Name: preparation of rat sciatic nerve for ex vivo neurophysiology
Uploaded: 2022-07-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology at JoVE.com

Os autores reconhecem o Dr. Gerald Hunsberger da GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, Rei da Prússia, PA, EUA e Galvani Bioelectronics (Stevenage, Reino Unido) por compartilharem sua técnica original de preparação nervosa conosco. Os autores reconhecem Robert Toth pelo projeto do banho nervoso de Câmara Dupla. Os autores reconhecem o financiamento da bolsa do Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas (EPSRC). Os autores reconhecem o Centro de Sistemas Incorporados e Distribuídos de Alto Desempenho para Treinamento de Doutorado (HiPEDS CDT) do Imperial College London por financiar Adrien Rapeaux (EP/L016796/1 ). Adrien Rapeaux é atualmente financiado pelo Uk Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Os autores agradecem Zack Bailey do Imperial College, no Departamento de Bioengenharia, por ajuda com experimentos e acesso a tecidos animais durante a produção do artigo de vídeo jove.

Todos os cuidados e procedimentos de animais foram realizados sob licenças apropriadas emitidas pelo Escritório do Reino Unido sob a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) (1986) e foram aprovados pelo Conselho de Bem-Estar Animal e Revisão Ética do Imperial College London.
1. Preparação de tampões
NOTA: Esta parte do protocolo pode ser realizada bem antes do resto do protocolo, exceto para as etapas finais envolvendo a preparação do Buf...

<ol>
	<li>McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+excitability+of+mammalian+nerve+fibers:+Influence+of+afterpotentials+on+the+recovery+cycle.">Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle.</a> Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).</li><li>Pelot, N. A., Grill, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+excitation+and+kilohertz+frequency+block+of+the+rat+vagus+nerve.">In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).</li><li>Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kilohertz+electrical+stimulation+nerve+conduction+block:+Effects+of+electrode+surface+area.">Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).</li><li>Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+anaesthesia+on+somatosensory+evoked+potential+measurement+in+a+rat+model.">The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model.</a> Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).</li><li>Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+anesthesia+on+measures+of+nerve+conduction+velocity+in+male+C57Bl6/J+mice.">The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice.</a> Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).</li><li>Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-nerve+junctional+potentials.+The+distribution+of+small+motor+nerves+to+frog+skeletal+muscle,+and+the+membrane+characteristics+of+the+fibres+they+innervate.">Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate.</a> The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).</li><li>Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separability+of+neural+responses+to+standardised+mechanical+stimulation+of+limbs.">Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve.">Fiber composition of the rat sciatic nerve.</a> The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).</li><li>Kagiava, A., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+permeability+of+the+rat+sciatic+nerve+epineural+sheath+against+compounds+with+local+anesthetic+activity:+an+ex+vivo+electrophysiological+study.">Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).</li><li>Motori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+metabolic+rewiring+promotes+resilience+to+neurodegeneration+caused+by+mitochondrial+dysfunction.">Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction.</a> Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).</li><li>Schwarz, J. R., Eikhof, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+currents+and+action+potentials+in+rat+myelinated+nerve+fibres+at+20+and+37&#176;+C.">Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37&#176; C.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).</li><li>Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+uptake+of+the+peripheral+nerve+of+the+rat.">The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat.</a> Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).</li><li>Lehmann, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+changes+in+pH+on+the+action+of+mammalian+A+nerve+fibers.">The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers.</a> American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).</li><li>Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+homeostasis.">Acid-base homeostasis.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).</li><li>Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+protection+against+global+ischemia+with+Krebs-Henseleit+buffer-based+cardioplegic+solution.">Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).</li><li>Bailey, L. E., Ong, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Krebs-Henseleit+solution+as+a+physiological+buffer+in+perfused+and+superfused+preparations.">Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations.</a> Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).</li><li>Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sydney+Ringer:+physiological+saline,+calcium+and+the+contraction+of+the+heart.">Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart.</a> The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).</li><li>Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockage+of+chloride+channels+by+HEPES+buffer).">Blockage of chloride channels by HEPES buffer).</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).</li><li>Janz, G. J., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+halide+electrodes.+Preparation,+stability,+and+standard+potentials+in+aqueous+and+non-aqueous+media.">The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media.</a> Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).</li><li>Rapeaux, A., Constandinou, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HFAC+block-capable+and+module-extendable+4-channel+stimulator+for+acute+neurophysiology.">An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).</li><li>Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch&gt">https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch&gt</a> (2021)</li><li>Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fully+polymeric+electrode+arrays+for+peripheral+nerve+stimulation.">fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation.</a> Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).</li><li>Lossi, L., Merighi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ex+vivo+rodent+platforms+in+neuroscience+translational+research+with+attention+to+the+3Rs+philosophy.">The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy.</a> Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).</li></ol>

