Name: preparation of rat sciatic nerve for ex vivo neurophysiology
Uploaded: 2022-07-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology at JoVE.com

著者らは、米国ペンシルベニア州プロイセンのキング・オブ・プロイセンであるグラクソ・スミスクライン・ファーマシューティカルズのジェラルド・ハンスバーガー博士とガルヴァーニ・バイオエレクトロニクス(英国スティーブネージ)が、独自の神経調製技術を当社と共有していることを認めています。著者らは、ロバート・トスがデュアルチャンバー神経浴の設計に成功したことを認めている。著者らは、Engineering and Physical Sciences Research Council(EPSRC)のHealthcare Technologies Challenge Awards(HTCA)助成金からの資金提供を認めている。著者らは、Adrien Rapeaux(EP/L016796/1)に資金を提供するため、Imperial College LondonのHigh Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training(HiPEDS CDT)を認めている。エイドリアン・ラポーは現在、英国認知症研究所、ケア研究技術センターから資金提供を受けています。著者らは、JoVEビデオ記事の制作中に実験と動物組織へのアクセスを支援してくれたインペリアルカレッジの生物工学科のザックベイリーに感謝しています。

すべての動物の世話と手順は、動物(科学的手続き)法(1986年)に基づいて英国内務省が発行した適切なライセンスに基づいて実施され、インペリアルカレッジロンドンの動物福祉倫理審査委員会によって承認されました。
1. バッファーの調製
注:プロトコルのこの部分は、1x濃度での修飾クレブス・ヘンゼライト緩衝液(mKHB)の調製を含む最終?...

<ol>
	<li>McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+excitability+of+mammalian+nerve+fibers:+Influence+of+afterpotentials+on+the+recovery+cycle.">Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle.</a> Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).</li><li>Pelot, N. A., Grill, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+excitation+and+kilohertz+frequency+block+of+the+rat+vagus+nerve.">In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).</li><li>Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kilohertz+electrical+stimulation+nerve+conduction+block:+Effects+of+electrode+surface+area.">Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).</li><li>Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+anaesthesia+on+somatosensory+evoked+potential+measurement+in+a+rat+model.">The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model.</a> Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).</li><li>Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+anesthesia+on+measures+of+nerve+conduction+velocity+in+male+C57Bl6/J+mice.">The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice.</a> Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).</li><li>Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-nerve+junctional+potentials.+The+distribution+of+small+motor+nerves+to+frog+skeletal+muscle,+and+the+membrane+characteristics+of+the+fibres+they+innervate.">Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate.</a> The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).</li><li>Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separability+of+neural+responses+to+standardised+mechanical+stimulation+of+limbs.">Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve.">Fiber composition of the rat sciatic nerve.</a> The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).</li><li>Kagiava, A., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+permeability+of+the+rat+sciatic+nerve+epineural+sheath+against+compounds+with+local+anesthetic+activity:+an+ex+vivo+electrophysiological+study.">Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).</li><li>Motori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+metabolic+rewiring+promotes+resilience+to+neurodegeneration+caused+by+mitochondrial+dysfunction.">Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction.</a> Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).</li><li>Schwarz, J. R., Eikhof, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+currents+and+action+potentials+in+rat+myelinated+nerve+fibres+at+20+and+37&#176;+C.">Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37&#176; C.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).</li><li>Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+uptake+of+the+peripheral+nerve+of+the+rat.">The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat.</a> Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).</li><li>Lehmann, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+changes+in+pH+on+the+action+of+mammalian+A+nerve+fibers.">The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers.</a> American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).</li><li>Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+homeostasis.">Acid-base homeostasis.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).</li><li>Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+protection+against+global+ischemia+with+Krebs-Henseleit+buffer-based+cardioplegic+solution.">Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).</li><li>Bailey, L. E., Ong, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Krebs-Henseleit+solution+as+a+physiological+buffer+in+perfused+and+superfused+preparations.">Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations.</a> Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).</li><li>Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sydney+Ringer:+physiological+saline,+calcium+and+the+contraction+of+the+heart.">Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart.</a> The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).</li><li>Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockage+of+chloride+channels+by+HEPES+buffer).">Blockage of chloride channels by HEPES buffer).</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).</li><li>Janz, G. J., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+halide+electrodes.+Preparation,+stability,+and+standard+potentials+in+aqueous+and+non-aqueous+media.">The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media.</a> Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).</li><li>Rapeaux, A., Constandinou, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HFAC+block-capable+and+module-extendable+4-channel+stimulator+for+acute+neurophysiology.">An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).</li><li>Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch&gt">https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch&gt</a> (2021)</li><li>Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fully+polymeric+electrode+arrays+for+peripheral+nerve+stimulation.">fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation.</a> Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).</li><li>Lossi, L., Merighi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ex+vivo+rodent+platforms+in+neuroscience+translational+research+with+attention+to+the+3Rs+philosophy.">The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy.</a> Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).</li></ol>

