Name: preparation of rat sciatic nerve for ex vivo neurophysiology
Uploaded: 2022-07-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology at JoVE.com

Forfatterne anerkender Dr. Gerald Hunsberger fra GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, USA og Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK) for at dele deres originale nerveforberedelsesteknik med os. Forfatterne anerkender Robert Toth for dual-chamber nervebaddesignet. Forfatterne anerkender finansiering fra Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) bevilling fra Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). Forfatterne anerkender High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) fra Imperial College London for finansiering af Adrien Rapeaux (EP / L016796/1 ). Adrien Rapeaux er i øjeblikket finansieret af UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Forfatterne anerkender taknemmeligt Zack Bailey fra Imperial College, i Institut for Bioengineering, for hjælp med eksperimenter og adgang til animalsk væv under produktionen af JoVE-videoartiklen.

Al dyrepleje og procedurer blev udført under passende licenser udstedt af det britiske hjemmekontor i henhold til Animals (Scientific Procedures) Act (1986) og blev godkendt af Animal Welfare and Ethical Review Board ved Imperial College London.
1. Forberedelse af buffere
BEMÆRK: Denne del af protokollen kan udføres i god tid før resten af protokollen, bortset fra de sidste trin, der involverer fremstilling af modificeret Krebs-Henseleit Buffer (m...

<ol>
	<li>McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+excitability+of+mammalian+nerve+fibers:+Influence+of+afterpotentials+on+the+recovery+cycle.">Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle.</a> Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).</li><li>Pelot, N. A., Grill, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+excitation+and+kilohertz+frequency+block+of+the+rat+vagus+nerve.">In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).</li><li>Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kilohertz+electrical+stimulation+nerve+conduction+block:+Effects+of+electrode+surface+area.">Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).</li><li>Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+anaesthesia+on+somatosensory+evoked+potential+measurement+in+a+rat+model.">The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model.</a> Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).</li><li>Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+anesthesia+on+measures+of+nerve+conduction+velocity+in+male+C57Bl6/J+mice.">The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice.</a> Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).</li><li>Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-nerve+junctional+potentials.+The+distribution+of+small+motor+nerves+to+frog+skeletal+muscle,+and+the+membrane+characteristics+of+the+fibres+they+innervate.">Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate.</a> The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).</li><li>Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separability+of+neural+responses+to+standardised+mechanical+stimulation+of+limbs.">Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve.">Fiber composition of the rat sciatic nerve.</a> The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).</li><li>Kagiava, A., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+permeability+of+the+rat+sciatic+nerve+epineural+sheath+against+compounds+with+local+anesthetic+activity:+an+ex+vivo+electrophysiological+study.">Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).</li><li>Motori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+metabolic+rewiring+promotes+resilience+to+neurodegeneration+caused+by+mitochondrial+dysfunction.">Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction.</a> Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).</li><li>Schwarz, J. R., Eikhof, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+currents+and+action+potentials+in+rat+myelinated+nerve+fibres+at+20+and+37&#176;+C.">Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37&#176; C.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).</li><li>Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+uptake+of+the+peripheral+nerve+of+the+rat.">The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat.</a> Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).</li><li>Lehmann, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+changes+in+pH+on+the+action+of+mammalian+A+nerve+fibers.">The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers.</a> American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).</li><li>Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+homeostasis.">Acid-base homeostasis.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).</li><li>Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+protection+against+global+ischemia+with+Krebs-Henseleit+buffer-based+cardioplegic+solution.">Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).</li><li>Bailey, L. E., Ong, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Krebs-Henseleit+solution+as+a+physiological+buffer+in+perfused+and+superfused+preparations.">Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations.</a> Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).</li><li>Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sydney+Ringer:+physiological+saline,+calcium+and+the+contraction+of+the+heart.">Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart.</a> The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).</li><li>Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockage+of+chloride+channels+by+HEPES+buffer).">Blockage of chloride channels by HEPES buffer).</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).</li><li>Janz, G. J., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+halide+electrodes.+Preparation,+stability,+and+standard+potentials+in+aqueous+and+non-aqueous+media.">The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media.</a> Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).</li><li>Rapeaux, A., Constandinou, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HFAC+block-capable+and+module-extendable+4-channel+stimulator+for+acute+neurophysiology.">An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).</li><li>Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch&gt">https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch&gt</a> (2021)</li><li>Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fully+polymeric+electrode+arrays+for+peripheral+nerve+stimulation.">fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation.</a> Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).</li><li>Lossi, L., Merighi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ex+vivo+rodent+platforms+in+neuroscience+translational+research+with+attention+to+the+3Rs+philosophy.">The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy.</a> Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).</li></ol>

