Name: inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use
Uploaded: 2022-04-28T14:00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use at JoVE.com

نشكر آدم بارنو وفرانسيسكا غارسيا على دعمهما في تجارب ومراقبة الاورام الحميدة المرجانية. كما نشكر المختبر الأساسي للموارد الساحلية والبحرية في جامعة الملك عبدالله للعلوم والتقنية على مساعدته فيما يتعلق بصيانة الأحياء المائية والبنية التحتية. تم تمويل الدراسة من خلال منحة جامعة الملك عبدالله للعلوم والتقنية رقم BAS/1/1095-01-01.

بالنسبة لهذه الدراسة ، تم جمع مستعمرة تنتمي إلى أنواع الشعاب المرجانية Pocillopora verrucosa من شعاب الفحل المرجانية (22.305118 N ؛ 38.964568 E) بواسطة الغوص باستخدام مطرقة وإزميل. تم تحديد جنس المستعمرة من الناحية المورفولوجية ، وتم تصنيف أنواعها على أنها P. verrucosa بناء على أعمال منشورة سابقا ، بما في ذلك Pocillopora من البحر الأحمر ، مما يشير إلى أنه ، من وجهة نظر وراثية ، فإن الأنواع الموجودة في هذه المنطقة هي P. verrucosa39,40. الشعاب المرجانية الفحل ليست جزءا من منطقة بيئية محمية، ولم تكن هناك حاجة إلى تصاريح خاصة لجمع الشعاب المرجانية. تم الاحتفاظ بالمستعمرة في حوض سمك سعة 300 لتر لمدة شهر قبل أن يتم تفتيتها و "إنقاذ" الاورام الحميدة الخاصة بها. تم الاحتفاظ بالحوض عند 26 درجة مئوية مع اثنين من سخانات الحوض ، وثلاث مضخات ، ومصدرين للضوء (انظر جدول المواد) ، مع الحفاظ على دورة ضوء 12 ساعة. تم الحفاظ على درجة حرارة الحوض عن طريق توصيل كل واحد من السخانين بوحدة تحكم في درجة الحرارة. تمت برمجة انبعاث الضوء ليبدأ في الساعة 6 صباحا وينتهي في الساعة 6 مساء ، مما ينتج منحنى إشعاع بلغ ذروته في الساعة 12 مساء مع فوتونات 230 ميكرومول m−2s−1.
1. إنقاذ الاورام الحميدة عن طريق الملوحة العالية بعد تبخر الماء
ملاحظة: تم اقتباس هذه الطريقة من Shapiro et al.25. إذا كنت تستخدم أنواعا مختلفة عن Pocillopora verrucosa ، فيجب مراعاة حجم الاورام الحميدة قبل تحديد حجم الجزء المراد قطعه.
<ol><li>قطع شظايا صغيرة (أقل من 1 سم في الطول) من مستعمرة المرجان باستخدام كماشة قطع قطرية (انظر جدول المواد). ملاحظة: قم بتكييف أدوات القطع وفقا لأنواع الشعاب المرجانية المستخدمة. الكماشة القطرية مفيدة لقطع الشعاب المرجانية ذات الفروع الرفيعة. في الدراسة الحالية ، تم قطع جزء واحد لكل علاج ، ولكن يمكن أن يختلف عدد وحجم الشظايا اعتمادا على عدد الاورام الحميدة المطلوبة. يجب ألا يتجاوز حجم الشظايا المقطوعة عمق الماء بعد التبخر ، لذلك تبقى الشعاب المرجانية داخل الماء تماما بعد الانتهاء من العملية.</li>
	<li>ضع الشظايا المقطوعة في أطباق بتري صغيرة مليئة ب 12 مل من مياه البحر التي تأقلمت معها مستعمرة المرجان. يمكن أن يكون هذا مياه البحر الاصطناعية (انظر جدول المواد) أو مياه البحر المصفاة بنفس الملوحة التي تم إدخال مستعمرة المرجان فيها قبل التفتيت. ملاحظة: من المهم تغطية الجزء بالكامل بالماء. إذا لم يكن 12 مل في طبق بتري كافيا لتغطية الجزء المقطوع ، فقم بتحسين الحاوية والحجم وفقا لذلك. في هذه الدراسة ، تم جمع المياه المستخدمة من البحر الأحمر ، وكانت ملوحتها 40 PSU ، مقاسة بمقياس متعدد المعلمات (انظر جدول المواد).</li>
	<li>اترك اللوحة مفتوحة لمدة 24 ساعة تقريبا في درجة الحرارة المحيطة بحيث يمكن أن يتبخر الماء ويمكن أن تزداد ملوحته تدريجيا. عندما يمكن ملاحظة هضم الأنسجة بين الاورام الحميدة ، انتقل إلى الخطوة 1.4. ملاحظة: بعد مرور وقت الحضانة ، يجب أن تكون ملوحة الماء أعلى بنسبة 40٪ تقريبا مما كانت عليه في البداية ، ويجب أن تكون الاورام الحميدة جاهزة للفصل عن الهيكل العظمي.</li>
	<li>باستخدام ماصة نقل 1 مل ، قم بإنشاء تدفق لطيف بالقرب من الأنسجة المرجانية. سيساعد التدفق ببطء على الانفصال الكامل للأورام الحميدة التي هضمت بالفعل الأنسجة المحيطة بها من الهيكل العظمي. ملاحظة: عندما يتم إنشاء تدفق المياه باستخدام الماصة ، يجب أن تخرج الاورام الحميدة المنفصلة أو مجموعات من الاورام الحميدة من الهيكل العظمي كرقائق. إذا خرجت مادة غائمة بدلا من ذلك ، فإنها تشير إلى موت الأنسجة أو تفككها ، مما يعني أن الشعاب المرجانية قد تم احتضانها لفترة طويلة جدا أو في حالة مرهقة للغاية (في هذه الحالة ، ملوحة عالية). من المهم جدا إجراء تدفق لطيف للمياه لفصل الاورام الحميدة ، لأن التدفق الأقوى قد يسبب أضرارا مادية لها.</li>
