li><li>Soppina, V., Verhey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+family-specific+K-loop+influences+the+microtubule+on-rate+but+not+the+superprocessivity+of+kinesin-3+motors.">The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors.</a> Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).</li><li>Soppina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-3+motors+are+fine-tuned+at+the+molecular+level+to+endow+distinct+mechanical+outputs.">Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs.</a> BMC Biology. , (2022).</li><li>Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+Expressed+in+insect+cells+improves+microtubule+in+vitro+gliding+performance,+long-term+stability+and+guiding+efficiency+in+nanostructures.">Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).</li><li>Schmidt, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+expression+systems+in+the+pharmaceutical+industry.">Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).</li><li>Kurland, C., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+of+heterologous+protein+expression.">Errors of heterologous protein expression.</a> Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).</li><li>Tao, L., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+assay+of+mitotic+motors.">Purification and assay of mitotic motors.</a> Methods. 51 (2), 233-241 (2010).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Felberbaum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+system:+A+commercial+manufacturing+platform+for+viral+vaccines+and+gene+therapy+vectors.">The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors.</a> Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).</li><li>Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).</li><li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+probes+for+bioimaging+applications.">Development of fluorescent probes for bioimaging applications.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).</li><li>Hassan, M., Klaunberg, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+fluorescence+imaging+in+vivo.">Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo.</a> Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).</li><li>Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+biological+imaging.">Super-resolution microscopy for biological imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+ROS+production.">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biology. 2, 368-376 (2014).</li><li>Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+Kinesin+molecules+in+the+cytoplasm+of+mammalian+cells.">Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).</li><li>Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+temperature+on+kinesin-driven+microtubule+gliding+and+kinesin+ATPase+activity.">Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity.</a> FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).</li><li>Porter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+microtubule+movement+produced+by+sea+urchin+egg+kinesin.">Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Verma, S., Kumar, N., Verma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+paclitaxel+on+critical+nucleation+concentration+of+tubulin+and+its+effects+thereof.">Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).</li><li>Parness, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxol+binds+to+polymerized+tubulin+in+vitro.">Taxol binds to polymerized tubulin in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).</li><li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol.">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li><li>Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+human+(pro)renin+receptor+in+insect+cells+using+baculovirus+expression+system.">Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system.</a> Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).</li><li>Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+baculovirus+expression+system+for+generation+of+virus-like+particles:+successes+and+challenges.">Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges.</a> Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+tag+protein+fusions:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).</li><li>Huang, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+paclitaxel+induces+fewer+hematopoietic+and+cardiovascular+complications+than+bioequivalent+doses+of+Taxol.">Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol.</a> International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).</li></ol>

Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi, yüksek verimli protein üretimi için en çok yönlü ve başarılı yöntemlerden biridir 19,36,37. Sf9 hücrelerinin posttranslasyonel modifikasyon yeteneği, memeli sistemi15 ile oldukça karşılaştırılabilir. Bu sistemi kullanmanın önemli bir dezavantajı, yavaş ve kontaminasyona karşı hassas olmasıdır. En kritik adımlardan biri, Sf9 hücrelerinde etk...

Son derece kalabalık bir hücre ortamı, kaderindeki proteinleri ve molekülleri sıralamada birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Sitoplazma içindeki moleküllerin organizasyonu ve mekansal zamansal dağılımının bu yoğun iş yükü, moleküler motorlar ve sitoiskelet izleri tarafından kolaylaştırılmıştır. Moleküler motorlar, ATP gibi enerji para birimlerini hidrolize eden ve bu enerjiyi hareket ve kuvvet üretimisırasında kullanan enzimlerdir. Amino asit dizisi benzerliğine dayanarak, kinezinler 14 aileye ayrılır ve bu benzerliğe rağmen, her motor bir hücrenin işleyişine benzersiz bir şekilde katkıda bulunur. Kinesin-3 ailesi motorlar, vezikül taşıma, sinyalleşme, mitoz, nükleer göç ve gelişim 3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli hücresel ve fizyolojik işlevlerle ilişkili beş alt aileden (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 ve KIF28)2 oluşan en büyüklerden birini oluşturur. Kinezin-3 taşıma fonksiyonundaki bozulma birçok nörodejeneratif bozukluk, gelişimsel defekt ve kanser hastalığına etki eder 6,7,8,9.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kinezin-3 motorlarının monomer olduğunu, ancak kargo kaynaklı dimerizasyona uğradığını ve geleneksel kinesin10,11,12,13'e kıyasla hızlı ve süperprosesik hareketliliğe neden olduğunu göstermiştir. Biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonları büyük miktarda saflaştırılmış, aktif proteine ihtiyaç duyar. Bununla birlikte, prokaryotik ekspresyon sistemindeki üretimleri, muhtemelen uyumsuz protein sentezi, katlama ve modifikasyon makineleri 14,15,16,17,18 nedeniyle inaktif veya agrega motorlarıyla sonuçlandı. Bu tür sınırlamaları aşmak ve verimi artırmak için, burada bu motorları ifade etmek ve saflaştırmak için sağlam bir Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kurduk.