I dette arbejde beskrev vi en protokol til forberedelse af rotte iskiasnerver til ex vivo neurofysiologi. Vævsekstraktion tager cirka 30 minutter, inklusive dyrehåndtering, anæstesi, aflivning og dissektion, mens nerverensning, placering i badet og elektrodeimplantation bør kræve yderligere 30 minutter, før optagelsen kan startes. Bufferforberedelse kan udføres på 30 minutter, selvom dette kan gøres forud for resten af eksperimentet. Denne type præparat og forsøg er blevet anvendt og beskrevet i de se...

Den nuværende forståelse af grundlæggende nervefunktion som modelleret i silico mangler i flere aspekter, især med hensyn til virkningerne af nervevævsopdeling uden for soma, axon og dendritter. Axon-myelin-interaktioner forstås stadig dårligt som det fremgår af det faktum, at selv detaljerede beregningsnervemodeller såsom MRG1 (for pattedyrnerver), der tilstrækkeligt fanger konventionel elektrisk stimuleringsrespons, ikke fanger andre eksperimentelt observerede adfærd såsom højfrekvent blokoverførsel2 eller sekundær debutrespons3.
Denne protokol giver en metode til effektivt at undersøge neurofysiologiske processer på nerveniveau i en akut lille laboratoriedyrsmodel ved hjælp af en standardiseret forberedelsesprotokol til at isolere nerven, kontrollere dens miljø og fjerne den fra en in vivo-sammenhæng til en ex vivo-sammenhæng. Dette vil forhindre andre kropsprocesser eller anæstetika, der anvendes af in vivo nervestimuleringsprotokoller til at ændre nerveadfærd og forvirre målte resultater eller deres fortolkning 4,5. Dette muliggør udvikling af mere realistiske modeller, der udelukkende fokuserer på effekter, der er specifikke for nervevæv, der er dårligt forstået. Denne protokol er også nyttig som testbed til ny nervestimulering og registrering af elektrodematerialer og geometrier samt nye stimuleringsparadigmer såsom højfrekvent blok 2,3. Variationer af denne teknik er tidligere blevet brugt til at studere nervefysiologi under tæt kontrollerede forhold6, for eksempel til at måle ionkanaldynamik og egenskaber eller virkningerne af lokalbedøvelsesmidler7.
Denne teknik giver flere fordele sammenlignet med alternativer såsom akutte in vivo små dyreforsøg8. Teknikken undgår behovet for at opretholde anæstesidybden, da vævet er ekstraheret fra kroppen, hvilket reducerer mængden af nødvendigt udstyr såsom en bedøvelsesdiffusor, iltkoncentrator og varmepude. Dette forenkler den eksperimentelle protokol, hvilket reducerer risikoen for fejl. Da anæstetika potentielt kan ændre nervefunktion4, sikrer denne teknik, at målinger ikke vil blive forvirret af bivirkninger fra disse bedøvelsesforbindelser. Endelig er denne teknik mere hensigtsmæssig end akutte in vivo-eksperimenter , når man studerer virkningerne af neurotoksiske forbindelser, såsom tetrodotoxin, som ville dræbe et bedøvet dyr ved lammelse.
Perifere nerveafsnit er et unikt ex vivo-system , da der er stor chance for, at fibrene, der er ansvarlige for registrerede neurale signaler, ikke indeholder nogen soma. Da disse normalt ville være placeret, for motorneuroner, i rygsøjlen og for sensoriske neuroner i de dorsale rodganglier ved siden af rygsøjlen, kan forberedelsen af en sektion af pattedyrnerven groft modelleres som en samling rørformede membraner med ionkanaler, åbne i begge ender9. Metabolisme opretholdes af mitokondrierne placeret i axonen på tidspunktet for vævsdissektion10. Suturering af de åbne ender af axolemmaet tilskyndes efter ekstraktion til at lukke dem og derved hjælpe med at opretholde eksisterende ioniske gradienter over membranen, som er afgørende for normal nervefunktion.
For at opretholde vævshomeostase uden for kroppen skal flere miljøvariabler kontrolleres tæt. Disse er temperatur11, iltning12, osmolaritet, pH13,14 og adgang til glukose for at opretholde stofskiftet. Til denne protokol er fremgangsmåden at anvende en modificeret Krebs-Henseleit-buffer 15,16 (mKHB) kontinuerligt luftet med en blanding af ilt og kuldioxid. mKHB er i familien af kardioplegiske buffere 6,17, der bruges til at bevare dissekerede væv uden for kroppen, for eksempel i ex vivo-eksperimenter. Disse buffere indeholder ikke hæmoglobin, antibiotika eller svampemidler og er derfor kun egnede til præparater, der involverer små mængder væv i en begrænset periode. pH-kontrol blev opnået med carboncarbonat- og kuldioxidredoxparret, hvilket krævede konstant beluftning af bufferen med kuldioxid for at opretholde pH-ligevægt. Dette er for at undgå at bruge andre almindelige buffermidler såsom HEPES, som kan ændre nervecellefunktionen18. For at ilte bufferen og tilvejebringe pH-kontrol blev der anvendt en blanding af 5% kuldioxid i ilt kaldet carbogen (95%O2, 5% CO2). En varmeomrører blev brugt til temperaturregulering af en bufferbeholder, og bufferen blev perfunderet gennem et nervebad og derefter recirkuleret til startbeholderen. Et typisk eksperiment ville vare 6-8 timer, før nerven mister sin levedygtighed og ikke længere reagerer tilstrækkeligt på stimulering til, at foranstaltninger er repræsentative for sundt væv.
For at optimere signal-støj-forholdet blev sølvchloridelektroder anvendt til optagelse, som blev fremstillet i henhold til tidligere beskrevne metoder19. Til stimulering kan en kombination af kommercielle off-the-shelf platin manchetelektroder og specialfremstillede ledende polymer manchetelektroder anvendes. Ledende polymermanchetelektroder har markant højere ladningskapacitet, hvilket er nyttigt, når nerven stimuleres ved hjælp af bølgeformer med høj amplitude20.
Stimulatoren, der anvendes i denne protokol, er tidligere beskrevet20. Dokumentation, designfiler og softwarescripts til brug er offentligt tilgængelige21. Andre stimulatorer kan bruges til at udføre denne protokol; den brugerdefinerede stimulator er imidlertid også i stand til højfrekvent alternativ strøm (HFAC) blok 2,20, hvilket muliggør et bredere udvalg af neurofysiologiske eksperimenter. For at bruge HFAC-blok anbefales ledende elastomermanchetter for at undgå skade på nerven. Ledende elastomernervemanchetter er bløde og fuldt polymere elektrodearrays fremstillet af ledende elastomerer som den ledende komponent og polydimethylsiloxan som isoleringen22. Enheder blev fremstillet i en bipolar konfiguration ved hjælp af konventionelle lasermikrofabrikationsteknikker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Glass bottle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>215-1595</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Glass graduated flask</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>612-3626</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Glass bottle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>215-1596</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Glass graduated flask</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>BRND937254</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>536-2599</td>