この研究では、エクスビボ神経生理学のためにラット坐骨神経を調製するためのプロトコルを記載した。組織の抽出には、動物の取り扱い、麻酔、カリング、解剖など約30分かかりますが、神経洗浄、浴槽への配置、電極移植には、記録を開始するまでにさらに30分かかります。バッファーの調製は30分で行うことができますが、これは残りの実験よりも先に行うことができます。この?...

インシリコでモデル化した基本的な神経機能の現在の理解は、いくつかの側面、特にソーマ、軸索、および樹状突起の外側の神経組織区画化の影響に関して欠けている。軸索-ミエリン相互作用は、従来の電気刺激応答を適切に捕捉するMRG1(哺乳動物神経用)などの詳細な計算神経モデルでさえ、高周波ブロックキャリーオーバー2または二次発症応答3などの実験的に観察された他の行動を捕捉しないという事実によって証明されるように、依然として十分に理解されていない。
このプロトコルは、標準化された調製プロトコルを使用して神経を単離し、その環境を制御し、in vivoの文脈からex vivoの文脈にそれを除去するために、急性小型実験動物モデルにおける神経レベルで神経生理学的プロセスを効率的に調査する方法を提供する。これは、in vivo神経刺激プロトコルによって使用される他の身体プロセスまたは麻酔薬が神経行動を変化させ、測定結果またはそれらの解釈を混乱させるのを防ぐであろう4,5。これにより、あまり理解されていない神経組織に特異的な効果のみに焦点を当てたより現実的なモデルの開発が可能になります。このプロトコルは、新しい神経刺激および記録電極材料および形状、ならびに高周波ブロック2,3などの新しい刺激パラダイムのテストベッドとしても有用である。この技術の変形は、例えば、イオンチャネルのダイナミクスおよび特性または局所麻酔薬7の効果を測定するために、厳密に制御された条件6における神経生理学を研究するために以前に使用されてきた。
この技術は、急性 インビボ 小動物実験8などの代替物と比較していくつかの利点を提供する。この技術は、組織が身体から抽出されたときに麻酔の深さを維持する必要性を排除し、麻酔薬ディフューザー、酸素濃縮器、加熱パッドなどの必要な機器の量を減らす。これにより、実験プロトコルが簡素化され、ミスのリスクが軽減されます。麻酔薬は潜在的に神経機能4を変化させる可能性があるため、この技術は、これらの麻酔薬化合物からの副作用によって測定値が混乱しないことを確実にする。最後に、この技術は、麻酔をかけられた動物を麻痺によって殺すテトロドトキシンなどの神経毒性化合物の効果を研究する際に、急性 のin vivo 実験よりも適切である。
末梢神経切片は、記録された神経信号の原因となる線維が体腫を含まない可能性が高いため、ユニークな エクスビボ システムです。これらは通常位置するように、運動ニューロン、脊椎、および脊椎の隣の背根神経節の感覚ニューロンの場合、哺乳類神経のセクションの調製は、両端に開いたイオンチャネルを有する管状膜の集合体として大まかにモデル化することができる9。代謝は、組織郭清10時に軸索に位置するミトコンドリアによって維持される。軸索腫の開放端の縫合は、抽出後にそれらを閉じるために奨励され、それによって正常な神経機能に不可欠な膜を横切る既存のイオン勾配を維持するのに役立つ。
組織恒常性を体外で維持するためには、いくつかの環境変数を厳密に制御する必要があります。これらは、温度11、酸素化12、浸透圧、pH13、14、および代謝を維持するためのグルコースへのアクセスである。このプロトコールの場合、アプローチは、酸素と二酸化炭素の混合物で連続的に通気された修飾クレブス・ヘンゼライト緩衝液15、16(mKHB)を使用することである。このmKHBは、例えばエクスビボ実験において、解剖された組織を体外に保存するために使用される心麻痺緩衝液6,17のファミリーにある。これらの緩衝液は、ヘモグロビン、抗生物質、または抗真菌剤を一切含まず、したがって、限られた時間の間、少量の組織を含む調製物にのみ適している。pH制御は、炭酸塩と二酸化炭素の酸化還元対で達成され、pH平衡を維持するために二酸化炭素による緩衝液の一定の曝気を必要とした。これは、神経細胞機能18を改変することができるHEPSなどの他の一般的な緩衝剤の使用を避けるためである。緩衝液を酸素化し、pH制御を提供するために、カルボゲンと呼ばれる酸素中の5%二酸化炭素の混合物(95%O2、5%CO2)を使用した。緩衝液容器の温度制御に加熱攪拌機を用い、緩衝液を神経浴中で灌流した後、出発容器に再循環させた。典型的な実験は、神経がその生存能力を失い、健康な組織を代表する尺度のための刺激にもはや十分に反応しなくなる前に、6〜8時間持続するであろう。
信号対雑音比を最適化するために、塩化銀電極を記録に使用し、これは先に記載した方法19に従って調製した。刺激のために、市販の白金カフ電極とカスタムメイドの導電性ポリマーカフ電極の組み合わせを使用することができる。導電性ポリマーカフ電極は、著しく高い電荷容量を有し、これは、高振幅波形20を用いて神経を刺激するときに有用である。
このプロトコルで使用される刺激器は、以前に20に記載された。ドキュメント、デザインファイル、およびそれを使用するためのソフトウェアスクリプトは、一般に公開されています21.他の刺激器は、このプロトコルを実行するために使用することができる。しかし、カスタム刺激器は、高周波代替電流(HFAC)ブロック2,20も可能であり、より広い範囲の神経生理学実験を可能にする。HFACブロックを使用するには、神経への損傷を避けるために導電性エラストマーカフをお勧めします。導電性エラストマー神経カフは、導電性成分としての導電性エラストマーおよび絶縁体としてのポリジメチルシロキサン22から製造された柔らかく完全にポリマーの電極アレイである。デバイスは、従来のレーザー微細加工技術を用いてバイポーラ構成で製造された。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Glass bottle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>215-1595</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Glass graduated flask</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>612-3626</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Glass bottle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>215-1596</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Glass graduated flask</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>BRND937254</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>536-2599</td>
			<td>push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkoxy conformal coating</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>1971829</td>
			<td>ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Chanelle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 2 L</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>213-0469</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar nerve cuff</td>
			<td>Cortec GMBH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bossheads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen canister</td>
			<td>BOC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>F-size canister</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, 15 mL volume</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive elastomer nerve cuff</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector, Termimate</td>
			<td>Mouser UK</td>
			<td>538-505073-1100-LP</td>
			<td>These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocodile clip connectors</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>212-1203</td>
			<td>These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Obtained from deionized water dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps angled 45 degrees</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91110-10</td>
			<td>Fine forceps, student range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps standard Dumont #7</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Student range forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Disperson Tube, Porosity 3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12547866</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose anhydrous, powder</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>101174Y</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grippers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory rod-mounted grippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Stirrer</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>768-9672</td>
