Name: inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use
Uploaded: 2022-04-28T14:00:00
Duration: 7 min 23 s
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我们感谢亚当·巴尔诺和弗朗西斯卡·加西亚对珊瑚虫实验和监测的支持。我们也感谢KAUST沿海和海洋资源核心实验室在水族馆维护和基础设施方面的帮助。该研究由KAUST拨款编号BAS / 1 / 1095-01-01资助。

在本研究中，SCUBA通过使用锤子和凿子潜水，从Al Fahal礁（22.305118 N; 38.964568 E）中收集了属于疣 状栉珊 瑚物种的殖民地。该殖民地的属在形态学上被鉴定出来，其物种根据先前发表的工作被归类为 疣状芽孢杆菌 ，包括来自红海的 Pocillopora ，表明从遗传学的角度来看，该区域存在的物种是疣 状芽孢杆菌39，40。法哈尔礁不是受保护的环境区域的一部分，收集珊瑚不需要特别许可证。该殖民地在300升的水族箱中保存了一个月，然后被分割并“救出”息肉。水族箱保持在26°C，有两个水族箱加热器，三个泵和两个光源（见 材料表），保持12小时的光周期。通过将两个加热器中的每一个连接到温度控制器来维持水族箱的温度。光发射被编程为从早上6点开始，在下午6点结束，产生一个辐照度曲线，该曲线在下午12点达到峰值，光子为230μmol m−2s−1。
1. 水蒸发后高盐度的息肉救助
注：此方法改编自夏皮罗等人25。如果使用与 疣状孢子虫不同的物种，则在确定要切割的碎片的大小之前，应考虑息肉的大小。
<ol><li>使用对角切割钳从珊瑚群落中切割小碎片（长度小于1厘米）（参见 材料表）。 注意：根据所使用的珊瑚种类调整切割工具。对角钳可用于切割具有细枝的珊瑚。在目前的研究中，每次处理都切出一个片段，但片段的数量和大小可以根据所需的息肉数量而变化。切割碎片的大小不得超过蒸发后水的深度，因此珊瑚在过程完成后完全留在水中。</li>
	<li>将切碎的碎片放入装有12 mL海水的小培养皿中，珊瑚群已经适应了这些海水。这可以是人工海水（见 材料表）或过滤后的海水，其盐度与珊瑚群落在破碎前的盐度相同。 注意：用水完全覆盖碎片非常重要。如果培养皿中的12 mL不足以覆盖切割的片段，请相应地优化容器和体积。在本研究中，所利用的水是从红海收集的，其盐度为40 PSU，由多参数计测量（见 材料表）。</li>
	<li>将板在环境温度下打开约24小时，以便水可以蒸发，其盐度可以逐渐增加。当息肉之间可以观察到组织消化时，继续执行步骤1.4。 注意：孵育时间过后，水的盐度必须比开始时高出约40%，并且息肉需要准备好从骨架上分离。</li>
	<li>使用1 mL转移移液管，在靠近珊瑚组织的地方产生温和的流动。这种流动将慢慢地帮助息肉的完全脱离，息肉已经从骨骼中消化了它们周围的组织。 注意：当使用移液器产生水流时，单独的息肉或息肉组必须以薄片的形式从骨架上脱落。如果浑浊的物质脱落，则表明组织死亡或分解，这意味着珊瑚的孵育时间过长或压力太大（在这种情况下，盐度高）。使水的温和流动以分离息肉非常重要，因为更强的流动可能会对它们造成物理损伤。</li>
	<li>使用移液管将培养皿中的水与等烟水（使用与步骤1.2中相同的水）缓慢交换。在10分钟内进行50%的水交换足以使息肉适应无压力的盐度条件。 注：由于 使用了来自红 海的疣状栉水母的珊瑚群落，因此进行了测试以确定来自这种独特环境的珊瑚将在哪些特定条件下获救。与大多数其他珊瑚礁环境相比，重要的是要强调红海的高盐度。</li>
</ol>2. 高盐度海水供应的息肉救助
注：该方法改编自庄某等人27。
<ol><li>通过在海水中加入NaCl来制备3L高盐度海水，直到盐度增加85%，由盐度探头测量。 注：在目前的研究中，从红海的40个PSU海水中制备了74 PSU高盐度海水。</li>
	<li>按照步骤1.1中所述切割小块珊瑚。</li>
	<li>将切割的碎片放入一个10 L的容器中，该容器装有3 L等渗海水（在这种情况下，对于珊瑚具有无压力盐度的海水，与步骤1.2中使用的相同），连接到蠕动泵（参见 材料表）。 注意：为了更好地维护珊瑚的健康，可以添加温度控制器，空气泵和灯来模拟与殖民地以前暴露的相同水族箱条件。在当前工作的孵育期间，珊瑚碎片在26°C的容器中，每天光照周期为12小时。水的运动和温度的均匀性由空气泵保持。</li>