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para preparar nervos ciáticos de ratos para neurofisiologia ex vivo. A extração de tecidos leva aproximadamente 30 minutos, incluindo manuseamento animal, anestesia, abate e dissecção, enquanto a limpeza nervosa, a colocação no banho e a implantação de eletrodos devem exigir 30 minutos adicionais antes que a gravação possa ser iniciada. A preparação do buffer pode ser realizada em 30 minutos, embora isso possa ser feito antes do resto do experimento. Este tip...

A compreensão atual da função nervosa fundamental modelada no sílico está em falta em vários aspectos, notadamente no que diz respeito aos efeitos da compartimentação do tecido nervoso fora da soma, axônio e dendritos. As interações axon-mielina ainda são mal compreendidas como evidenciadas pelo fato de que mesmo modelos detalhados de nervo computacional, como o MRG1 (para nervos mamíferos) que captam adequadamente a resposta convencional de estimulação elétrica, não capturam outros comportamentos experimentalmente observados, como o transporte de blocos de alta frequência2 ou a resposta de início secundário3.
Este protocolo fornece um método para investigar eficientemente processos neurofisiológicos ao nível nervoso em um pequeno modelo animal de laboratório agudo, utilizando um protocolo de preparação padronizado para isolar o nervo, controlar seu ambiente e removê-lo de um contexto in vivo para um contexto ex vivo. Isso evitará outros processos corporais ou anestésicos usados por protocolos de estimulação nervosa in vivo para alterar o comportamento nervoso e confundir resultados medidos ou sua interpretação 4,5. Isso permite o desenvolvimento de modelos mais realistas focando apenas em efeitos específicos para tecidos nervosos que são mal compreendidos. Este protocolo também é útil como um teste para novos materiais e geometrias de estimulação nervosa e gravação, bem como novos paradigmas de estimulação, como o bloco de alta frequência 2,3. Variações dessa técnica têm sido utilizadas anteriormente para estudar fisiologia nervosa em condições bem controladas6, por exemplo, para medir a dinâmica e propriedades do canal de íons ou os efeitos dos anestésicos locais7.
Esta técnica oferece várias vantagens em comparação com alternativas como a experimentação aguda in vivo de pequenos animais8. A técnica evita a necessidade de manter a profundidade da anestesia, uma vez que o tecido foi extraído do corpo, reduzindo a quantidade de equipamentos necessários, como difusor anestésico, concentrador de oxigênio e almofada de aquecimento. Isso simplifica o protocolo experimental, reduzindo o risco de erros. Como os anestésicos podem potencialmente alterar a função nervosa4, esta técnica garante que as medidas não serão confundidas por efeitos colaterais desses compostos anestésicos. Finalmente, essa técnica é mais apropriada do que experimentos in vivo agudos ao estudar os efeitos de compostos neurotóxicos como a tetrodotoxina, que mataria um animal anestesiado por paralisia.
As seções nervosas periféricas são um sistema ex vivo único, pois há uma grande chance de que as fibras responsáveis pelos sinais neurais registrados não contenham nenhuma soma. Como estes normalmente seriam localizados, para neurônios motores, na coluna vertebral, e para neurônios sensoriais no gânglio dorsal ao lado da coluna vertebral, a preparação de uma seção do nervo mamífero pode ser aproximadamente modelada como uma coleção de membranas tubulares com canais de íons, abertas em ambas as extremidades9. O metabolismo é mantido pelas mitocôndrias localizadas no axônio no momento da dissecação tecidual10. A sutura das extremidades abertas do axolemma é encorajada após a extração para fechá-las e, assim, ajudar a manter os gradientes iônicos existentes em toda a membrana, que são essenciais para a função nervosa normal.
Para manter a homeostase tecidual fora do corpo, várias variáveis ambientais devem ser fortemente controladas. Sãotemperaturas 11, oxigenação12, osmolaridade, pH13,14 e acesso à glicose para manter o metabolismo. Para este protocolo, a abordagem é usar um buffer Krebs-Henseleit modificado 15,16 (mKHB) continuamente arejado com uma mistura de oxigênio e dióxido de carbono. O mKHB está na família de tampões cardioplégicos 6,17 usados para preservar tecidos dissecados fora do corpo, por exemplo, em experimentos ex vivo. Estes tampões não contêm hemoglobina, antibióticos ou antifúngicos e são, portanto, adequados apenas para preparações envolvendo pequenas quantidades de tecido por um tempo limitado. o controle de pH foi alcançado com o par de carbonato e dióxido de carbono redox, exigindo aeração constante do tampão com dióxido de carbono para manter o equilíbrio do pH. Isto é para evitar o uso de outros agentes de buffering comuns, como o HEPES, que pode modificar a função da célula nervosa18. Para oxigenar o tampão e fornecer controle de pH, foi utilizada uma mistura de 5% de dióxido de carbono em oxigênio chamado carbogen (95% O2, 5% CO2). Um agitador de aquecimento foi usado para o controle de temperatura de um recipiente tampão, e o tampão foi perfundido através de um banho nervoso, e depois recirculado para o recipiente de partida. Um experimento típico duraria de 6-8 h antes que o nervo perca sua viabilidade e não responda mais o suficiente à estimulação de medidas representativas do tecido saudável.
Para otimizar a relação sinal-ruído, foram utilizados eletrodos de cloreto de prata para gravação, que foram preparados de acordo com os métodos descritos anteriormente19. Para estimulação, uma combinação de eletrodos comerciais de punho de platina fora da prateleira e eletrodos de manguitos condutores personalizados podem ser usados. Os eletrodos condutores do manguito de polímero têm capacidades de carga notavelmente mais elevadas, que são úteis ao estimular o nervo usando formas de onda de alta amplitude20.
O estimulador utilizado neste protocolo foi descrito anteriormente20. Documentação, arquivos de design e scripts de software para usá-lo estão disponíveis publicamente21. Outros estimuladores podem ser usados para executar este protocolo; no entanto, o estimulador personalizado também é capaz de bloquear 2,20 blocos de corrente alternativa de alta frequência (HFAC), que permite uma gama mais ampla de experimentos de neurofisiologia. Para usar o bloco HFAC, recomenda-se que as algemas elastômeras condutoras evitem danos ao nervo. As algemas hemóstulas condutoras são matrizes de eletrodos suaves e totalmente poliméricas produzidas a partir de elastômeros condutivos como componente condutor e polidimtilsiloxano como o isolamento22. Os dispositivos foram fabricados em uma configuração bipolar utilizando técnicas convencionais de microfabização a laser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Glass bottle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>215-1595</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Glass graduated flask</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>612-3626</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Glass bottle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>215-1596</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Glass graduated flask</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>BRND937254</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>536-2599</td>
