Name: preparation of rat sciatic nerve for ex vivo neurophysiology
Uploaded: 2022-07-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology at JoVE.com

Los autores reconocen al Dr. Gerald Hunsberger de GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, EE.UU., y Galvani Bioelectronics (Stevenage, Reino Unido) por compartir su técnica original de preparación nerviosa con nosotros. Los autores reconocen a Robert Toth por el diseño del baño nervioso de doble cámara. Los autores reconocen la financiación de la subvención Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC). Los autores reconocen al High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) del Imperial College de Londres por financiar a Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux está financiado actualmente por el Instituto de Investigación de la Demencia del Reino Unido, Centro de Investigación y Tecnología de la Atención. Los autores agradecen a Zack Bailey del Imperial College, en el Departamento de Bioingeniería, por su ayuda con los experimentos y el acceso a los tejidos animales durante la producción del artículo de video de JoVE.

Todos los cuidados y procedimientos de los animales se realizaron bajo licencias apropiadas emitidas por el Ministerio del Interior del Reino Unido en virtud de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) (1986) y fueron aprobados por la Junta de Bienestar Animal y Revisión Ética del Imperial College de Londres.
1. Preparación de tampones
NOTA: Esta parte del protocolo se puede llevar a cabo mucho antes que el resto del protocolo, excepto para...

<ol>
	<li>McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+excitability+of+mammalian+nerve+fibers:+Influence+of+afterpotentials+on+the+recovery+cycle.">Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle.</a> Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).</li><li>Pelot, N. A., Grill, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+excitation+and+kilohertz+frequency+block+of+the+rat+vagus+nerve.">In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).</li><li>Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kilohertz+electrical+stimulation+nerve+conduction+block:+Effects+of+electrode+surface+area.">Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).</li><li>Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+anaesthesia+on+somatosensory+evoked+potential+measurement+in+a+rat+model.">The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model.</a> Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).</li><li>Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+anesthesia+on+measures+of+nerve+conduction+velocity+in+male+C57Bl6/J+mice.">The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice.</a> Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).</li><li>Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-nerve+junctional+potentials.+The+distribution+of+small+motor+nerves+to+frog+skeletal+muscle,+and+the+membrane+characteristics+of+the+fibres+they+innervate.">Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate.</a> The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).</li><li>Brunton, E., Blau, C. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+changes+in+pH+on+the+action+of+mammalian+A+nerve+fibers.">The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers.</a> American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).</li><li>Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+homeostasis.">Acid-base homeostasis.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).</li><li>Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+protection+against+global+ischemia+with+Krebs-Henseleit+buffer-based+cardioplegic+solution.">Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).</li><li>Bailey, L. E., Ong, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Krebs-Henseleit+solution+as+a+physiological+buffer+in+perfused+and+superfused+preparations.">Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations.</a> Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).</li><li>Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sydney+Ringer:+physiological+saline,+calcium+and+the+contraction+of+the+heart.">Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart.</a> The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).</li><li>Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockage+of+chloride+channels+by+HEPES+buffer).">Blockage of chloride channels by HEPES buffer).</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).</li><li>Janz, G. J., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+halide+electrodes.+Preparation,+stability,+and+standard+potentials+in+aqueous+and+non-aqueous+media.">The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media.</a> Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).</li><li>Rapeaux, A., Constandinou, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HFAC+block-capable+and+module-extendable+4-channel+stimulator+for+acute+neurophysiology.">An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).</li><li>Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch&gt">https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch&gt</a> (2021)</li><li>Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fully+polymeric+electrode+arrays+for+peripheral+nerve+stimulation.">fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation.</a> Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).</li><li>Lossi, L., Merighi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ex+vivo+rodent+platforms+in+neuroscience+translational+research+with+attention+to+the+3Rs+philosophy.">The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy.</a> Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).</li></ol>

En este trabajo, describimos un protocolo para preparar los nervios ciáticos de rata para la neurofisiología ex vivo. La extracción de tejidos toma aproximadamente 30 minutos, incluida la manipulación de animales, la anestesia, el sacrificio y la disección, mientras que la limpieza de los nervios, la colocación en el baño y la implantación de electrodos deben requerir 30 minutos adicionales antes de que se pueda iniciar el registro. La preparación del búfer se puede llevar a cabo en 30 minutos, aunque ...