Bakülovirüs ekspresyon sistemi, yüksek verimli ökaryotik rekombinant protein ekspresyonu 19,20 için konakçı sistem olarakSf9 böcek hücre hatlarını kullanır. Bakülovirüs, heterolog gen ekspresyonuna ve çözünür rekombinant proteinlerin üretimine yardımcı olan güçlü bir polihedrin promotörüne sahiptir17. Uygun maliyeti, kullanımı güvenli ve yüksek miktarda aktif protein ekspresyonu nedeniyle, güçlü bir araç haline gelmiştir21. İlgilenilen bir proteini ifade etmek için önemli bir adım, rekombinant bir bacmid üretmektir. Ticari olarak temin edilebilen bacmid üretim kitleri pahalı olduğundan ve daha fazla numune ile çalışacağımızdan kinezin-3 motorlarının hem büyük hem de küçük ekleri için bacmidlere şirket içi bir protokol geliştirdik. Sf9-saflaştırılmış kinesin-3 motorları, toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak in vitro tek moleküllü ve çok motorlu mikrotübül kayma özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Motorlar, gelişmiş sinyal sağlamak ve fotobeyazlatmayı azaltmak için 3 tandem floresan molekülleri (3xmCit) ile C-terminal olarak etiketlenmiştir. Artan sinyal-gürültü oranı, daha az fototoksisite ve kapak kaymasına yakın çok küçük bir alanın seçici görüntülenmesi nedeniyle, TIRF görüntüleme, protein dinamiklerini in vivo ve in vitro olarak tek moleküllü seviyede görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bu çalışmada, Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak kinesin-3 motorlarının saflaştırılması ve TIRF mikroskobu kullanılarak motorların in vitro tek moleküllü görüntüleme ve çok motorlu kayma analizi tartışılmaktadır. Toplamda, bu çalışma, Sf9 saflaştırılmış motorların hareketlilik özelliklerinin, memeli hücre lizatlarından hazırlanan motorlarınkiyle aynı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sisteminin, ilgilenilen herhangi bir motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uyarlanabileceğine inanıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sf9 culture and transfection materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M2 affinity</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>651502</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
			<td>For motility assay and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362100</td>
			<td>For Sf9 transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td>For motility assay mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Preparing lysing Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA 630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Preparing lysing buffer for Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td>For motility assay and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>For preparing lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>For preparing lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>For motility purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).</td>
			<td></td>
			<td>For baculovirs expression and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 culture bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4115-0125</td>
			<td>For suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900/SFM medium (1X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10902-096 -500ml</td>
			<td>For culturing Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td>Preparing lysing buffer for Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unsupplemented Grace&#8217;s media</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11595030 -500ml</td>
			<td>For Sf9 transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2647</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>For blocking motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For dissolving Rhodamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3777</td>
			<td>For preparing buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td>For microtubule polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767</td>
			<td>Preparing PIPES buffer pH 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757</td>
			<td>For motility and gliding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubule gliding assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G&#160; needle</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td></td>
			<td>For shearing microtubules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3400</td>
			<td>For microtubule glidning assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobodies</td>
			<td>Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)</td>
			<td></td>
			<td>For attaching motors to the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46406</td>