			<td>push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkoxy conformal coating</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>1971829</td>
			<td>ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Chanelle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 2 L</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>213-0469</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar nerve cuff</td>
			<td>Cortec GMBH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bossheads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen canister</td>
			<td>BOC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>F-size canister</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, 15 mL volume</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive elastomer nerve cuff</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector, Termimate</td>
			<td>Mouser UK</td>
			<td>538-505073-1100-LP</td>
			<td>These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocodile clip connectors</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>212-1203</td>
			<td>These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Obtained from deionized water dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps angled 45 degrees</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91110-10</td>
			<td>Fine forceps, student range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps standard Dumont #7</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Student range forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Disperson Tube, Porosity 3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12547866</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose anhydrous, powder</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>101174Y</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grippers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory rod-mounted grippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Stirrer</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>768-9672</td>
			<td>Stuart US152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hemostat &#62;12 cm in length is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins, stainless steel, size 2</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>26001-45</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line Noise Filter</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Noise Preamplifier, SR560</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR560</td>
			<td>Low-noise voltage preamplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate salt</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>291184P</td>
			<td>500g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB scripts</td>
			<td>Github</td>
			<td>https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch</td>
			<td>Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Light, PL-2000</td>
			<td>Photonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, SMZ 745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SM745</td>
			<td>Stereoscopic Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, non-toxic</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>31911.A1</td>
			<td>Oil for nerve bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Bath</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>LeCroy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Hose, 1 meter</td>
			<td>BOC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1/4&#34; NPT terminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Regulator</td>
			<td>BOC</td>
			<td>C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4&#34;NPTF 230Bar</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Product may be obtained from third party supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, Glass</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>391-0580&#160;</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td>250 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Sulphate salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.0250</td>
			<td>250 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sprague Dawley, 250-330 grams, female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference electrode, ET072</td>
			<td>eDaQ (Australia)</td>
			<td>ET072-1</td>
			<td>Silver silver-chloride reference electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory rods with fittings for stands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>N/A</td>
			<td>M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight 12 cm edge</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91400-12</td>
			<td>blunt-blunt termination, student range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Acquisition Device</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>Micro3-1401</td>
			<td>Micro3-1401 Multichannel ADC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease, non-toxic</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>3821559</td>
			<td>for sealing of bath partition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, 2 mm inner diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, 5 mm inner diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41390</td>
			<td>0.5 mm, annealed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500g</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride salt</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>27810.295</td>
			<td>1 kg in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors angled 2 mm edge</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>15010-09</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory stands with sockets for rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td>DS3 or Custom Stimulator (see references)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring flea</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>442-0270</td>
			<td>For use with the heating stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe tip, blunt, 1 mm diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe tip, blunt, 2 mm diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, plastic, 10 mL volume</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>syringe should have luer lock fitting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape, water-resistant</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For securing tubing and wiring to workbench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>620-0806</td>
			<td>glass thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Power Bank</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>135-1000</td>
			<td>Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve, Leuer Lock, 3-Way</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>229-7440</td>
			<td>For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat sciatic nerve for ex vivo neurophysiology