La comprensión actual de la función nerviosa fundamental según lo modelado in silico carece de varios aspectos, especialmente con respecto a los efectos de la compartimentación del tejido nervioso fuera del soma, el axón y las dendritas. Las interacciones axon-mielina todavía son poco conocidas, como lo demuestra el hecho de que incluso los modelos nerviosos computacionales detallados como MRG1 (para nervios de mamíferos) que capturan adecuadamente la respuesta de estimulación eléctrica convencional, no capturan otros comportamientos observados experimentalmente, como el arrastre de bloque de alta frecuencia2 o la respuesta de inicio secundario3.
Este protocolo proporciona un método para investigar eficientemente los procesos neurofisiológicos a nivel nervioso en un modelo animal de laboratorio pequeño agudo, utilizando un protocolo de preparación estandarizado para aislar el nervio, controlar su entorno y eliminarlo de un contexto in vivo a un contexto ex vivo. Esto evitará otros procesos corporales o anestésicos utilizados por los protocolos de estimulación nerviosa in vivo para alterar el comportamiento nervioso y confundir los resultados medidos o su interpretación 4,5. Esto permite el desarrollo de modelos más realistas que se centran únicamente en los efectos específicos de los tejidos nerviosos que son poco conocidos. Este protocolo también es útil como banco de pruebas para la nueva estimulación nerviosa y el registro de materiales y geometrías de electrodos, así como nuevos paradigmas de estimulación como el bloque de alta frecuencia 2,3. Las variaciones de esta técnica se han utilizado previamente para estudiar la fisiología nerviosa en condiciones estrictamente controladas6, por ejemplo, para medir la dinámica y las propiedades de los canales iónicos o los efectos de los anestésicos locales7.
Esta técnica aporta varias ventajas frente a alternativas como la experimentación aguda in vivo con pequeños animales8. La técnica evita la necesidad de mantener la profundidad de la anestesia a medida que el tejido se ha extraído del cuerpo, reduciendo la cantidad de equipo requerido, como un difusor anestésico, un concentrador de oxígeno y una almohadilla térmica. Esto simplifica el protocolo experimental, reduciendo el riesgo de errores. Como los anestésicos pueden alterar potencialmente la función nerviosa4, esta técnica garantiza que las medidas no se vean confundidas por los efectos secundarios de estos compuestos anestésicos. Finalmente, esta técnica es más apropiada que los experimentos agudos in vivo a la hora de estudiar los efectos de compuestos neurotóxicos como la tetrodotoxina, que mataría a un animal anestesiado por parálisis.
Las secciones nerviosas periféricas son un sistema ex vivo único, ya que existe una alta probabilidad de que las fibras responsables de las señales neuronales registradas no contengan ningún soma. Como estos normalmente se ubicarían, para las neuronas motoras, en la columna vertebral y para las neuronas sensoriales en los ganglios de la raíz dorsal junto a la columna vertebral, la preparación de una sección del nervio de los mamíferos se puede modelar aproximadamente como una colección de membranas tubulares con canales iónicos, abiertos en ambos extremos9. El metabolismo es mantenido por las mitocondrias localizadas en el axón en el momento de la disección tisular10. Se recomienda la sutura de los extremos abiertos del axolemma después de la extracción para cerrarlos y, por lo tanto, ayudar a mantener los gradientes iónicos existentes a través de la membrana, que son esenciales para la función nerviosa normal.
Para mantener la homeostasis tisular fuera del cuerpo, varias variables ambientales deben ser estrictamente controladas. Estos son la temperatura11, la oxigenación12, la osmolaridad, el pH13,14 y el acceso a la glucosa para mantener el metabolismo. Para este protocolo, el enfoque es utilizar un tampón Krebs-Henseleitmodificado 15,16 (mKHB) continuamente aireado con una mezcla de oxígeno y dióxido de carbono. El mKHB pertenece a la familia de tampones cardiopléjicos 6,17 utilizados para preservar tejidos disecados fuera del cuerpo, por ejemplo, en experimentos ex vivo. Estos tampones no contienen hemoglobina, antibióticos o antifúngicos y, por lo tanto, solo son adecuados para preparaciones que involucran pequeñas cantidades de tejido durante un tiempo limitado. El control del pH se logró con el par redox de carbonato y dióxido de carbono, requiriendo una aireación constante del tampón con dióxido de carbono para mantener el equilibrio del pH. Esto es para evitar el uso de otros agentes amortiguadores comunes como HEPES, que puede modificar la función de las células nerviosas18. Para oxigenar el tampón y proporcionar control del pH, se utilizó una mezcla de 5% de dióxido de carbono en oxígeno llamada carbógeno (95% O2, 5% CO2). Se utilizó un agitador de calentamiento para el control de la temperatura de un recipiente tampón, y el tampón se perfundió a través de un baño nervioso y luego se recirculó al recipiente inicial. Un experimento típico duraría 6-8 h antes de que el nervio pierda su viabilidad y ya no responda lo suficiente a la estimulación para que las medidas sean representativas del tejido sano.
Para optimizar la relación señal-ruido, se utilizaron electrodos de cloruro de plata para la grabación, que se prepararon de acuerdo con los métodos descritos anteriormente19. Para la estimulación, se puede utilizar una combinación de electrodos de manguito de platino comerciales listos para usar y electrodos de manguito de polímero conductor hechos a medida. Los electrodos conductores de manguito de polímero tienen capacidades de carga notablemente más altas, que son útiles cuando se estimula el nervio utilizando formas de onda de alta amplitud20.
El estimulador utilizado en este protocolo ha sido descrito previamente20. La documentación, los archivos de diseño y los scripts de software para usarlo están disponibles públicamente21. Se pueden utilizar otros estimuladores para ejecutar este protocolo; sin embargo, el estimulador personalizado también es capaz de bloquearel bloque 2,20 de corriente alternativa de alta frecuencia (HFAC), lo que permite una gama más amplia de experimentos de neurofisiología. Para usar el bloque HFAC, se recomiendan manguitos de elastómero conductor para evitar daños en el nervio. Los manguitos nerviosos de elastómero conductor son matrices de electrodos blandos y totalmente poliméricos producidos a partir de elastómeros conductores como componente conductor y polidimetilsiloxano como aislamiento22. Los dispositivos se fabricaron en una configuración bipolar utilizando técnicas convencionales de microfabricación láser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Glass bottle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>215-1595</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Glass graduated flask</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>612-3626</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Glass bottle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>215-1596</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Glass graduated flask</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>BRND937254</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>536-2599</td>