	<li>استبدل الماء ببطء في طبق بتري بالماء متساوي السموتيك (استخدم نفس الماء كما في الخطوة 1.2) باستخدام ماصة. يكفي تبادل المياه بنسبة 50٪ على مدار 10 دقائق للتأقلم مع الاورام الحميدة مرة أخرى إلى حالة الملوحة غير المجهدة. ملاحظة: مع استخدام مستعمرات المرجان من الأنواع pocilloporid Pocillopora verrucosa من البحر الأحمر ، أجريت اختبارات لتحديد الظروف المحددة التي سيتم فيها إنقاذ الشعاب المرجانية من هذه البيئة الفريدة. من المهم تسليط الضوء على الملوحة العالية للبحر الأحمر بالمقارنة مع معظم بيئات الشعاب المرجانية الأخرى.</li>
</ol>2. إنقاذ الاورام الحميدة من خلال إمدادات مياه البحر عالية الملوحة
ملاحظة: تم اقتباس هذه الطريقة من Chuang et al.27.
<ol><li>تحضير 3 لتر من مياه البحر عالية الملوحة عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم إلى مياه البحر حتى تزداد الملوحة بنسبة 85٪ ، تقاس بواسطة مسبار الملوحة. ملاحظة: في الدراسة الحالية ، تم تحضير 74 من مياه البحر عالية الملوحة من 40 PSU من مياه البحر الأحمر.</li>
	<li>قطع شظايا صغيرة من المرجان كما هو موضح في الخطوة 1.1.</li>
	<li>ضع الشظايا المقطوعة في حاوية سعة 10 لترات مملوءة ب 3 لترات من مياه البحر متساوي السمنة (في هذه الحالة ، مياه البحر ذات الملوحة غير المجهدة للشعاب المرجانية ، وهي نفسها المستخدمة في الخطوة 1.2) متصلة بمضخة تمعجية (انظر جدول المواد). ملاحظة: للحفاظ على صحة الشعاب المرجانية بشكل أفضل ، يمكن إضافة وحدات التحكم في درجة الحرارة ومضخات الهواء والأضواء لمحاكاة نفس ظروف الحوض التي تعرضت لها المستعمرة سابقا. خلال الحضانة في العمل الحالي ، تم الاحتفاظ بشظايا الشعاب المرجانية في حاويات عند 26 درجة مئوية ، تحت دورة ضوء يومية مدتها 12 ساعة. تم الحفاظ على حركة المياه وتجانس درجة الحرارة بواسطة مضخات الهواء.</li>
	<li>املأ الحاوية التي تحتوي على شظايا المرجان بمياه البحر عالية الملوحة المحضرة في الخطوة 2.1 باستخدام المضخة التمعجية لمدة 24 ساعة بمعدل 126 مل / ساعة. أضف ما مجموعه 3 لتر من الماء عند زيادة الملوحة بنسبة 40٪ تقريبا. ملاحظة: يمكن إنتاج المياه عالية الملوحة ببساطة عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم إلى مياه البحر حتى تصل إلى الملوحة المقصودة.</li>
	<li>قم بإنشاء تدفق مياه لطيف باستخدام ماصة لإطلاق الاورام الحميدة من الهيكل العظمي (الخطوة 1.4).</li>
	<li>تبادل ببطء الماء الذي تحتوي عليه الاورام الحميدة للمياه متساوي السمية (الخطوة 1.5). بعد ذلك ، انتقل إلى الخطوة 4 أو الخطوة 5.</li>
</ol>3. إنقاذ الاورام الحميدة عن طريق حضانة مياه البحر الخالية من الكالسيوم
ملاحظة: تم تكييف هذه الطريقة من Pang et al.24.
<ol><li>تحضير محلول مياه البحر الاصطناعية الخالية من الكالسيوم (CaFSW) بإضافة 26.29 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.872 جم من KCl ، و 2.16 جم من MgSO 4 ، و 11.94 جم من MgCl 2 ، و 3.42 جم من Na2 SO4 ، و 0.286 جم من NaHCO3 (انظر جدول المواد) إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات. ملاحظة: تم تعديل هذا الحل من البروتوكولات السابقة ليكون أكثر ملاءمة للشعاب المرجانية التي تتكيف مع ملوحة 40 PSU. بالنسبة للشعاب المرجانية التي تتكيف مع ظروف الملوحة الأخرى ، استخدم نفس النسبة من الأملاح ولكن اضبط الكتلة الكلية للمذابات للحصول على الملوحة الأكثر ملاءمة للشعاب المرجانية المستخدمة.</li>
	<li>قطع شظايا صغيرة من الشعاب المرجانية كما هو موضح في الخطوة 1.1.</li>
	<li>غمر شظايا الشعاب المرجانية في أطباق بتري المملوءة ب CaFSW المعدة مسبقا (الخطوة 3.1) واحتضنها في حاضنات مدارية بسرعة دوران 80 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات. ملاحظة: مرة أخرى ، من المهم تغطية الجزء بالكامل بالماء. إذا لم يكن طبق بتري كافيا لتغطية الجزء ، فقم بتحسين الحاوية والحجم وفقا للحاجة التجريبية.</li>
	<li>انقل الشظايا إلى أطباق بتري أو أطباق من 6 آبار مملوءة ب 20٪ من وسائط النسر المعدلة من دولبيكو (DMEM) و 100 مجم / مل من محلول الأمبيسلين (انظر جدول المواد) المحضر بمياه البحر الاصطناعية 40 PSU. احتضن الشظايا عند 26 درجة مئوية و 80 دورة في الدقيقة ، وتبادل الوسائط كل يوم حتى يمكن ملاحظة هضم الأنسجة بين الاورام الحميدة وتبدأ الاورام الحميدة الفردية في الانفصال عن الهيكل العظمي. ملاحظة: في معظم الحالات ، يكتمل هضم الأنسجة في غضون 20 ساعة من الحضانة في هذه الوسائط ، ولا يلزم إجراء تبادلات.</li>
	<li>انقل الاورام الحميدة إلى مياه البحر المعقمة للاسترداد الأولي باستخدام ماصة. بعد 1 ساعة من الحضانة ، انتقل إلى الخطوة 4 أو الخطوة 5.</li>
</ol>4. صيانة الاورام الحميدة في أطباق بتري