			<td>Stuart US152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hemostat &#62;12 cm in length is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins, stainless steel, size 2</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>26001-45</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line Noise Filter</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Noise Preamplifier, SR560</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR560</td>
			<td>Low-noise voltage preamplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate salt</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>291184P</td>
			<td>500g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB scripts</td>
			<td>Github</td>
			<td>https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch</td>
			<td>Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Light, PL-2000</td>
			<td>Photonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, SMZ 745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SM745</td>
			<td>Stereoscopic Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, non-toxic</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>31911.A1</td>
			<td>Oil for nerve bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Bath</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>LeCroy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Hose, 1 meter</td>
			<td>BOC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1/4&#34; NPT terminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Regulator</td>
			<td>BOC</td>
			<td>C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4&#34;NPTF 230Bar</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Product may be obtained from third party supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, Glass</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>391-0580&#160;</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td>250 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Sulphate salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.0250</td>
			<td>250 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sprague Dawley, 250-330 grams, female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference electrode, ET072</td>
			<td>eDaQ (Australia)</td>
			<td>ET072-1</td>
			<td>Silver silver-chloride reference electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory rods with fittings for stands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>N/A</td>
			<td>M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight 12 cm edge</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91400-12</td>
			<td>blunt-blunt termination, student range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Acquisition Device</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>Micro3-1401</td>
			<td>Micro3-1401 Multichannel ADC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease, non-toxic</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>3821559</td>
			<td>for sealing of bath partition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, 2 mm inner diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, 5 mm inner diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41390</td>
			<td>0.5 mm, annealed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500g</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride salt</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>27810.295</td>
			<td>1 kg in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors angled 2 mm edge</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>15010-09</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory stands with sockets for rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td>DS3 or Custom Stimulator (see references)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring flea</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>442-0270</td>
			<td>For use with the heating stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe tip, blunt, 1 mm diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe tip, blunt, 2 mm diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, plastic, 10 mL volume</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>syringe should have luer lock fitting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape, water-resistant</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For securing tubing and wiring to workbench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>620-0806</td>
			<td>glass thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Power Bank</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>135-1000</td>
			<td>Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve, Leuer Lock, 3-Way</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>229-7440</td>
			<td>For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat sciatic nerve for ex vivo neurophysiology