			<td>push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkoxy conformal coating</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>1971829</td>
			<td>ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Chanelle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 2 L</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>213-0469</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar nerve cuff</td>
			<td>Cortec GMBH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bossheads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen canister</td>
			<td>BOC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>F-size canister</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, 15 mL volume</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive elastomer nerve cuff</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector, Termimate</td>
			<td>Mouser UK</td>
			<td>538-505073-1100-LP</td>
			<td>These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocodile clip connectors</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>212-1203</td>
			<td>These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Obtained from deionized water dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps angled 45 degrees</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91110-10</td>
			<td>Fine forceps, student range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps standard Dumont #7</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Student range forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Disperson Tube, Porosity 3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12547866</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose anhydrous, powder</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>101174Y</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grippers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory rod-mounted grippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Stirrer</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>768-9672</td>
			<td>Stuart US152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hemostat &#62;12 cm in length is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins, stainless steel, size 2</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>26001-45</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line Noise Filter</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Noise Preamplifier, SR560</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR560</td>
			<td>Low-noise voltage preamplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate salt</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>291184P</td>
			<td>500g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB scripts</td>
			<td>Github</td>
			<td>https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch</td>
			<td>Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Light, PL-2000</td>
			<td>Photonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, SMZ 745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SM745</td>
			<td>Stereoscopic Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, non-toxic</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>31911.A1</td>
			<td>Oil for nerve bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Bath</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>LeCroy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Hose, 1 meter</td>
			<td>BOC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1/4&#34; NPT terminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Regulator</td>
			<td>BOC</td>
			<td>C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4&#34;NPTF 230Bar</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Product may be obtained from third party supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, Glass</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>391-0580&#160;</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td>250 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Sulphate salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.0250</td>
			<td>250 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sprague Dawley, 250-330 grams, female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference electrode, ET072</td>
			<td>eDaQ (Australia)</td>
			<td>ET072-1</td>
			<td>Silver silver-chloride reference electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory rods with fittings for stands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>N/A</td>
			<td>M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight 12 cm edge</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91400-12</td>
			<td>blunt-blunt termination, student range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Acquisition Device</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>Micro3-1401</td>
			<td>Micro3-1401 Multichannel ADC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease, non-toxic</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>3821559</td>
			<td>for sealing of bath partition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, 2 mm inner diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, 5 mm inner diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41390</td>
			<td>0.5 mm, annealed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500g</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride salt</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>27810.295</td>
			<td>1 kg in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors angled 2 mm edge</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>15010-09</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory stands with sockets for rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td>DS3 or Custom Stimulator (see references)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring flea</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>442-0270</td>
			<td>For use with the heating stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe tip, blunt, 1 mm diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe tip, blunt, 2 mm diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, plastic, 10 mL volume</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>syringe should have luer lock fitting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape, water-resistant</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For securing tubing and wiring to workbench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>620-0806</td>
			<td>glass thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Power Bank</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>135-1000</td>
			<td>Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve, Leuer Lock, 3-Way</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>229-7440</td>
			<td>For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat sciatic nerve for ex vivo neurophysiology