Ex vivo-præparater gør det muligt at studere mange neurofysiologiske processer isoleret fra resten af kroppen, samtidig med at den lokale vævsstruktur bevares. Dette arbejde beskriver forberedelsen af rotte iskiasnerver til ex vivo neurofysiologi, herunder bufferforberedelse, dyreprocedurer, opsætning af udstyr og neurofysiologisk registrering. Dette arbejde giver et overblik over de forskellige typer eksperimenter, der er mulige med denne metode. Den skitserede metode sigter mod at tilvejebringe 6 timers stimulering og registrering på ekstraheret perifert nervevæv under tæt kontrollerede forhold for optimal konsistens i resultaterne. Resultater opnået ved hjælp af denne metode er A-fiber sammensatte aktionspotentialer (CAP) med peak-to-peak amplituder i millivoltområdet over hele eksperimentets varighed. CAP-amplituder og former er konsistente og pålidelige, hvilket gør dem nyttige til at teste og sammenligne nye elektroder med eksisterende modeller eller virkningerne af interventioner på vævet, såsom brugen af kemikalier, kirurgiske ændringer eller neuromodulerende stimuleringsteknikker. Både konventionelle kommercielt tilgængelige manchetelektroder med platin-iridiumkontakter og specialfremstillede ledende elastomerelektroder blev testet og gav lignende resultater med hensyn til nervestimuleringsstyrke-varighedsrespons.

Repræsentative resultater, der kan opnås med denne protokol, er de konsistente sammensatte handlingspotentialer fra A-type nervefibre i iskiasnerven. Disse aktionspotentialer har typisk en peak-to-peak amplitude på ca. 1 mV ved elektroden og derfor 100 mV, når den er amplificeret (figur 2). Lignende stimuleringsamplituder og pulsbredder bør give lignende CAP-amplituder. Ledende elastomermanchetelektroder vil generelt kræve lidt højere stimuleringsamplituder for at opnå den samme CAP-...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology at JoVE.com

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Denne protokol beskriver fremstillingen af hele iskiasnervevæv hos rotter til ex vivo elektrofysiologisk stimulering og registrering i et miljøreguleret, to-rums perfunderet saltvandsbad.