Ex vivo 製剤は、局所組織構造を維持しながら、身体の他の部分から隔離された多くの神経生理学的プロセスの研究を可能にする。この研究は、緩衝液調製、動物処置、機器のセットアップおよび神経生理学的記録を含む、 エクスビボ 神経生理学のためのラット坐骨神経の調製を記述する。この研究は、この方法で可能なさまざまな種類の実験の概要を提供します。概説された方法は、結果の最適な一貫性のために、厳密に制御された条件下で抽出された末梢神経組織に6時間の刺激および記録を提供することを目的としている。この方法を用いて得られた結果は、実験の全期間にわたってミリボルト範囲のピークツーピーク振幅を有するA繊維化合物活動電位(CAP)である。CAPの振幅と形状は一貫しており信頼性が高いため、新しい電極を既存のモデルと比較したり、化学物質の使用、外科的変化、神経調節刺激技術などの組織に対する介入の影響をテストして比較するのに役立ちます。白金-イリジウム接点を備えた従来の市販のカフ電極とカスタムメイドの導電性エラストマー電極の両方を試験し、神経刺激強度 - 持続時間応答の点で同様の結果を与えた。

このプロトコールで得ることができる代表的な結果は、坐骨神経内のA型神経線維からの一貫した化合物活動電位である。これらの活動電位は、通常、電極で約1mVのピークtoピーク振幅を持ち、したがって一度増幅すると100mVになります(図2)。同様の刺激振幅とパルス幅は、同様のCAP振幅をもたらすはずです。導電性エラストマーカフ電極は、一般に、市販の白金カフ電?...

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Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