			<td>push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkoxy conformal coating</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>1971829</td>
			<td>ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td>Chanelle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 2 L</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>213-0469</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar nerve cuff</td>
			<td>Cortec GMBH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bossheads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen canister</td>
			<td>BOC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>F-size canister</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, 15 mL volume</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>734-0451</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive elastomer nerve cuff</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector, Termimate</td>
			<td>Mouser UK</td>
			<td>538-505073-1100-LP</td>
			<td>These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocodile clip connectors</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>212-1203</td>
			<td>These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Obtained from deionized water dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps angled 45 degrees</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91110-10</td>
			<td>Fine forceps, student range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps standard Dumont #7</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Student range forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Disperson Tube, Porosity 3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>12547866</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose anhydrous, powder</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>101174Y</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grippers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory rod-mounted grippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Stirrer</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>768-9672</td>
			<td>Stuart US152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hemostat &#62;12 cm in length is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins, stainless steel, size 2</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>26001-45</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line Noise Filter</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Noise Preamplifier, SR560</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR560</td>
			<td>Low-noise voltage preamplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate salt</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>291184P</td>
			<td>500g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB scripts</td>
			<td>Github</td>
			<td>https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch</td>
			<td>Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Light, PL-2000</td>
			<td>Photonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, SMZ 745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SM745</td>
			<td>Stereoscopic Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, non-toxic</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>31911.A1</td>
			<td>Oil for nerve bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Bath</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>LeCroy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Hose, 1 meter</td>
			<td>BOC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1/4&#34; NPT terminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Regulator</td>
			<td>BOC</td>
			<td>C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4&#34;NPTF 230Bar</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Product may be obtained from third party supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, Glass</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>391-0580&#160;</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405-250g</td>
			<td>250 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Sulphate salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.0250</td>
			<td>250 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sprague Dawley, 250-330 grams, female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference electrode, ET072</td>
			<td>eDaQ (Australia)</td>
			<td>ET072-1</td>
			<td>Silver silver-chloride reference electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory rods with fittings for stands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>N/A</td>
			<td>M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight 12 cm edge</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>91400-12</td>
			<td>blunt-blunt termination, student range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Acquisition Device</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>Micro3-1401</td>
			<td>Micro3-1401 Multichannel ADC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease, non-toxic</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>3821559</td>
			<td>for sealing of bath partition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, 2 mm inner diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, 5 mm inner diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41390</td>
			<td>0.5 mm, annealed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500g</td>
			<td>500 g in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride salt</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>27810.295</td>
			<td>1 kg in plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors angled 2 mm edge</td>
			<td>InterFocus Ltd</td>
			<td>15010-09</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard wet laboratory stands with sockets for rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td>DS3 or Custom Stimulator (see references)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring flea</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>442-0270</td>
			<td>For use with the heating stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe tip, blunt, 1 mm diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe tip, blunt, 2 mm diameter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, plastic, 10 mL volume</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>syringe should have luer lock fitting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape, water-resistant</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For securing tubing and wiring to workbench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>620-0806</td>
			<td>glass thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Power Bank</td>
			<td>RS UK</td>
			<td>135-1000</td>
			<td>Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve, Leuer Lock, 3-Way</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>229-7440</td>
			<td>For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat sciatic nerve for ex vivo neurophysiology