<ol><li>بمجرد عودة الاورام الحميدة إلى مياه البحر المصفاة ذات الملوحة غير المجهدة ، حدد الاورام الحميدة القابلة للحياة من خلال مراقبة سلامة الأنسجة وحركتها الناجمة عن التدفق الهدبي تحت المجهر المجسم.</li>
	<li>ضع الاورام الحميدة المختارة في طبق بتري زجاجي أو بلاستيكي وقم بتغطية طبق بتري بشبكة عوالق (حجم شبكة 200 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) حتى لا تطفو الاورام الحميدة بعيدا عن الطبق. ملاحظة: يمكن أن يختلف حجم الشبكة الشبكية وفقا لحجم الاورام الحميدة. من المهم ملاحظة أن الشباك يجب أن تحتوي على مسام أصغر من الاورام الحميدة وتسمح بتبادل المياه واختراق الضوء.</li>
	<li>ضع طبق بتري داخل حوض السمك مع الظروف المناسبة لأنواع الشعاب المرجانية المستخدمة. ملاحظة: في هذه الدراسة ، كانت الظروف 40 مياه بحر مفلترة من جامعة الأمير سلطان عند 26 درجة مئوية ودورة ضوء 12 ساعة.</li>
	<li>افتح أطباق بتري مرة واحدة على الأقل في الأسبوع لتجديد المياه وتنظيف الأطباق. هذه الخطوة مهمة للقضاء على فرط نمو الطحالب التي يمكن أن تتنافس مع الاورام الحميدة المرجانية أو تتلفها عن طريق إطلاق مركبات سامة محليا.</li>
</ol>5. صيانة الاورام الحميدة في الحاضنات
<ol><li>حدد الاورام الحميدة القابلة للحياة كما هو موضح في الخطوة 4.1.</li>
	<li>ضع الاورام الحميدة في قوارير خلية سطحية 75 سم2 مملوءة ب 50 مل من مياه البحر متساوي السمنة باستخدام ماصات النقل. ملاحظة: في العمل الحالي ، تم استخدام مياه البحر المصفاة التي تم جمعها من البحر الأحمر لصيانة الاورام الحميدة. يمكن استخدام المياه ذات الخصائص نفسها المستخدمة في الخطوة 1.2.</li>
	<li>أغلق القوارير وانقلها إلى الحاضنات. اضبط الحاضنات على دورات إضاءة لمدة 12 ساعة عند 26 درجة مئوية و 40 دورة في الدقيقة. تبادل 50٪ من حجم المياه كل 4 أيام ونقل المحتوى إلى قوارير نظيفة عندما / إذا كانت مليئة بالطحالب أو البيوفيلم على الجدران. ملاحظة: تم التقاط الصور باستخدام نظام تكبير/تصغير كامل اللون مجهز بكاميرا عالية الدقة (انظر جدول المواد) للحصول على النتائج التمثيلية.</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يختلف معدل بقاء الاورام الحميدة بعد تقديمها لعمليات الإنقاذ والوقت اللازم لإكمال العملية بين الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها سابقا25،33،41 ، والتي ربما يتم تفسيرها من خلال الأساليب التجريبية المختلفة المطبقة في كل دراسة. على سبيل المثال ، الأنواع المرجانية المختلفة ، أو حتى الشعاب المرجانية من نفس النوع ولكنها تتأقلم مع ظروف بيئية مختلفة (على سبيل المثال ، الشعاب المرجانية من البحر الأحمر) ، تقدم عتبات مختلفة لمستويات الملوحة. تلعب طريقة الإنقاذ المختارة وظروف المختبر / الحوض أيضا أدوارا مهمة في النتائج. في بعض الحالات ، تجاوزت صيانة المرجان المجهري في ظل ظروف المختبر وقت بقاء مزارع الخلايا المرجانية من خلال الوصول إلى أشهر من البقاء على قيد الحياة في الشعاب المرجانية azooxanthellate3 3,41 و zooxanthellate25. كما اختلف وقت اكتمال عملية إنقاذ الاورام الحميدة في دراسات مختلفة ، بدءا من بضع ساعات2 5,2 7,30 إلى أسابيع35 من الحضانة المعرضة للضغوط المسؤولة عن التسبب في الإنقاذ. متغير آخر يجب مراعاته عند دراسة إنقاذ الاورام الحميدة هو استعادة الاورام الحميدة بعد التعرض للإجهاد الحاد الذي أدى إلى إطلاقها. لا يزال الأمر قابلا للنقاش إذا كانت الاورام الحميدة بعد الإنقاذ في حالة جيدة بما يكفي لاستخدامها كنماذج لدراسة بيولوجيا الشعاب المرجانية. إن استعادة أنسجتها بعد تدهور coenosarc أمر مثير للقلق عند استخدام هذه الميكروبروباغات. ومع ذلك ، تمكنت الاورام الحميدة في العديد من الدراسات ، بما في ذلك الوقت الحاضر ، من تقديم خلايا zooxanthellae داخل أنسجتها ومورفولوجياتها الخارجية مع استقطاب فموي أفموي سليم ومخالب بعد أسابيع من الإنقاذ25،27،32،36. وقد وجدت دراسات سابقة أيضا أنه بعد تخفيفها من الإجهاد الحاد ، تمكنت الاورام الحميدة المرجانية التي تم إطلاقها والمعرضة لمياه البحر شديدة الملوحة أو الساخنة من استعادة التعبير عن الجينات المتعلقة بعمليات مثل موت الخلايا المبرمج ، والتحلل البروتيني ، وانقسام الخلايا إلى مستويات مماثلة لتلك الموجودة قبل الإنقاذ 32,36 وحتى لزيادة التعبير عن الجينات المتعلقة بشفاء الأنسجة36.