このプロトコールは、 エキソビボ 電気生理学的刺激および環境的に調節された2区画の灌流生理食塩水浴中での記録のためのラット全坐骨神経組織の調製を記載している。

Ex Vivo神経生理学のためのラット坐骨神経の調製

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

このプロトコルは、生体内の他のプロセスからの干渉を防ぎながら、高周波/高振幅電流注入後の神経ブロックキャリーオーバーなど、よく理解されていない多くの神経生理学的現象の観察を可能にします。この技術は、再現性が高く堅牢な結果をもたらし、麻酔の深さなどの複雑な変数を制御する必要はなく、したがって測定に影響を与えることができないため、in vivo電気生理学よりも実用的です。麻酔下での安楽死後、雌ラットを解剖台の上に置き、足首を親指、人差し指、中指でしっかりと保持し、12センチのまっすぐな鈍いはさみで踵骨腱を切断します。細かい鉗子とはさみを使って、坐骨神経が露出するまで、脚の後ろの中央付近の筋肉層を通して慎重に切開します。神経が見えたら、氷冷修飾クレブス・ヘンゼライト緩衝液(MKHB)を使用して空洞に潤いを与え、神経が乾燥するのを防ぎます。止血剤を使用して、両側の皮膚のフラップを引っ張り、より細かい解剖のために切開部を開いたままにします。踵骨腱切開位置から始めて、細かいはさみを使用して、脚の内側の筋肉を中断して神経を解放します。氷のように冷たいMKHBで地域の水分レベルを維持し続けます。脚を上に動かしながら神経が露出したので、その上にある筋肉組織を解剖します。脊椎に近い神経を結合組織から脊椎間隙に到達するまで解放し、その時点で神経にねじれがある。この段階ではスピードが不可欠であるため、まだ神経をきれいにしないでください。解剖を容易にするために、鉗子を使用して、足首の近くの神経の端を静かに引っ張ります。その後、細かいはさみを用いて、脊椎に近い神経を重症化する。解剖した神経をMKHBで満たされた15ミリリットルの遠心チューブに入れ、洗浄手順の開始までチューブを氷の上に戻します。コーティングされたペトリ皿を冷やした酸素化MKHBで半分満たし、解剖した坐骨神経を皿に入れ、神経の両端を皿に固定して、神経がねじれ、ねじれ、ねじれのないまっすぐになるようにします。6-0シルク縫合糸または細い糸を使用して、神経の両端の周りに二重の結び目を結び、緩衝液への細胞質ゾルの漏れを防ぎます。神経組織から緩衝液への漏れを防ぐために、神経の中心に近い側の昆虫ピンのすぐ隣に結び目を置きます。顕微鏡下で、2ミリメートルの角度を付けたスプリングはさみと細かい鉗子を使用して、神経から脂肪、血管、筋肉組織を取り除きます。刺激や記録に使用されない神経枝を剪定します。洗浄の5分ごとに、バッファーを新鮮な、冷やされた酸素化されたMKHBと交換してください。洗浄後、神経を緩衝液で満たされた輸送チューブに戻して、チューブを氷の上に置きます。清潔な両室の神経浴を準備します。標準的な実験室のボスヘッドとグリッパーを使用して、神経浴を加熱攪拌機に置かれた2リットルのボトルのレベルの下に置きます。バスのドレンをペリスタルティックポンプの入口に接続します。ペリスタルティックポンプの出口をバッファボトルに戻るチューブに接続します。バスインレットを調整可能な流量バルブでチューブに接続し、チューブをボトル内に入れます。中央の出口に接続されたシリンジを備えた三方弁を使用して、重力支援バッファー流入用のサイフォンとしてチューブをプライミングするのに役立ちます。バッファがシリンジに流れるまでシリンジを引き抜いてサイフォンをプライムします。浴へのバッファ流量が毎分5〜6ミリメートルになるようにバルブを構成します。流量は、最初に浴を満たすために増加させることができる。浴槽の緩衝レベルが排水管に達したら、神経を風呂に入れます。昆虫ピンを使用して、神経の端をバッファーで満たされた浴室の角に固定します。45度の角度の細かい鉗子を使用し、両端のみで神経をつまみ、2つの浴室の間の仕切りの穴を通して刺激される神経を慎重にねじ込みます。昆虫ピンを使用して、神経の他端を風呂の油室に固定し、神経が引き伸ばされずにまっすぐで、ねじれやねじれがないことを確認します。シリコーングリースを使用して、バッファーチャンバーからオイルチャンバーへのバッファー漏れを防ぐためにシールを作ります オイルチャンバーをシリコーンまたは鉱物油で満たします。銀/塩化銀記録電極フックをオイルバスチャンバーに置き、ボスヘッドとグリッパーで固定します。次に、神経を引き締めることなく、オイルバス内の神経の部分をフックの上にドレープします。神経を動かした後に漏れが観察された場合は、シリコーングリースシールを調整または修復してください。基準銀/塩化銀電極をアンプのグランドに接続し、電極をバッファーで満たされた浴室に、実験室用グリッパーを使用して固定して配置します。