Las preparaciones ex vivo permiten el estudio de muchos procesos neurofisiológicos de forma aislada del resto del cuerpo, preservando al mismo tiempo la estructura del tejido local. Este trabajo describe la preparación de los nervios ciáticos de rata para la neurofisiología ex vivo, incluida la preparación tampón, los procedimientos en animales, la configuración del equipo y el registro neurofisiológico. Este trabajo proporciona una visión general de los diferentes tipos de experimentos posibles con este método. El método descrito tiene como objetivo proporcionar 6 h de estimulación y registro en el tejido nervioso periférico extraído en condiciones estrechamente controladas para una consistencia óptima en los resultados. Los resultados obtenidos utilizando este método son potenciales de acción compuestos de fibra A (CAP) con amplitudes de pico a pico en el rango de milivoltios durante toda la duración del experimento. Las amplitudes y formas de CAP son consistentes y confiables, lo que las hace útiles para probar y comparar nuevos electrodos con modelos existentes, o los efectos de las intervenciones en el tejido, como el uso de productos químicos, alteraciones quirúrgicas o técnicas de estimulación neuromoduladora. Se probaron tanto electrodos de manguito convencionales disponibles comercialmente con contactos de platino-iridio como electrodos de elastómero conductor hechos a medida y dieron resultados similares en términos de respuesta de fuerza-duración del estímulo nervioso.