فيما يتعلق بالفرق في البقاء على قيد الحياة بين الطرق ، من المهم تسليط الضوء على أن هذه المرة يمكن أن تختلف بين التجارب المختلفة حتى لو تم استخدام نفس التقنيات ، ويمكن أن تكون مرتبطة بصحة الشظايا المستخدمة والصيانة المناسبة للأورام الحميدة بعد عملية الإنقاذ. في حالة الإنقاذ من خلال حضانة مياه البحر الخالية من الكالسيوم ، اقتصر بقاء الاورام الحميدة على 1 يوم. وبالتالي ، يمكن استنتاج أن الطريقة ليست مناسبة تماما للبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل للأنواع التي تمت دراستها ، أو يجب إجراء تكييف أفضل لتقنية الشعاب المرجانية P. verrucosa من البحر الأحمر. أظهرت النتائج المبلغ عنها أنه تم الحصول على وقت أطول للبقاء على قيد الحياة باستخدام الطرق القائمة على الزيادة التدريجية في الملوحة ، عندما تعرضت الاورام الحميدة لتنقيط المياه عالية الملوحة. يمكن لهذه الطريقة أن تحقق زيادة أكثر تحكما في الملوحة من طريقة التبخر ، في نفس الوقت الذي لا تكون فيه مسؤولة عن زيادة تركيز المواد الأخرى الموجودة في مياه البحر ، بما في ذلك النفايات الأيضية للشعاب المرجانية ، والتي يحتمل أن تكون سامة للكائن الحي. لكل هذه الأسباب ، تم اقتراح هذه الطريقة كبديل أكثر أمانا للحفاظ على الاورام الحميدة الصحية27. على الرغم من أن هذه الطريقة قد افترضت أنها أكثر أمانا لصحة الاورام الحميدة وقادرة على إنتاج الاورام الحميدة التي تعيش لفترة أطول ، وهي حقيقة تم تأكيدها في هذا المنشور الحالي ، إلا أن هناك حاجة إلى دراسات استقصائية إضافية لتأكيدها. أظهرت كل من تجارب الإنقاذ الناجمة عن الملوحة العالية انفصالا كاملا عن الاورام الحميدة بعد أن وصلت الملوحة إلى 59 PSU في 24 ساعة. إذا زادت الملوحة إلى ما بعد المستوى الذي اكتملت فيه عملية الإنقاذ ، فسوف يحدث المزيد من الإجهاد للأورام الحميدة ، مما يقلل من فرصتها في البقاء على قيد الحياة والتعافي من علاج الإجهاد الحاد. لذلك ، لا ينصح بالحفاظ على الاورام الحميدة لفترة أطول في مستويات الملوحة هذه. عند تنفيذ طريقة تحريض الإنقاذ عن طريق التعرض لمياه البحر الخالية من الكالسيوم ، تم الحصول على انفصال كامل من حضانة لمدة 3 ساعات في مياه البحر الاصطناعية الخالية من الكالسيوم ، مما يعني أنه لا ينصح أيضا بمزيد من التعرض لهذا الوسط.
لمعالجة الطرق التي كانت أكثر ملاءمة لدراسة الاورام الحميدة المرجانية في المسوحات المختبرية / المختبرية ، ركزت هذه الدراسة فقط على ثلاثة إجراءات استغرقت ما يقرب من 24 ساعة حتى تكتمل عملية الإنقاذ وتم استخدامها في الدراسات التي تضمنت صيانة طويلة الأجل للأورام الحميدة المرجانية من الشعاب المرجانية الصلبة. ولم يتم استخدام طرق أخرى قيل إنها تستغرق وقتا أطول بكثير من هذا الوقت. لم تتم محاولة تسوية الاورام الحميدة إلى ركيزة في هذه الدراسة ، التي ركزت على إنتاج الاورام الحميدة التي يمكن نقلها إلى بيئات مختلفة أو جمعها بسهولة للتحليل باستخدام الماصات التي يمكن التخلص منها. تظهر النتائج أن الاورام الحميدة من الأنواع المرجانية P. verrucosa تم الاحتفاظ بها على قيد الحياة ، مع خلايا zooxanthellae المرتبطة بها ، والحالة البصرية الصحية ، والبنية التشريحية الخارجية الإجمالية المحفوظة ، لمدة تصل إلى 8 أسابيع ، حتى بدون التعلق بالركيزة. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن توليد المزيد من النسخ المتماثلة البيولوجية من شظايا المرجان المفردة باستخدام بعض التقنيات الموضحة في هذه الدراسة. يمكن الاحتفاظ بهذه النسخ المتماثلة البيولوجية في بيئات خاضعة للرقابة (مثل أطباق بتري وقوارير الخلايا) وصيانتها في ظروف المختبر لإجراء تجارب لمدة شهر واستخدامها لعدة أغراض.
منذ الأوصاف العرضية الأولى لإنقاذ الاورام الحميدة42,43 ، تم إنشاء بروتوكولات جديدة لإيجاد طرق أكثر توحيدا لتحفيز إطلاق الاورام الحميدة والحفاظ على هذه الاورام الحميدة على قيد الحياة ، والتي يمكن استخدامها لتطبيقات البحوث المستقبلية. وتشمل هذه التحقيق في الجوانب المختلفة المرتبطة بفسيولوجيا هولوبيونت المرجانية44 والتفاعلات بين الميكروبيوم والمضيف 45 ، والآليات الجزيئية المشاركة في تبييض المرجان5،25 ، وصحة ومرونة وحماية المرجان holobiont12،13،46،47 . علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الاورام الحميدة المرجانية التي تم إطلاقها لتطبيقات خارج نطاق البحث ، وقد اقترح أن تكون مفيدة لإنشاء propagules التي يمكن أن تلتصق بالركيزة وتنمو ، مما قد يؤدي إلى إنشاء العديد من الأفراد المرجانيين الذين يمكن استخدامهم لأغراض الاستعادة بمجرد أن تصبح البروتوكولات الموحدة للإنقاذ واسعة الانتشار28 . بشكل عام ، على الرغم من أنه ينبغي إجراء تجارب أكثر تعمقا باستخدام الاورام الحميدة المنقذة لتوحيد المنهجية ، فقد ثبت أن إنقاذ الاورام الحميدة هو نهج قابل للتكرار يمكن تطبيقه كأداة في أبحاث الشعاب المرجانية لعدة أغراض.