Forberedelse af rotte iskiasnerve til Ex Vivo neurofysiologi

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

Denne protokol muliggør observation af mange neurofysiologiske fænomener, der ikke er godt forstået, såsom nerveblokoverførsel efter højfrekvent / høj amplitudestrøminjektion, samtidig med at interferens fra andre processer i en levende krop forhindres. Denne teknik giver meget repeterbare, robuste resultater og er mere praktisk end in vivo elektrofysiologi, fordi komplekse variabler såsom anæstesidybde ikke behøver at blive kontrolleret og derfor ikke kan påvirke målinger. Efter en aflivningsprocedure under bedøvelse skal du placere en hunrotte på dissektionsbordet, holde anklen fast mellem tommelfingeren, pegefingeren og langfingeren og skære den calcaneale sene over ved hjælp af 12 centimeter lige stump saks.Brug fin tang og saks til at foretage forsigtige snit gennem muskellagene nær midten af bagsiden af benet, indtil iskiasnerven er udsat. Når nerven er synlig, fugtes hulrummet ved hjælp af iskold modificeret Krebs-Henseleit buffer eller MKHB for at forhindre nerven i at tørre ud. Brug hæmostater til at trække hudflapperne på hver side og holde snittet åbent for finere dissektion.Start fra den calcaneale sene snit placering, ved hjælp af fine saks, afbryde musklen på den mediale side af benet for at frigøre nerven. Fortsæt med at opretholde fugtniveauer i området med iskold MKHB. Da nerven udsættes, mens du bevæger dig op ad benet, dissekeres det overliggende muskelvæv.Frigør nerven tættere på rygsøjlen fra bindevæv, indtil den når rygsøjlen, på hvilket tidspunkt der er et knæk i nerven. Rengør ikke nerven endnu, da hastighed er afgørende på dette stadium. For at gøre dissektionen lettere, ved hjælp af pincet, træk forsigtigt enden af nerven nær anklen.Derefter, ved hjælp af fin saks, alvorlig nerven tæt på rygsøjlen. Anbring den dissekerede nerve i et 15-milliliter centrifugerør fyldt med MKHB, og læg røret tilbage på isen, indtil rengøringsproceduren påbegyndes. Fyld den overtrukne petriskål halvvejs med kølet iltet MKHB, læg derefter en dissekeret iskiasnerve i fadet og fastgør begge ender af nerven til fadet, så nerven er lige uden knæk, vrid eller vrid.Brug 6-0 silkesuturer eller fin tråd til at binde en dobbelt knude rundt om hver ende af nerven for at forhindre cytosollækage i bufferen. Placer knuderne lige ved siden af insektstifterne på siden tættere på midten af nerven for at forhindre lækage fra nervevæv i bufferen. Under et mikroskop skal du ved hjælp af to millimeter vinklet fjedersaks og fine tang fjerne fedt, blodkar og muskelvæv fra nerven.Beskær eventuelle nervegrene, der ikke vil blive brugt til stimulering og optagelse. Efter hvert femte minuts rengøring udskiftes bufferen med frisk, kølet, iltet MKHB. Efter rengøring anbringes nerven tilbage i transportrøret fyldt med buffer og hviles røret på is.Forbered et rent nervebad med dobbelt kammer. Brug standard laboratoriechefhoveder og gribere til at placere nervebadet under niveauet for den to-liters flaske, der er placeret på varmeomrøreren. Tilslut badets afløb til det peristaltiske pumpeindløb.Tilslut udløbet af den peristaltiske pumpe til et rør, der fører tilbage til bufferflasken. Tilslut badeindløbet til et rør med en justerbar strømningsventil og sæt røret inde i flasken. Brug en trevejsventil med en sprøjte forbundet til det midterste udløb for at hjælpe med at grunde røret som en sifon til tyngdekraftassisteret bufferindstrømning.Prime sifonen ved at trække sprøjten, indtil buffer strømmer ind i den. Konfigurer ventilen således, at bufferens strømningshastighed i badet er fem til seks millimeter i minuttet. Strømningshastigheden kan øges i første omgang for at fylde badet.Når badbufferniveauet har nået afløbet, skal du placere nerverne i badet. Brug en insektstift til at fastgøre enden af nerven i hjørnet af det bufferfyldte badekammer. Brug 45 graders vinklede fine tang og klem nerven kun i enderne, træk forsigtigt nerven, der skal stimuleres gennem hullet i skillevæggen mellem de to badekamre.Brug en insektstift til at fastgøre den anden ende af nerven i badets oliekammer og sikre, at nerven er lige uden at blive strakt og er fri for knæk og vendinger. Brug silikonefedt til at forsegle for at forhindre bufferlækage fra bufferkammeret ind i oliekammeret Fyld oliekammeret med silikone eller mineralolie. Anbring sølv/sølvkloridoptagelseselektrodekrogene i oliebadekammeret, og fastgør dem ved hjælp af bosshoveder og gribere.Drap derefter den del af nerven i oliebadet over krogene uden at trække nerven stramt. Juster eller reparer silikonefedtforseglingen, hvis