Los resultados representativos que se pueden obtener con este protocolo son los potenciales de acción compuestos consistentes de las fibras nerviosas de tipo A dentro del nervio ciático. Estos potenciales de acción suelen tener una amplitud de pico a pico de aproximadamente 1 mV en el electrodo y, por lo tanto, 100 mV una vez amplificados (Figura 2). Las amplitudes de estimulación y los anchos de pulso similares deben producir amplitudes CAP similares. Los electrodos conductores del mang...

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Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Este protocolo describe la preparación de tejido nervioso ciático entero de rata para la estimulación electrofisiológica ex vivo y el registro en un baño salino perfundido de dos compartimentos, regulado ambientalmente.

Preparación del nervio ciático de rata para neurofisiología ex vivo

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

Este protocolo permite la observación de muchos fenómenos neurofisiológicos que no se comprenden bien, como el arrastre de bloqueo nervioso después de la inyección de corriente de alta frecuencia / alta amplitud, al tiempo que evita la interferencia de otros procesos en un cuerpo vivo. Esta técnica produce resultados altamente repetibles y robustos y es más práctica que la electrofisiología in vivo, porque las variables complejas como la profundidad de la anestesia no tienen que ser controladas y, por lo tanto, no pueden influir en las mediciones. Después de un procedimiento de eutanasia bajo anestesia, coloque una rata hembra en la mesa de disección, sostenga el tobillo firmemente entre el pulgar, el dedo índice y el dedo medio, y corte el tendón calcánea con tijeras romas rectas de 12 centímetros.Usando fórceps finos y tijeras, haga incisiones cuidadosas a través de las capas musculares cerca de la mitad de la parte posterior de la pierna hasta que el nervio ciático esté expuesto. Una vez que el nervio sea visible, hidrate la cavidad usando un tampón Krebs-Henseleit modificado con hielo, o MKHB, para evitar que el nervio se seque. Usando hemostáticos, tire de los colgajos de piel de cada lado y mantenga la incisión abierta para una disección más fina.A partir de la ubicación de la incisión del tendón calcáneo, usando tijeras finas, interrumpe el músculo en el lado medial de la pierna para liberar el nervio. Continúe manteniendo los niveles de humedad en el área con MKHB helado. A medida que el nervio está expuesto mientras se mueve hacia arriba de la pierna, diseccione el tejido muscular suprayacente.Libere el nervio más cercano a la columna vertebral de los tejidos conectivos hasta llegar a la hendidura espinal, momento en el que hay una torcedura en el nervio. No limpie el nervio todavía, ya que la velocidad es esencial en esta etapa. Para facilitar la disección, use fórceps, tire suavemente del extremo del nervio cerca del tobillo.Luego, usando tijeras finas, severe el nervio cerca de la columna vertebral. Coloque el nervio diseccionado en un tubo centrífugo de 15 mililitros lleno de MKHB y vuelva a colocar el tubo sobre el hielo hasta el inicio del procedimiento de limpieza. Llene la placa de Petri recubierta hasta la mitad con MKHB oxigenado refrigerado, luego coloque un nervio ciático diseccionado en el plato y fije ambos extremos del nervio al plato de modo que el nervio esté recto sin torceduras, torsión o giros.Usando suturas de seda 6-0 o hilo fino, ate un nudo doble alrededor de cada extremo del nervio para evitar la fuga de citosol en el tampón. Coloque los nudos justo al lado de los alfileres de insectos en el lado más cercano al centro del nervio para evitar la fuga de tejido nervioso en el amortiguador. Bajo un microscopio, usando tijeras de resorte en ángulo de dos milímetros y fórceps finos, elimine la grasa, los vasos sanguíneos y el tejido muscular del nervio.Pode cualquier rama nerviosa que no se utilizará en la estimulación y el registro. Después de cada cinco minutos de limpieza, reemplace el tampón con MKHB fresco, refrigerado y oxigenado. Después de la limpieza, coloque el nervio de nuevo en el tubo de transporte lleno de tampón y apoye el tubo sobre hielo.Prepare un baño nervioso limpio de doble cámara. Usando cabezales y pinzas estándar de jefe de laboratorio, coloque el baño nervioso por debajo del nivel de la botella de dos litros colocada en el agitador de calefacción. Conecte el desagüe del baño a la entrada de la bomba peristáltica.Conecte la salida de la bomba peristáltica a un tubo que conduce de vuelta a la botella tampón. Conecte la entrada del baño a un tubo con una válvula de flujo ajustable y coloque el tubo dentro de la botella. Use una válvula de tres vías con una jeringa conectada a la salida central para ayudar a cebar el tubo como un sifón para la entrada de búfer asistida por gravedad.Prepare el sifón extrayendo la jeringa hasta que el tampón fluya hacia él. Configure la válvula de tal manera que el caudal de amortiguación en el baño sea de cinco a seis milímetros por minuto. El caudal se puede aumentar inicialmente para llenar el baño.Una vez que el nivel del amortiguador del baño haya alcanzado el drenaje, coloque los nervios en el baño. Usando un alfiler de insecto, asegure el extremo del