الشعاب المرجانية Scleractinian أو بناء الشعاب المرجانية هي cnidarians قادرة على تشكيل الهياكل العظمية الكربونية ، وخلق الشعاب المرجانية ، والنظم الإيكولوجية المعقدة هيكليا التي يمكن العثور عليها من بيئات المياه العميقة إلى الضحلة1. وتستضيف الشعاب المرجانية المدارية تنوعا بيولوجيا عاليا وتوفر خدمات أساسية للنظم الإيكولوجية، مثل حماية السواحل وصيانة مصائد الأسماك2. تعتمد معظم الشعاب المرجانية التي تبني الشعاب المرجانية في المياه الضحلة على علاقة متبادلة مع الطحالب من عائلة Symbiodiniaceae ، والتي توفر الطاقة التي تحتاجها الشعاب المرجانية لبناء هياكلها العظمية. يمكن كسر التكافل بين المرجان والطحالب بسبب الإجهاد البيئي ، مما يتسبب في ابيضاض المرجان3،4،5،6. تسببت حالات الشذوذ الأخيرة في درجات الحرارة في أحداث ابيضاض المرجان الرئيسية في جميع أنحاء العالم ، مما أدى إلى وفيات الشعاب المرجانية الجماعية وتدهور الشعاب المرجانية الدائم7،8،9،10،11. نظرا لأن هذه الظاهرة تعتمد على طرد المتكافلات بواسطة الآليات الخلوية المرتبطة بالإجهاد الحراري بعد الإجهاد الحراري ، مثل موت الخلايا المبرمج ، والالتهام الذاتي ، والإفرازات الخارجية ، يمكن وصف ابيضاض المرجان بأنه عملية خلوية لها عواقب على نطاق النظام البيئي 5,6,12 ، مما يعني أن وجود مزارع في المختبر للخلايا أو الأنسجة المرجانية سيكون قابلا للتطبيق لدراسة هذه الظاهرة عن كثب.
نظرا لأهمية الشعاب المرجانية والتهديدات الرئيسية التي تواجهها ، لا سيما في العقدين الماضيين2 ، أصبحت الشعاب المرجانية محور البحث لأغراض الحماية والترميم في جميع أنحاء العالم13. ومع ذلك ، فإن تطوير مناهج وأنظمة تجريبية موثوقة وقابلة للتكرار وتوفر الحد الأدنى من التأثير البيئي لدراسة الشعاب المرجانية هو صراع كبير في هذا المجال.
يعرف التكاثر الدقيق بأنه الانتشار المختبري للنمط الوراثي للكائن الحي عن طريق زراعة مواده البيولوجية في الأوعية الخاضعة للرقابة14,15. كانت زراعة الخلايا والأنسجة والأعضاء أمرا بالغ الأهمية لبيولوجيا النبات والحيوان على مدى العقود الأخيرة. يسمح بالتكاثر الجماعي للكائنات الحية في المختبرات ، والتقييم السريع للعلاجات المختلفة (مثل الأدوية والمستحضرات الصيدلانية) ، والدراسة المباشرة لوظيفة الخلية14،15،16،17. بشكل عام ، كانت النماذج في المختبر مفيدة لاستكمال وتعميق دراسات الكائنات الحية المختلفة في ظل ظروف فيزيائية وكيميائية أفضل سيطرة. نظرا لمزايا تقنيات الاستزراع في المختبر ، تم تطوير تقنيات زراعة الخلايا والأنسجة الحيوانية المختلفة وتحسينها واستخدامها كأدوات مهمة في العديد من المجالات البحثية ، حيث تمت دراسة خطوط خلايا متعددة وتسويقها للعديد من التطبيقات16،17،18.
تم إحراز العديد من التطورات في معرفة زراعة الخلايا والأنسجة منذ أول زراعة للأنسجة الحيوانية في عام 1882 17 ، مثل استخدام الوسائط الطبيعية والاصطناعية ، واختراع خطوط الخلايا الثابتة ، وتطوير وسائط ثلاثية الأبعاد لزراعة العديد من أنواع الخلايا بطريقة أفضل16,17 ، 18,19. ومع ذلك ، فقد ركز مجال بيولوجيا الخلية في الغالب على مجموعة مختارة من الكائنات الحية النموذجية ، في حين أن العديد من الأصناف لا تزال تفتقر إلى ثقافات راسخة في المختبر من الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء20. على سبيل المثال ، في أبحاث الشعاب المرجانية ، لم يتم استخدام خطوط الخلايا الخالدة على نطاق واسع للبحث ، مما يقيد أبحاث الخلايا المرجانية باستخدام مزارع الخلايا الأولية. تقتصر صلاحية هذه الثقافات على بضعة أسابيع 21 ، مع عدم وجود دراسات تسجل بقاء الخلايا الفردية من جميع الأنسجة المرجانية لأكثر من 13 يوما حتى بداية عام2021 22. كان أول تقرير عن خطوط الخلايا المرجانية المستدامة التي سيتم نشرها مع خلايا Acropora tenuis التي عاشت ما يصل إلى 6 أشهر ، ولا يزال يتعين استكشاف فائدة هذه الخلايا للبحوث المستقبلية23.
للتغلب على القيود المفروضة على زراعة مزارع الخلايا المرجانية والحفاظ على ثقافة مختبرية تحافظ على التنظيم العام للأنسجة من الشعاب المرجانية ، تم اقتراح استخدام الاورام الحميدة المعزولة مؤخرا كنموذج لأبحاث البيولوجيا المرجانية24,25. الاورام الحميدة هي الوحدات التشريحية للشعاب المرجانية ، ولكل منها فم يقع في وسط قرصها الفموي ويرتبط بالاورام الحميدة الأخرى بواسطة coenosarc في منطقته الفموية26. يحدث فصل الاورام الحميدة الحية بشكل طبيعي عن طريق عملية إنقاذ الاورام الحميدة ، حيث يتسبب الإجهاد الحاد في هضم الكوينوسارك بين الاورام الحميدة ، والتي يمكن أن تنفصل بعد ذلك عن الهيكل العظمي للمستعمرة25،27،28. تم الإبلاغ عن حدوث هذه الظاهرة في مجموعة متنوعة من الأصناف ، بما في ذلك الشعاب المرجانية الثماني 29،30،31 ، والشعاب المرجانية السوداء 32 ، والشعاب المرجانية الصلبة 25،27،28،32،33 ، وتم ربطها بضغوط بيئية متعددة ، مثل نقص الكالسيوم في الماء 24،34 ، وزيادة الحموضة 35 ، ظروف فرط التناضح 25،27،32،36 ، ودرجات الحرارة المرتفعة 36،37 ، والمجاعة 33 ، والتعرض للهواء 25،30 ، والتلوث بالمبيدات الحشرية 28،38. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن إنقاذ الاورام الحميدة في الشعاب المرجانية pocilloporid19 ، والتي يتم توزيعها على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم وتستخدم عادة كنماذج في أبحاث الشعاب المرجانية. الأنواع التي تنتمي إلى هذه المجموعة ، مثل Pocillopora damicornis و Styllophora pistillata ، ولدت ما يقرب من 30-40 ميكروبروبيجا من جزء5 مم 25. يؤكد هذا الرقم على ميزة استخدام إنقاذ الاورام الحميدة كوسيلة للتكاثر الدقيق للشعاب المرجانية ، لأنه يخلق إمكانية توليد العديد من الأفراد المتطابقين وراثيا من قطعة صغيرة من الشعاب المرجانية. كما أن استخدام الاورام الحميدة المعزولة للبحث له نفس مزايا مزارع الخلايا فيما يتعلق بإمكانية استزراعها في بيئات مختبرية خاضعة للرقابة ، مثل القوارير والأطباق البيتروتينية. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتت منصات الموائع الدقيقة للحفاظ على الاورام الحميدة الحية أنه يمكن الاحتفاظ بهذه التكاثرات الدقيقة في بيئات رخيصة نسبيا وسهلة التكاثر ، مع التحكم في تدفق المياه والسطح ودرجة الحرارة24,25. يمكن أيضا استخدام منصات الموائع الدقيقة هذه لتصور الهياكل المرجانية الحية تحت المجهر مباشرة24,25.
في هذه المقالة ، نلخص ونوضح التقنيات التي تم تطويرها لعزل الاورام الحميدة المرجانية الفردية من مستعمراتها ، موضحا كيفية الحفاظ عليها في ظروف المختبر للزراعة طويلة الأجل. وتشمل الطرق التي نوقشت إنقاذ الاورام الحميدة من خلال ظروف فرط التناضح عن طريق التبخر وضخ مياه البحر عالية الملوحة والحضانة في مياه البحر الخالية من الكالسيوم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5560 Conductivity/Temperature Probe</td>
			<td>YSI</td>
			<td>5560</td>
			<td>Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2004083</td>
			<td>Used to cut coral fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>Used in DMEM medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt</td>
			<td>Schego</td>
			<td>548</td>
			<td>Heaters used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite Version 4.2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software used for image capture in demonstrative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica IC80 HD</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>12730216</td>
			<td>Camera used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MDG33</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 123</td>
			<td>Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Z6 APO</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Macroscope used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77602-10</td>
			<td>Peristaltic pump head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07557-00</td>
			<td>Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Tubing for peristaltic pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex 33 mm PVDF 0.22 &#181;m Sterile RUO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Used to filter artificial sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Flask usually used for cell culture used for polyp culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker, Advanced 5000, VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2916</td>
			<td>Shaker used inside incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator - I-22VL</td>
			<td>Percival</td>
			<td>NA</td>
			<td>Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton net 200 &#181;m mesh size</td>
			<td>KC Denmark</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for covering petri dishes containing coral polyps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProQuatro Multiparameter Meter</td>
			<td>YSI</td>
			<td>606950</td>
			<td>Used for measuring salinity thoughout the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RADION XR15 G5 PRO</td>
			<td>Ecotech</td>
			<td>NA</td>
			<td>Lights used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Sea Salt 
			Premium grade, moderate Alkalinity</td>
			<td>Red Sea</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to prepare 40 PSU artifical sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRD 112 thermostat</td>
			<td>Schego</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermostat used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbelle Nanostream 6025</td>
			<td>Tunze</td>
			<td>6025 000</td>
			<td>Pumps used in aquarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use