刺激のためにきれいな神経カフ電極を調製した後、電極を緩衝液充填浴室に置く。先端が鈍い、または角度のある鉗子または細かいピンセットを使用して、バス内の電極を開き、袖口の内側を濡らします。泡が残っている場合は、細かい注射器を使用して浴からバッファーを引き出し、泡を袖口から強制的に取り出します。ピンセットを使用して、袖口を静かに開き、神経の下にスライドさせます。神経の周りの袖口を閉じ、神経のねじれやねじれを避けます。刺激電極と電流戻し電極を刺激装置に接続します。電流リターン電着として正方形の白金シートを使用する場合は、お風呂の中で神経から離れてシートを置きます。両方の電極のリード線をテープで固定します。スティミュレータTTL信号出力をオシロスコープのチャンネル4に接続します。オシロスコープ画面で、[トリガチャンネル]タブを押し、トリガチャンネルとしてチャンネル4を指定します。レベルノブを使用してトリガーレベルを1ボルトに設定します。オシロスコープで、時間分解能を分割あたり1ミリ秒、電圧分解能を1分割あたり10ミリボルトに設定します。トリガリファレンスを時間内にセンタリングし、トリガレベルを1ボルトに設定します。刺激装置をコンピュータに接続した後、バッテリ電源を電源入力に接続して、刺激装置の電源を入れます。次に、コンピューターで MATLAB ソフトウェアを起動します。カスタム MATLAB スクリプトを実行します。次に、示された MATLAB スクリプトを開きます。スクリプトを編集し、パラメータ刺激器パルス振幅をマイナス300マイクロアンペア、刺激器パルス幅を300マイクロ秒、刺激器パルス数を10、刺激器パルス間時間を1秒に設定します。ソフトウェアで[実行]をクリックして刺激プロトコルを開始します。化合物活動電位(CAP)は、電極で1ミリボルト、増幅時に100ミリボルトのピークツーピーク振幅を有していた。標準的なプラチナ神経袖口およびカスタムメイドの導電性エラストマー神経袖口の典型的な神経興奮性がここに示されている。両方の坐骨神経を用いた実験の1日にわたってエキソビボで得られたCAPをここに示す。最小のCAP振幅減少は、右坐骨神経で観察された。対照的に、約3ミリボルトの左坐骨神経CAP振幅は、神経抽出後6時間以上経過した実験開始時の右坐骨神経の振幅と類似していた。解剖、洗浄、および実装技術における精度と再現性を重視する。お風呂で何が起こっているのかに注意してください。神経信号が失われた場合、それは単に電極が良好に接触していないか、またはバスオイル仕切りに生理食塩水があることであり、神経が死んでいることではない。初めてのユーザーは、特に解剖段階では、急いでいるように誘惑されるかもしれません。これはおそらく間違いにつながり、神経を傷つけるでしょう。ここでは精度と一貫性が重要であり、より高品質の結果につながります。バッファー調製の一貫性にも特別な注意を払う必要があります。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

ラット坐骨神経からの軸索原形質分離

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

マウス坐骨神経に生体内電気生理学的測定値の

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

エレクトロポレーションによる齧歯類坐骨神経内のシュワン細胞へのインビボ遺伝子導入で

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

生体内で軸索興奮性のテストでラットの尺骨神経の電気生理学的測定

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

インビボシングルファイバー記録と無傷の後部根神経を用いて伝導障害のメカニズムを調べる

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Ultrastructural のための新生ラット脳組織の調製 Morphometric 神経末端におけるシナプス小胞分布の解析

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

坐骨神経クラッシュ損傷のラットモデルにおける機能的評価のための3D運動学的解析

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

機能的研究のためのEx Vivo加圧海馬毛細血管-パンレンキマル動脈製剤

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...