nervio en la esquina de la cámara de baño llena de tampón. Usando fórceps finos en ángulo de 45 grados y pellizcando el nervio solo en los extremos, enhebra cuidadosamente el nervio para ser estimulado a través del orificio en la partición entre las dos cámaras de baño.Usando un alfiler de insecto, asegure el otro extremo del nervio en la cámara de aceite del baño, asegurándose de que el nervio esté recto sin estirarse y esté libre de torceduras y giros. Usando grasa de silicona, haga un sello para evitar la fuga de amortiguación de la cámara de amortiguación a la cámara de aceite Llene la cámara de aceite con silicona o aceite mineral. Coloque los ganchos de electrodos de grabación de cloruro de plata / plata en la cámara del baño de aceite y asegúrelos con cabezales de jefe y pinzas.Luego, cubra la porción del nervio en el baño de aceite sobre los ganchos sin tirar del nervio tenso. Ajuste o repare el sello de grasa de silicona si se observa alguna fuga después de mover el nervio. Conecte el electrodo de plata/cloruro de plata de referencia a la toma a tierra del amplificador y colóquelo en la cámara de baño llena de tampón asegurándolo con una pinza de laboratorio.Después de preparar un electrodo de manguito nervioso limpio para la estimulación, coloque el electrodo en la cámara de baño llena de tampón. Usando pinzas o pinzas finas con puntas romas o en ángulo, abra el electrodo en el baño para mojar el interior del manguito. Si quedan burbujas, use una jeringa fina para extraer el tampón del baño y forzar las burbujas a salir del manguito.Usando una pinza, abra suavemente el manguito y deslícelo debajo del nervio. Cierre el manguito alrededor del nervio, evitando cualquier torcedura o torsión del nervio. Conecte el electrodo de estimulación y el electrodo de retorno de corriente al estimulador.Si usa una lámina de platino cuadrada como electrodo de retorno de corriente, coloque la hoja lejos del nervio en el baño. Asegure ambos cables de los electrodos con cinta adhesiva. Conecte la salida de señal TTL del estimulador al canal cuatro del osciloscopio.En la pantalla del osciloscopio, presione la pestaña Canal de activación y especifique el canal cuatro como canal de activación. Ajuste el nivel del gatillo a un voltio usando la perilla de nivel. En el osciloscopio, establezca la resolución de tiempo en un milisegundo por división y la resolución de voltaje en 10 milivoltios por división.Centra la referencia del disparador en el tiempo y establece el nivel del disparador en un voltio. Después de conectar el estimulador a la computadora, encienda el estimulador conectando la fuente de alimentación de la batería a la entrada de energía. A continuación, inicie el software MATLAB en el equipo.Ejecute el script de MATLAB personalizado. A continuación, abra el script de MATLAB indicado. Edite el script y establezca los parámetros amplitud del pulso del estimulador en menos 300 microamperios, ancho del pulso del estimulador en 300 microsegundos, número de pulsos del estimulador en 10 y tiempo del estimulador entre pulsos a un segundo.Inicie el protocolo de estimulación haciendo clic en Ejecutar en el software. El potencial de acción compuesto, o CAP, tenía una amplitud de pico a pico de un milivoltio en el electrodo y 100 milivoltios cuando se amplificaba. La excitabilidad nerviosa típica para los manguitos nerviosos de platino estándar y los manguitos nerviosos de elastómero conductor hechos a medida se muestran aquí.El CAP obtenido ex vivo durante un día de experimentos utilizando ambos nervios ciáticos se muestra aquí. Se observó una reducción mínima de la amplitud de la CAP con el nervio ciático derecho. En contraste, la amplitud de la CAP del nervio ciático izquierdo a aproximadamente tres milivoltios fue similar a la del nervio ciático derecho al comienzo del experimento más de seis horas después de la extracción del nervio.Enfatizar la precisión y la repetibilidad en la disección, limpieza y técnica de implementación. Preste atención a lo que está sucediendo en el baño. Si se pierde la señal nerviosa, puede ser simplemente que los electrodos no están en buen contacto o que hay solución salina en la partición de aceite del baño, y no que el nervio esté muerto.Los usuarios primerizos pueden verse tentados a apresurarse, especialmente durante la fase de disección. Esto probablemente conducirá a errores y dañará el nervio. La precisión y la consistencia son clave aquí y conducirán a resultados de mayor calidad.También debe prestarse especial atención a la coherencia en la preparación del tampón.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Investigación

Neurociencias

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

En Vivo electrofisiológicos mediciones sobre los nervios ciáticos de ratones

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

En Vivo Medición electrofisiológica del nervio cubital con la excitabilidad Axonal prueba rata

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para el análisis Morfolométrico ultraestructural de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Ex Vivo Presurizado Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparación para Estudio Funcional

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...