الشعاب المرجانية هي استعمارية تتكون من وحدات معيارية تسمى الاورام الحميدة. ترتبط الاورام الحميدة المرجانية من الناحية الفسيولوجية وترتبط عن طريق الأنسجة. ظاهرة إنقاذ الاورام الحميدة هي عملية ناجمة عن الإجهاد الحاد ، حيث تقوم الاورام الحميدة المرجانية بهضم الأنسجة التي تربطها ببقية المستعمرة وتنفصل في النهاية عن الهيكل العظمي لمواصلة العيش كأفراد منفصلين. اعترف علماء الأحياء المرجانية بعملية إنقاذ الاورام الحميدة لسنوات ، ولكن في الآونة الأخيرة فقط تم الاعتراف بالبروبات الدقيقة الناتجة عن هذه العملية كنظام نموذجي لدراسات بيولوجيا المرجان. يمكن أن يؤدي استخدام إنقاذ الاورام الحميدة إلى إنشاء عدد كبير من الوحدات النسيلة من جزء مرجاني واحد. فائدة أخرى هي أنه يمكن تصور الاورام الحميدة المفردة أو بقع من الاورام الحميدة بسهولة تحت المجهر والحفاظ عليها في بيئات منخفضة التكلفة موحدة للغاية مثل أطباق بتري والقوارير ورقائق الموائع الدقيقة. يوضح هذا البروتوكول طرقا قابلة للتكرار قادرة على تحفيز التكاثر الدقيق للشعاب المرجانية والنهج المختلفة للحفاظ على الاورام الحميدة المفردة على قيد الحياة على المدى الطويل. كانت هذه المنهجية قادرة على زراعة الاورام الحميدة بنجاح من الأنواع المرجانية Pocillopora verrucosa لمدة تصل إلى 8 أسابيع بعد الإنقاذ ، مما يدل على التطبيق العملي لاستخدام الاورام الحميدة المرجانية الفردية لأبحاث الشعاب المرجانية.