As preparações ex vivo permitem o estudo de muitos processos neurofisiológicos isolados do resto do corpo, preservando a estrutura tecidual local. Este trabalho descreve a preparação de nervos ciáticos de ratos para neurofisiologia ex vivo, incluindo preparação de tampão, procedimentos animais, instalação de equipamentos e gravação neurofisiológica. Este trabalho fornece uma visão geral dos diferentes tipos de experimentos possíveis com este método. O método delineado visa fornecer 6h de estimulação e registro em tecido nervoso periférico extraído em condições bem controladas para a melhor consistência nos resultados. Os resultados obtidos usando este método são potenciais de ação composto de fibra A (CAP) com amplitudes de pico a pico na faixa de milívolo durante toda a duração do experimento. As amplitudes e formas da CAP são consistentes e confiáveis, tornando-as úteis para testar e comparar novos eletrodos aos modelos existentes, ou os efeitos de intervenções no tecido, como o uso de produtos químicos, alterações cirúrgicas ou técnicas de estimulação neuromodulatória. Ambos os eletrodos convencionais de punho disponíveis comercialmente com contatos de platina-irídio e eletrodos de elastômero condutivo personalizados foram testados e deram resultados semelhantes em termos de resposta de resistência ao estímulo nervoso.

Resultados representativos que podem ser obtidos com este protocolo são os potenciais de ação composto consistentes das fibras nervosas do tipo A dentro do nervo ciático. Esses potenciais de ação normalmente têm uma amplitude de pico a pico de aproximadamente 1 mV no eletrodo e, portanto, 100 mV uma vez amplificados (Figura 2). Amplitudes de estimulação semelhantes e larguras de pulso devem produzir amplitudes PAC semelhantes. Os eletrodos de manguitos de elastômero condutores gera...

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Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Este protocolo descreve a preparação de tecido nervoso ciático inteiro de rato para estimulação eletrofisiológica ex vivo e registro em um banho salino ambientalmente regulado, com dois compartimentos e perfumado.