der observeres lækage efter bevægelse af nerven. Referencesølv/sølvchloridelektroden tilsluttes forstærkerjorden, og elektroden anbringes i det bufferfyldte badekammer ved at fastgøre den ved hjælp af en laboratoriegriber.Efter klargøring af en ren nervemanchetelektrode til stimulering skal elektroden placeres i det bufferfyldte badekammer. Brug pincet eller fin pincet med stumpe eller vinklede spidser til at åbne elektroden i badet for at våde indersiden af manchetten. Hvis der er bobler tilbage, skal du bruge en fin sprøjte til at trække buffer fra badet og tvinge boblerne ud af manchetten.Brug en pincet til forsigtigt at åbne manchetten og skubbe den under nerven. Luk manchetten omkring nerven, undgå enhver kinking eller vridning af nerven. Tilslut stimuleringselektroden og strømreturelektroden til stimulatoren.Hvis du bruger et firkantet platinark som den aktuelle returelektrode, skal du placere arket væk fra nerven i badet. Fastgør begge elektroders bly med tape. Tilslut stimulatorens TTL-signaludgang til kanal fire af oscilloskopet.På oscilloskopskærmen skal du trykke på fanen Triggerkanal og angive kanal fire som den udløsende kanal. Indstil udløserniveauet til en volt ved hjælp af niveauknappen. På oscilloskopet indstilles tidsopløsningen til et millisekund pr. division og spændingsopløsningen til 10 millivolt pr. Division.Centrer udløserreferencen i tide, og indstil udløserniveauet til en volt. Når du har tilsluttet stimulatoren til computeren, skal du tænde stimulatoren ved at tilslutte batteriets strømforsyning til strømindgangen. Start derefter MATLAB-softwaren på computeren.Udfør det brugerdefinerede MATLAB-script. Åbn derefter det angivne MATLAB-script. Rediger scriptet og indstil parametrene stimulatorpulsamplitude til minus 300 mikroampere, stimulatorpulsbredde til 300 mikrosekunder, stimulatorantal impulser til 10 og stimulatortid mellem impulser til et sekund.Start stimuleringsprotokollen ved at klikke på Kør i softwaren. Det sammensatte handlingspotentiale eller CAP havde en top-til-top amplitude på en millivolt ved elektroden og 100 millivolt, når den blev forstærket. Den typiske nerve excitabilitet for standard platin nerve manchetter og specialfremstillede ledende elastomer nerve manchetter er vist her.CAP opnået ex vivo over en dag med eksperimenter ved hjælp af begge iskiasnerver er vist her. Minimal CAP amplitude reduktion blev observeret med højre iskiasnerve. I modsætning hertil svarede den venstre iskiasnerve CAP-amplitude ved ca. tre millivolt til den højre iskiasnerve ved starten af eksperimentet mere end seks timer efter nerveekstraktion.Fremhæv præcision og repeterbarhed i dissektions-, rengørings- og implementeringsteknik. Vær opmærksom på, hvad der sker i badet. Hvis nervesignalet går tabt, kan det simpelthen være, at elektroderne ikke er i den gode kontakt, eller at der er saltvand i badeolieskillevæggen, og ikke at nerven er død.Første gang brugere kan blive fristet til at skynde sig, især i dissektionsfasen. Dette vil sandsynligvis føre til fejl og beskadige nerven. Præcision og konsistens er nøglen her og vil føre til resultater af højere kvalitet.Der bør også lægges særlig vægt på konsistens i bufferforberedelsen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproducerbar Mouse iskiasnerven Crush og efterfølgende vurdering af Regeneration af Whole Mount Muskel Analyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In Vivo Elektrofysiologiske Målinger på Mouse iskiasnerver

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverførsel til Schwann-celler i Rodent iskiasnerven ved elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

In Vivo Elektrofysiologiske målinger af rotte Nervus Nerve med cytoskeletale ophidselse test

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Brug af in vivo single-fiber optagelse og intakt dorsale root ganglion med vedhæftet Sciatic nerve at undersøge mekanismen for lednings svigt

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Forberedelse af nyfødte rotte hjernevæv til Ultrastrukturel morfometrisk analyse af Synaptic Vesicle distribution på nerve terminaler

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Ex vivo oculomotor skive kultur fra embryonale GFP-udtrykker mus for tidsforskudt billeddannelse af oculomotor nerve outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse for funktionel evaluering i rottemodel af iskiasnerven crush skade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Ex vivo trykbærende Hippocampal kapillar-Parenchymal arteriole forberedelse til funktionel undersøgelse

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...