			<td>For preparing labelling tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and other instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml&#160; disposable sterile pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul, 200ul, 1ml micropipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml concal tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm cell culture dish</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>15179-39</td>
			<td>For Sf9 culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td>0.01g-300g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop orbial shaking incubator</td>
			<td>REMI</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 suspenculture at 28oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>EMCCD Andor iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging and acquesition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For making motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-548-5A</td>
			<td>size; 22X30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>For making motility chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Neuation</td>
			<td></td>
			<td>Dissolving paraffin wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti- U</td>
			<td></td>
			<td>To check protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasers</td>
			<td>488nm (100mW)</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sample freezing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary loading tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022491920</td>
			<td>For shearing microtubules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini spin</td>
			<td>Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd</td>
			<td></td>
			<td>For quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion</td>
			<td></td>
			<td>For TIRF imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima UltraCentrifuge XE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coring 430</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette-boy</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>For Sf9 culture and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST8R centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For microtubule polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>SW60Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Neuation</td>
			<td></td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V001228</td>
			<td>To seal motility chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule analysis of sf9 purified superprocessive kinesin-3 family motors

Karmaşık bir hücresel ortam, tek moleküllü hareketlilik analizi için zorluklar doğurur. Bununla birlikte, görüntüleme tekniklerindeki ilerleme, tek moleküllü çalışmaları geliştirmiş ve floresan etiketli moleküllerin dinamik davranışlarını tespit etmede ve anlamada büyük popülerlik kazanmıştır. Burada, Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak kinesin-3 ailesi motorların in vitro tek moleküllü çalışmaları için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Kinesin-3, hücre içi kargo taşımacılığından hücre bölünmesine ve gelişime kadar değişen hücresel ve fizyolojik fonksiyonlarda kritik roller oynayan büyük bir ailedir. Yapısal olarak aktif dimerik kinezin-3 motorlarının, memeli hücrelerinde motor eksprese edilerek hazırlanan hücre lizatlarını kullanarak tek molekül düzeyinde yüksek mikrotübül afinitesi ile hızlı ve süperprosesik hareketlilik sergilediğini daha önce göstermiştik. Laboratuvarımız hücresel, biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlar kullanarak kinesin-3 motorlarını ve düzenleyici mekanizmalarını inceler ve bu tür çalışmalar büyük ölçekte saflaştırılmış proteinler gerektirir. Bu motorların memeli hücreleri kullanılarak ekspresyonu ve saflaştırılması pahalı ve zaman alıcı olurken, prokaryotik bir ekspresyon sistemindeki ekspresyon önemli ölçüde toplanmış ve inaktif protein ile sonuçlanmıştır. Bakteriyel saflaştırma sistemleri ve memeli hücre lizatının getirdiği sınırlamaların üstesinden gelmek için, bu motorları eksprese etmek ve saflaştırmak için sağlam bir Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kurduk. Kinesin-3 motorları, gelişmiş sinyaller sağlayan ve fotobeyazlatmayı azaltan 3-tandem floresan proteinleri (3xmCitirine veya 3xmCit) ile C-terminal olarak etiketlenmiştir. Sf9 saflaştırılmış proteinlerin in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, kinezin-3 motorlarının memeli hücre lizatlarını kullanan önceki çalışmalarımıza benzer şekilde hızlı ve süperprosesik olduğunu göstermektedir. Bu testleri kullanan diğer uygulamalar, motorların oligomer koşulları, biyokimyasal çalışmalara paralel özel bağlanma ortakları ve kinetik durumları hakkında ayrıntılı bilgi içerir.