Preparação do Nervo Ciático de Ratos para Neurofisiologia Ex Vivo

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

Este protocolo permite a observação de muitos fenômenos neurofisiológicos que não são bem compreendidos, como a transferência do bloqueio nervoso após a alta frequência/alta injeção de corrente de amplitude, evitando interferências de outros processos em um corpo vivo. Essa técnica produz resultados altamente repetitivos e robustos e é mais prática do que a eletrofisiologia in vivo, pois variáveis complexas como a profundidade da anestesia não têm que ser controladas e, portanto, não podem influenciar as medições. Após um procedimento de eutanásia sob anestésico, coloque um rato fêmea na mesa de dissecção, segure firmemente o tornozelo entre o polegar, o dedo indicador e o dedo médio, e corte o tendão calcâneo usando uma tesoura sem cortes de 12 centímetros.Usando fórceps finos e tesouras, faça incisões cuidadosas através das camadas musculares perto do meio da parte de trás da perna até que o nervo ciático seja exposto. Uma vez que o nervo seja visível, hidrate a cavidade usando tampão Krebs-Henseleit modificado no gelo, ou MKHB, para evitar que o nervo seque. Usando hemostatas, puxe os retalhos da pele de cada lado e mantenha a incisão aberta para dissecção mais fina.A partir do local de incisão do tendão calcâneo, usando uma tesoura fina, interrompa o músculo do lado medial da perna para liberar o nervo. Continue mantendo os níveis de umidade na área com MKHB gelado. À medida que o nervo é exposto enquanto se move para cima da perna, dissecar o tecido muscular sobreposto.Liberte o nervo mais próximo da coluna vertebral dos tecidos conjuntivos até atingir a fissura espinhal, momento em que há uma torção no nervo. Não limpe o nervo ainda, pois a velocidade é essencial nesta fase. Para facilitar a dissecção, usando fórceps, puxe suavemente a extremidade do nervo perto do tornozelo.Em seguida, usando uma tesoura fina, corte o nervo perto da coluna. Coloque o nervo dissecado em um tubo de centrífuga de 15 mililitros cheio de MKHB e coloque o tubo de volta no gelo até o início do procedimento de limpeza. Encha a placa de Petri revestida no meio do caminho com MKHB oxigenado resfriado, em seguida, coloque um nervo ciático dissecado na placa e fixe ambas as extremidades do nervo para o prato de tal forma que o nervo é reto sem torções, torção ou torções.Usando suturas de seda 6-0 ou rosca fina, amarre um nó duplo em cada extremidade do nervo para evitar o vazamento de citoso no tampão. Coloque os nós ao lado dos pinos de insetos ao lado mais perto do centro do nervo para evitar vazamentos do tecido nervoso no tampão. Sob um microscópio, usando tesouras de mola angular de dois milímetros e fórceps finos, remova gordura, vasos sanguíneos e tecido muscular do nervo.Podar quaisquer ramos nervosos que não serão usados na estimulação e gravação. Após cada cinco minutos de limpeza, substitua o tampão por MKHB fresco, refrigerado e oxigenado. Após a limpeza, coloque o nervo de volta no tubo de transporte cheio de tampão e descanse o tubo no gelo.Prepare um banho de nervo de câmara dupla. Usando chefes de laboratório padrão e pinças, coloque o banho de nervo abaixo do nível da garrafa de dois litros colocada no agitador de aquecimento. Conecte o dreno do banho à entrada da bomba peristáltica.Conecte a saída da bomba peristáltica a um tubo que leva de volta ao frasco tampão. Conecte a entrada do banho a um tubo com uma válvula de fluxo ajustável e coloque o tubo dentro da garrafa. Use uma válvula de três vias com uma seringa conectada à tomada do meio para ajudar a preparar o tubo como um sifão para entrada de buffer assistido pela gravidade.Prime o sifão desenhando a seringa até que o buffer flua para dentro dele. Configure a válvula de tal forma que a taxa de fluxo do buffer no banho seja de cinco a seis milímetros por minuto. A vazão pode ser aumentada inicialmente para encher o banho.Uma vez que o nível do tampão do banho tenha atingido o ralo, coloque os nervos no banho. Usando um pino de inseto, fixe a extremidade do nervo no canto da câmara de banho cheia de tampão. Usando fórceps finos angulares de 45 graus e beliscando o nervo apenas nas extremidades, enfie cuidadosamente o nervo para ser estimulado através do orifício na divisória entre as duas câmaras de banho.Usando um pino de inseto, proteja a outra extremidade do nervo na câmara de óleo do banho, garantindo que o nervo esteja reto sem ser esticado e livre de torções e torções. Usando graxa de silicone, faça uma