تم تحفيز إنقاذ الاورام الحميدة في شظايا المرجان التي تنتمي إلى مستعمرة واحدة من النوع P. verrucosa باتباع ثلاث طرق مختلفة (الشكل 1). اكتملت عملية الإنقاذ الناجمة عن ارتفاع الملوحة بعد تبخر الماء بعد 24 ساعة من حضانة شظايا المرجان في أطباق بتري في درجة حرارة محيطة مملوءة بالماء في البداية عند 40 وحدة نفط صينية ، والتي وصلت بعد ذلك إلى ملوحة نهائية تبلغ 59 وحدة نفط صينية بمجرد انتهاء العملية (الشكل 2A-C ، I). كما تم التوصل إلى الإنقاذ عن طريق إمدادات المياه المالحة بعد 24 ساعة من حضانة المياه في البداية عند 40 PSU التي وصلت إلى ملوحة 52 PSU بعد 12 ساعة و 59 PSU في نهاية العملية ، بعد 24 ساعة (الشكل 2D-F ، I). في كلتا التجربتين ، كانت الزيادة في الملوحة مسؤولة عن تحريض هضم الأنسجة بواسطة الاورام الحميدة. بعد 12 ساعة ، تسببت حالة الملوحة العالية في تقلص الاورام الحميدة بالتزامن مع التخفيف التدريجي لل coenosarc ، مما تسبب في النهاية في الانفصال النهائي للأورام الحميدة بعد 24 ساعة. اكتمل تحريض الإنقاذ من خلال الحضانة في مياه البحر الخالية من الكالسيوم بعد حضانة 3h في CaFSW تليها حضانة 20h في وسائط DMEM 20٪ (الشكل 2G-H). تم فصل النسيج عن الهيكل العظمي في جميع الطرق الثلاث بعد دفعه بعيدا باستخدام ماصة حتى تم إنشاء الاورام الحميدة المرجانية الفردية (الشكل 3A-C) و "كرات الأنسجة".
بعد الانفصال ، تم جمع الاورام الحميدة من جميع الطرق الثلاث والسماح لها بالتعافي في مياه البحر قبل تخصيصها لأطباق بتري المغطاة بالشباك أو قوارير الخلايا. تم الحفاظ على الاورام الحميدة التي تم الحصول عليها من التبخر وطرق إمدادات المياه في أطباق بتري داخل أحواض السمك وبقيت على قيد الحياة لمدة 6 أسابيع و 8 أسابيع ، على التوالي (الشكل 3D والشكل 3F). احتفظت هذه الميكروبروبيات بالتشريح المعتاد للأورام الحميدة ، حيث قدمت مخالب وأقراص قاعدية وأفواه1. الاورام الحميدة التي تم الحصول عليها من خلال الحضانة في مياه البحر الخالية من الكالسيوم كان لها عمر افتراضي قصير ، على قيد الحياة تصل إلى 1 يوم ، وبعد ذلك انفصلت أنسجتها. الاورام الحميدة التي تم الحصول عليها من طريقة تبخر مياه البحر المحفوظة في قوارير زراعة الخلايا داخل الحاضنات بقيت على قيد الحياة لمدة تصل إلى 3 أسابيع دون تفكك الأنسجة (الشكل 3F). في جميع الحالات ، على الرغم من أن الاورام الحميدة لم تستطع الالتصاق بالركيزة ، إلا أنها كانت صحية بصريا وحافظت على لونها ، مع استمرار ظهور خلايا zooxanthellae داخل أنسجتها1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig01v2.jpg"> الشكل 1: تمثيل تخطيطي للمنهجيات الثلاث المختلفة التي تم اختبارها لتحريض إنقاذ الاورام الحميدة (يسار) متبوعا بتوضيح طريقتين للحفاظ على الاورام الحميدة المكتسبة في ظروف المختبر (يمين). (أ) تمثيل منهجية إنقاذ الاورام الحميدة عن طريق تبخر الماء. (ب) تمثيل منهجية إنقاذ الاورام الحميدة عن طريق إمدادات مياه البحر عالية الملوحة. (ج) تمثيل منهجية إنقاذ الاورام الحميدة بواسطة حضانة مياه البحر الخالية من الكالسيوم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig02.jpg"> الشكل 2: صور لعملية إنقاذ الاورام الحميدة الناجمة عن ثلاث منهجيات مختلفة باستخدام شظايا من الأنواع المرجانية P. verrucosa. (أ-ج) شظية مرجانية في 0 ساعة و 12 ساعة و 24 ساعة بعد الحضانة ، على التوالي ، في طبق بتري باستخدام طريقة تبخر الماء. (مد إلى واو) شظية مرجانية في 0 ساعة و 12 ساعة و 24 ساعة بعد الحضانة ، على التوالي ، باستخدام طريقة إمدادات مياه البحر عالية الملوحة. (ز، ح) شظايا المرجان المعرضة لطريقة حضانة مياه البحر الخالية من الكالسيوم قبل وبعد ، على التوالي. كانت الحضانات في مياه البحر الاصطناعية الخالية من الكالسيوم لمدة 3 ساعات وفي 20٪ DMEM لمدة 21 ساعة. (I) تمثيل بياني لقيم الملوحة في PSU لمياه البحر بمرور الوقت أثناء تبخر المياه وطرق تحريض إنقاذ إمدادات مياه البحر عالية الملوحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig03.jpg"> الشكل 3: صور الاورام الحميدة P. verrucosa التي تم الحصول عليها من إجراءات تحريض الإنقاذ الثلاثة المثبتة. (A-C) تم التقاط صور الاورام الحميدة التي تم الحصول عليها من طرق التبخر وإمدادات المياه المالحة ومياه البحر الخالية من الكالسيوم ، على التوالي ، فور فصلها عن الهيكل العظمي. (د) صورة ورم مرجاني تم الحصول عليه من طريقة التبخر بعد البقاء على قيد الحياة لمدة 6 أسابيع في طبق بتري. (ه) صورة ورم مرجاني تم الحصول عليه من طريقة إمدادات المياه المالحة بعد البقاء على قيد الحياة لمدة 8 أسابيع في طبق بتري. (و) صورة ورم مرجاني تم الحصول عليه من طريقة التبخر بعد البقاء على قيد الحياة لمدة 3 أسابيع في قارورة زراعة الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use at JoVE.com

Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

إنقاذ الاورام الحميدة هي عملية ناجمة عن الإجهاد الحاد ، حيث تقوم الاورام الحميدة المرجانية بهضم الأنسجة التي تربطها بمستعمرتها والانفصال عنها للعيش كأفراد. يصف هذا البروتوكول كيفية الحث على التكاثر الدقيق للشعاب المرجانية عن طريق الإنقاذ باستخدام معالجات مياه البحر شديدة الملوحة أو الخالية من الكالسيوم.

تحفيز إنقاذ الاورام الحميدة في مستعمرات الشعاب المرجانية للحصول على الإكثار الدقيق الفردي للاستخدام التجريبي المختبري

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of ...

لا يزال التكاثر الدقيق المرجاني في مهده. يعد تحسين بروتوكولات إنقاذ الاورام الحميدة أمرا أساسيا لسد هذه الفجوة مما يسمح للعلماء باستخدام الاورام الحميدة كنماذج لدراسة الشعاب المرجانية في بيئات المختبرات. يجعل إنقاذ الاورام الحميدة من الممكن إنشاء العديد من الانتشار من شظايا المرجان الصغيرة.يمكن استخدام الاورام الحميدة في تجارب مختلفة تسهل مراقبة العمليات المجهرية في الشعاب المرجانية ، على سبيل المثال. الشعاب المرجانية مهددة. هدفنا هو استخدام هذا النموذج القابل للتكرار لتطوير استراتيجيات لحماية الشعاب المرجانية من التبييض والتهديدات البيئية الأخرى بطريقة فعالة وغير جراحية.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التحقيق في فسيولوجيا المرجان وتفاعلات الميكروبيوم المضيف والآليات التي ينطوي عليها التبييض. مثل هذه النتائج يمكن أن تسهم في تحسين البروبيوتيك المرجاني ، على سبيل المثال. استخدام مياه البحر مع الملوحة الكافية هو المفتاح.يجب أن تبدأ الملوحة على مستوى البيئة الطبيعية للشعاب المرجانية وتزداد ببطء حتى لا يكون الإجهاد ضارا بشكل مفرط. جمع الاورام الحميدة في اللحظة الصحيحة واختيار تلك التي هي الأكثر سلامة أمر بالغ الأهمية لبقائها. يمكن أن يكون العرض المرئي أمرا حيويا لفهم هذه الإشارات.أولا ، استخدم كماشة القطع القطرية لقطع شظايا صغيرة من مستعمرة مرجانية ، ثم ضعها في أطباق بتري صغيرة مليئة ب 12 ملليلتر من مياه البحر التي تأقلمت معها مستعمرة المرجان. اترك الطبق مفتوحا لمدة 24 ساعة تقريبا في درجة الحرارة المحيطة بحيث يتبخر الماء وتزداد ملوحته تدريجيا. عندما يمكن ملاحظة هضم الأنسجة بين الاورام الحميدة ، استخدم ماصة نقل 1 ملليلتر لإنشاء تدفق لطيف بالقرب من الأنسجة المرجانية.سيساعد التدفق ببطء على إكمال انفصال الاورام الحميدة التي هضمت بالفعل الأنسجة المحيطة بها من الهيكل العظمي ، ثم مع الماصة ، تبادل الماء ببطء في طبق بتري بالماء متساوي السموت. لإعداد مياه البحر عالية الملوحة ، خذ مياه البحر العادية وأضف كلوريد الصوديوم إلى مياه البحر لإعداد ثلاثة لترات من مياه البحر عالية الملوحة حتى تزداد الملوحة بنسبة 85٪ بعد قطع شظايا صغيرة من المرجان كما هو موضح سابقا ، ضعها في وعاء سعة 10 لترات مع ثلاثة لترات من مياه البحر متساوي السمنة متصل بمضخة تمعجية. املأ هذه الحاوية بثلاثة لترات من مياه البحر عالية الملوحة المعدة مسبقا لمدة 24 ساعة بمعدل 126 ملليلتر في الساعة لزيادة الملوحة بنحو 40٪ باستخدام ماصة ، قم بإنشاء تدفق لطيف للمياه لإطلاق الاورام الحميدة من الهيكل العظمي.تبادل المياه ببطء في الحاوية مع مياه البحر متساوي السمنة. أضف 26.29 جراما من كلوريد الصوديوم ، و 0.872 جراما من كلوريد البوتاسيوم ، و 2.16 جراما من كبريتات المغنيسيوم ، و 11.94 جراما من كلوريد المغنيسيوم ، و 3.42 جراما من كبريتات الصوديوم ، و 0.26 جراما من بيكربونات الصوديوم إلى لتر واحد من الماء منزوع الأيونات لإعداد مياه البحر الخالية من الكالسيوم ، ثم املأ أطباق بتري بمياه البحر الخالية من الكالسيوم. بعد قطع شظايا المرجان الصغيرة ، غمرها في مياه البحر الخالية من الكالسيوم في أطباق بتري.ضع الأطباق في حاضنة مدارية لمدة ثلاث ساعات بسرعة دوران تبلغ 80 دورة في الدقيقة ، ثم انقل الشظايا إلى أطباق بتري مملوءة ب 20٪ DMEM محضرة بمياه البحر الاصطناعية المكونة من 40 وحدة ملوحة عملية وتحتوي على 100 ملليغرام لكل لتر من الأمبيسلين. احتضان الشظايا عند 26 درجة مئوية و 80 دورة في الدقيقة. تبادل الوسائط كل يوم حتى يمكن ملاحظة هضم الأنسجة بين الاورام الحميدة وتبدأ الاورام الحميدة الفردية في الانفصال عن الهيكل العظمي ، ثم تنقل الاورام الحميدة إلى مياه البحر المعقمة وتحضنها لمدة ساعة واحدة.بمجرد عودة الاورام الحميدة إلى مياه البحر المصفاة ذات الملوحة غير المجهدة ، حدد الاورام الحميدة القابلة للحياة من خلال مراقبة سلامة الأنسجة وحركتها الناجمة عن التدفق الهدبي تحت المجهر الاستريو. ضع الاورام الحميدة المختارة في طبق بتري وقم بتغطية طبق بتري بشبكة عوالق بحجم شبكة 200 ميكرومتر حتى لا تطفو الاورام الحميدة بعيدا عن الطبق. ضع طبق بتري داخل حوض السمك مع الظروف المناسبة لأنواع الشعاب المرجانية المستخدمة.لمنع فرط نمو الطحالب ، افتح طبق بتري مرة واحدة على الأقل في الأسبوع لتجديد الماء وتنظيف الطبق. بعد اختيار الاورام الحميدة كما هو موضح سابقا ، باستخدام ماصة نقل ، ضعها في قارورة خلية سطحية مساحتها 75 سنتيمترا مربعا مملوءة ب 50 ملليلتر من مياه البحر متساوي السموتيك ، ثم أغلق القارورة وضعها في حاضنة مضبوطة في دورات ضوئية مدتها 12 ساعة ، 26 درجة مئوية و 40 دورة في الدقيقة. إذا امتلأت القارورة بالطحالب أو الأغشية الحيوية ، فانقل محتوياتها إلى قارورة نظيفة.في هذه الدراسة ، تم تحفيز إنقاذ الاورام الحميدة بثلاث طرق مختلفة. أدت طريقة تبخر المياه إلى إنقاذ كامل في غضون 24 ساعة من الحضانة ، وزادت الملوحة من 40 إلى 59 وحدة ملوحة عملية بعد 24 ساعة. كما أدت طريقة إمدادات المياه المالحة إلى إنقاذ الاورام الحميدة بعد 24 ساعة من الحضانة.وهنا زادت الملوحة من 40 إلى 52 وحدة ملوحة عملية بعد 12 ساعة من الحضانة، ثم إلى 59 وحدة ملوحة عملية بعد 24 ساعة. اكتمل تحريض الإنقاذ من خلال الحضانة في مياه البحر الخالية من الكالسيوم بعد ثلاث ساعات من حضانة الاورام الحميدة فيها ، تليها 20 ساعة من الحضانة في وسائط DMEM 20٪ ، في جميع الطرق الثلاث ، يمكن توليد الاورام الحميدة المرجانية الفردية. يمكن للأورام الحميدة المرجانية الناتجة عن طريقة التبخر البقاء على قيد الحياة لمدة ستة أسابيع ، في حين أن تلك التي تنتجها طريقة إمدادات مياه البحر عالية الملوحة يمكن أن تعيش لمدة ثمانية أسابيع في أطباق بتري داخل أحواض السمك.الاورام الحميدة التي تم الحصول عليها من طريقة تبخر مياه البحر المحفوظة في قوارير زراعة الخلايا داخل الحاضنات بقيت لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع دون تفكك كامل لأنسجتها. عند فصل الاورام الحميدة عن الهيكل العظمي ، من المهم أن تكون لطيفا. إذا لم يتم فصلها تماما ، فإن إجبار الانفصال عن طريق سحب المياه بقوة سيؤدي إلى تلف وانخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة.باستخدام هذه الطرق ، يمكن تحفيز تسوية الاورام الحميدة. يمكن أن تجيب تسوية الاورام الحميدة على أسئلة حول عمليات التكلس والنمو. بعد تطوير تحريض إنقاذ الاورام الحميدة ، تمكن الباحثون من دراسة التكوين الأولي للهيكل العظمي المرجاني وتصور ابيضاض المرجان مباشرة في مقياس الاورام الحميدة.

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

قشري الخلايا العصبية : الانتقال من التقدم في مختبر لخلية القاعدة العلاجات

Experimental Approaches to Tissue Engineering

مقاربات تجريبية لهندسة الأنسجة

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

باستخدام مايكرو سيستمز الكهربائية والميكانيكية (ممس) لتطوير أدوات التشخيص

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

آلية التفاعل اللوني مسعور اختيار عمود للاستخدام في تنقية البروتين

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

تطبيق حمض الريتينويك الحصول الثقافات Osteocytes من الابتدائية ماوس خلايا الأوستيوبلاستس

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

بروتوكول لمختبر الإسكان من الفيروز Killifish (فورزيري نوثوبرانتشيوس)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

بروتوكول تجريبي لاستخدام المورفولوجية كنظام نموذجي اللافقاريات لاختبار السمية في المختبر

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Inducing Apical Periodontitis in Mice

تحفيز أمراض اللثة المثلى في الفئران

The mechanisms involved in local induced inflammation can be studied using several available animal models. One of these is the induction of apical ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

تصنيع Amyloid-β-إفراز الجينات Microbeads لاستخدامها في نمذجة مرض الزهايمر

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...