Aktif ve fonksiyonel rekombinant motor proteinleri Sf9-bakülovirüs ekspresyonunu kullanarak büyük ölçekte eksprese etmek ve saflaştırmak için, sistemin Sf9 hücrelerini enfekte etmek için bir kodlama dizisi taşıyan viral parçacıkların üretilmesine ihtiyacı vardır. Bunu başarmak için, Sf9 hücreleri KIF1A (1-393LZ)-3xmCit-FLAG kodlayan rekombinant bacmid ile transfekte edildi. 72 saat sonra, önemli bir hücre popülasyonu, genişlemiş hücreler ve çekirdeklerle yeşil floresan proteininin (mCitrine)...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors at JoVE.com

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A'nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Protokol, Sf9 bakülovirüs sistemini kullanarak aktif moleküler motorları saflaştırmak için basit bir yöntem sunar. Ayrıca, motor proteinlerin düzenleyici mekanizmasını incelemek için tek moleküllü hareketlilik ve çok motorlu kayma testlerini de detaylandırır. Tüm bu geleneksel vektör ekspresyonu Sf9 bakülovirüs ekspresyonu ve tek adımlı afinite saflaştırması, saf ve aktif motor proteininin tek moleküllü ve çok motorlu sistemlerde Süperprosesif Kinesinlerin mekanik ayrıntılarını incelemesine yol açacaktır.Kinesin motorlarına ek olarak, protokol, dionin ve miyozin gibi diğer sitoiskelet bazlı proteinlerin biyokimyasal ve biyofiziksel özelliklerini incelemek için uygulanabilir. Protokol ayrıntılı ve takip edilmesi kolaydır. Bazı öneriler, Sf9 hücrelerini kontaminasyona eğilimli oldukları için dikkatli bir şekilde ele almak ve protokolde verilen notları takip etmektir.Görsel gösterim, özellikle bu tahlilleri hiç yapmamış olanlar için kritik adımları takip etmek ve anlamak için oldukça etkilidir. Prosedürü gösterenler, benimle ve Pradeep Naik ile çalışan doktora öğrencileri olan Pushpanjali Soppina ve Dipeshwari Shewale olacak. Başlamak için, hücreleri 35 mililitrelik bir tabakta, mililitre başına 4.5 kat 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda tohumlayın.24 saat sonra, bir mikrogram bacmid DNA ve 100 mikrolitre takviyesiz Grace'in ortamını bir tüpte karıştırın. Altı mikrolitre transfeksiyon reaktifini başka bir tüpte 100 mikrolitre takviyesiz Grace'in ortamı ile karıştırın. İlk tüpün içeriğini dikkatlice ikinci tüpe aktarın.Onları karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Karışıma 0,8 mililitre takviyesiz Grace'in ortamını ekleyin. Sf900 SFM ortamını hücrelerden karıştırın ve aspire edin.Hazırlanan transfeksiyon ortamını hücrelerin üstüne damla damla ekleyin ve plakayı altı saat boyunca inkübe edin. Ardından transfeksiyon karışımını dikkatlice çıkarın. İki mililitre SF900 SFM ortamı ekleyin ve 48 saat boyunca 28 santigrat derecede daha fazla inkübe edin.Daha sonra, motor protein ekspresyonunu ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında kontrol edin. Medyayı enfekte olmuş hücrelerle toplayın ve 500 G.Süpernatantı toplayın ve alikotları dondurun beş dakika boyunca döndürün. Steril, 100 mililitrelik konik bir şişeye hücrelerle birlikte 10 mililitre SF900 SFM ortamı ve bir mililitre P-sıfır virüs stoğu ekleyin.90 rpm'de sürekli sallanarak 28 santigrat derecede inkübe edin. 72 saat sonra, hücreleri 15 mililitrelik, steril bir konik tüpte 500 G'de beş dakika boyunca döndürün ve süpernatanı toplayın. Büyük ölçekli protein ekspresyonu için, süspansiyon kültürünün 30 mililitresini bir mililitre P1 stok virüsü ile enfekte edin.Enfeksiyondan 72 saat sonra, hücreleri protein ekspresyonu açısından kontrol edin ve hücreleri steril, 50 mililitre, konik tüplerde toplayın. Eğirdikten sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini toplayın. Hücreleri lize etmek için, hücre peletine üç mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin.Hücre lizatını 30 dakika boyunca 150.000 G'de, dört