vedação para evitar o vazamento de tampão da câmara tampão na câmara de óleo Encha a câmara de óleo com silicone ou óleo mineral. Coloque os ganchos de eletrodo de gravação de cloreto de prata/prata na câmara de banho de óleo e fixe-os usando cabeças de chefe e pinças.Em seguida, coloque a porção do nervo no banho de óleo sobre os ganchos sem puxar o nervo esticado. Ajuste ou repare a vedação de graxa de silicone se algum vazamento for observado após mover o nervo. Conecte o eletrodo de cloreto de prata/prata de referência ao solo do amplificador e coloque o eletrodo na câmara de banho cheia de tampão, fixando-o usando um gripper de laboratório.Depois de preparar um eletrodo de punho nervoso limpo para estimulação, coloque o eletrodo na câmara de banho cheia de tampão. Usando fórceps ou pinças finas com pontas cegas ou angulares, abra o eletrodo no banho para molhar o interior da braçadeira. Se as bolhas permanecerem, use uma seringa fina para extrair tampão do banho e forçar as bolhas a sair da braçadeira.Usando uma pinça, abra suavemente a braçadeira e deslize-a sob o nervo. Feche a braçadeira ao redor do nervo, evitando qualquer torção ou torção do nervo. Conecte o eletrodo de estimulação e o eletrodo de retorno atual ao estimulador.Se usar uma folha de platina quadrada como o eletrodo de retorno atual, posicione a folha longe do nervo no banho. Segure o chumbo dos dois eletrodos com fita adesiva. Conecte a saída de sinal TTL do estimulador ao canal quatro do osciloscópio.Na tela do osciloscópio, pressione a guia Do canal Trigger e especifique o canal quatro como o canal de acionamento. Defina o nível do gatilho para um volt usando o botão de nível. No osciloscópio, defina a resolução de tempo para um milissegundo por divisão e resolução de tensão para 10 milivolts por divisão.Centralizar a referência do gatilho no tempo e definir o nível do gatilho para um volt. Depois de conectar o estimulador ao computador, ligue o estimulador conectando a fonte de alimentação da bateria à entrada de alimentação. Em seguida, inicie o software MATLAB no computador.Execute o script MATLAB personalizado. Em seguida, abra o script MATLAB indicado. Edite o script e defina os parâmetros estimuladores de amplitude de pulso para menos 300 microamperes, largura de pulso estimulador para 300 microssegundos, número estimulador de pulsos para 10, e tempo estimulador entre pulsos a um segundo.Inicie o protocolo de estimulação clicando em Executar no software. O potencial de ação composto, ou CAP, tinha uma amplitude de pico a pico de um mililitro no eletrodo e 100 milvolts quando amplificado. A excitação típica do nervo para punhos nervosos de platina padrão e punhos nervosos de elastômero condutivo personalizados são mostrados aqui.O CAP obteve ex vivo durante um dia de experimentos usando ambos os nervos ciáticos é mostrado aqui. A redução mínima da amplitude do PAC foi observada com o nervo ciático direito. Em contraste, a amplitude do nervo ciático esquerdo em aproximadamente três milivolts foi semelhante à do nervo ciático direito no início do experimento mais de seis horas após a extração nervosa.Enfatize a precisão e a repetibilidade na técnica de dissecção, limpeza e implementação. Preste atenção no que está acontecendo no banho. Se o sinal nervoso for perdido, pode ser simplesmente que os eletrodos não estão em bom contato ou que há soro fisiológico na partição de óleo do banho, e não que o nervo tenha morrido.Pela primeira vez, os usuários podem ser tentados a correr, especialmente durante a fase de dissecção. Isso provavelmente levará a erros e danificará o nervo. Precisão e consistência são fundamentais aqui e levarão a resultados de maior qualidade.Atenção especial também deve ser dada à consistência na preparação do buffer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Neurociência

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Em Medidas Vivo eletrofisiológicos nos nervos ciático Rato

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

Na Vivo Medida eletrofisiológica do nervo Ulnar rato com teste de excitabilidade Axonal

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Uso da gravação in vivo da único-fibra e do gânglio dorsal intacto da raiz com nervo sciatic Unido para examinar o mecanismo da falha da condução

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Preparação do tecido cerebral de rato recém-nascido para Análise morfométrica ultraestrutural da distribuição de vesículas sinápticas em terminais nervosos

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...