santigrat derecede döndürün. Süpernatantı toplayın ve 40 mikrolitre% 50 ANTI-FLAG M2 afinite reçinesi ile karıştırın. Karışımı uçtan uca yuvarlanma ile üç saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Şimdi FLAG reçinesini dört santigrat derecede bir dakika boyunca 500 G'de döndürerek toplayın. FLAG reçine peletini buz gibi soğuk yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, yıkama tamponunu dikkatlice boşaltın.Daha sonra, reçine peletine mililitre FLAG peptidi başına 100 mikrogram içeren 70 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Eğirdikten sonra, saflaştırılmış protein içeren süpernatantı taze bir tüp halinde toplayın. Makalede açıklandığı gibi bir polimerizasyon karışımı hazırlayın ve polimerizasyon karışımına 10 mikrolitre tübülin ekleyin.Tüpü bir ısı bloğuna aktarın, 37 santigrat derecede önceden ısıtın ve 30 dakika boyunca inkübe edin. Mikrotübül stabilizasyon tamponunu hazırladıktan sonra, ısıtın ve polimerize mikrotübüllere ekleyin. Motiliteli akış hücresi odası hazırlandıktan sonra, odadan 30 mikrolitre seyreltilmiş mikrotübül çözeltisi akıtın.30 dakika sonra, 40 ila 50 mikrolitre bloke edici tampon akıtın ve inkübe edin. Bir hareketlilik karışımı hazırlayın ve saflaştırılmış motorun bir mikrolitresini ekleyin. İyice karıştırın ve çözeltiyi hareketlilik odasına akıtın.Hareketlilik odasının her iki ucunu ve görüntüyü TIRF aydınlatması altında kapatın. İşlemsel olarak hareket eden bireysel mCitirine etiketli motorlara odaklanın. Rodamin etiketli tübülini etiketsiz tübülinle bir ila 10 oranında karıştırın.30 dakikalık polimerizasyondan sonra, hafifçe 30 mikrolitre önceden ısıtılmış mikrotübül stabilizasyon tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede daha fazla inkübe edin. Kılcal yükleme ucu ile pipetleme yaparak mikrotübülleri kesin. Motiliteli akış odasını hazırladıktan sonra, 50 mikrolitre Sf9 saflaştırılmış GFP nanocisimciklerini akıtın ve 30 dakika boyunca inkübe edin.50 mikrolitre blok tamponu akıtarak kapak kayma yüzeyini bloke edin. Motor karışımının 50 mikrolitresini hazırlayın. Çözeltiyi hafifçe karıştırdıktan sonra odaya akıtın ve 30 dakika boyunca inkübe edin.Odayı iki kez, 50 mikrolitre P12-kazein ile yıkayın. Kayan tahlil karışımını hazırlayın ve hareketlilik odasına akıtmadan önce yavaşça karıştırın. Hareket odasının uçlarını kapatın ve TIRF aydınlatması altında kayan mikrotübülleri görüntüleyin.48 saatlik transfeksiyondan sonra, transfekte edilmemiş hücreler küçük, yuvarlak ve sıkıca tutturulmuş olarak görünür. Bununla birlikte, proteini eksprese eden transfekte hücreler, yüzeye gevşek bir şekilde bağlandı ve genişlemiş hücre çapı gösterdi. 72 saat sonra, Sf9 hücrelerinin% 90'ından fazlası floresan etiketli, kinesin-3 motor KIF1A'yı eksprese etti ve hücreler yüzeye gevşek bir şekilde bağlandı.Kinesin-3 motor proteini, transfekte Sf9 hücrelerinden saflaştırıldı. Kimograf, kinesin-3 motorunu mikrotübül yüzeyi boyunca işlemsel olarak yürürken tasvir eder. Motilite olayları, sırasıyla saniyede yaklaşık 2.44 mikrometre ve 10.79 mikrometre ortalama hız ve çalışma uzunluğu göstermiştir.Kimograf, kinesin-3 motorları tarafından saniyede ortalama 1.37 mikrometre hızla düzgün mikrotübül kaymasını gösterir. En önemli şey, mikrotübül karışımını bozmadan stabilizasyon tamponunu eklemek ve mikrotübülü kesmemektir. Protokol, ATPaz ölçümleri, biyofiziksel analiz, mekanizmalar, in vitro sulandırma testleri vb. gibi diğer uygulamalar için yararlı olacaktır.Sf9 saflaştırılmış motorları kullanarak, yakın zamanda kinesin-3 motorlarının hızlı ve süper-işlemsel olduğunu gösterdik. İlginç bir şekilde, bu motorlar, iyi karakterize edilmiş motor Kinesin-1'e kıyasla yüksek ATP devir hızları sergilemektedir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...