	<li>使用蠕动泵以126 mL / h的速度将含有珊瑚碎片的容器与步骤2.1中制备的高盐度海水填充24小时。加入总共3升水，盐度增加约40%。 注意：只需将NaCl添加到海水中直到达到预期的盐度即可生产高盐度水。</li>
	<li>用移液管产生温和的水流，从骨架中释放息肉（步骤1.4.）。</li>
	<li>慢慢地将含有息肉的水交换为等渗水（步骤1.5）。接下来，继续执行步骤 4 或步骤 5。</li>
</ol>3. 无钙海水孵化纾息息肉
注：该方法改编自Pang等人24。
<ol><li>通过在1L去离子水中加入26.29克NaCl，0.872克KCl，2.16克MgSO4，11.94克MgCl2，3.42克Na2SO4和0.286克NaHCO3 （见 材料表），制备无钙人造海水（CaFSW）溶液。 注意：该解决方案从以前的协议进行了调整，以更适合适应盐度为40 PSU的珊瑚。对于适应其他盐度条件的珊瑚，使用相同比例的盐，但调整溶质的总质量以获得更适合使用中的珊瑚的盐度。</li>
	<li>按照步骤1.1中所述切割小块珊瑚。</li>
	<li>将珊瑚碎片浸没在装满先前制备的CaFSW的培养皿中（步骤3.1），并以80 rpm的转速将它们孵育在轨道培养箱中3小时。 注意：同样，用水完全覆盖碎片很重要。如果培养皿不足以覆盖碎片，请根据实验需要优化容器和体积。</li>
	<li>将片段转移到培养皿或6孔板中，其中装有20%Dulbecco改性鹰培养基（DMEM）和100mg / mL氨苄西林溶液（参见 材料表），用40 PSU人造海水制备。在26°C和80rpm下孵育片段，每天交换培养基，直到息肉之间观察到组织消化并且单个息肉开始从骨架上分离。 注意：在大多数情况下，组织消化在该培养基中孵育的20小时内完成，并且不需要交换。</li>
	<li>将息肉转移到灭菌的海水中，使用移液管进行初始回收。孵育1小时后，继续执行步骤4或步骤5。</li>
</ol>4. 培养皿中的息肉维护
<ol><li>一旦息肉返回具有非应力盐度的过滤海水中，通过观察组织完整性和由立体显微镜下的睫状流动引起的运动来选择可行的息肉。</li>
	<li>将选定的息肉放入玻璃或塑料培养皿中，并用浮游生物网（200μm网状尺寸，参见 材料表）覆盖培养皿，以使息肉不会漂浮在培养皿上。 注意：网状网的大小可以根据息肉的大小而变化。重要的是要注意，网必须具有比息肉小的孔隙，并允许水交换和光穿透。</li>
	<li>将培养皿放在水族箱中，为所使用的珊瑚物种提供适当的条件。 注：在本研究中，条件是40 PSU过滤海水在26°C和12小时的光循环。</li>
	<li>每周至少打开一次培养皿，以更新水并清洁培养皿。此步骤对于消除藻类过度生长非常重要，藻类过度生长可以通过局部释放有毒化合物来与珊瑚虫竞争或破坏珊瑚虫。</li>
</ol>5. 培养箱中的息肉维护
<ol><li>选择可行的息肉，如步骤4.1中所述。</li>
	<li>使用转移移液管将息肉放入75 cm2 表面细胞瓶中，该烧瓶中装有50 mL等渗海水。 注：在目前的工作中，从红海收集的过滤海水用于息肉维护。可以使用与步骤1.2中使用的水具有相同特性的水。</li>
	<li>关闭烧瓶并将其移至培养箱中。将培养箱设置为26°C和40rpm下12小时光照循环。每4天交换50%的水量，当/如果墙壁上充满藻类或生物膜时，将内容物转移到干净的烧瓶中。 注：图像是使用配备高清摄像头的全复消色差变焦系统拍摄的（参见 材料表），以获得具有代表性的结果。</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

息肉在提交救助过程后的存活率和完成该过程所需的时间在先前报告的研究25，33，41之间有所不同，这可能由每项研究中应用的不同实验方法来解释。例如，不同的珊瑚物种，甚至来自同一物种但适应不同环境条件的珊瑚（例如，来自红海的珊瑚），对盐度水平有不同的阈值。选择的救助方法和实验室/水族箱条件在结果中也起着重要作用。在某些情况下，在实验室条件下，珊瑚微繁殖体的维持已经超过了珊瑚细胞培养物的存活时间，在偶氮杂环海3，3，41和虫黄体25珊瑚中存活了数月。在不同的研究中，息肉救助过程完成的时间也有所不同，从几个小时25，27，30到孵化的第35周，暴露于导致救助的压力源。在研究息肉救助时要考虑的另一个变量是息肉在暴露于触发息肉释放的急性压力后恢复。救助后的息肉是否处于足够好的状态以用作研究珊瑚生物学的模型，这仍然是值得商榷的。在使用这些微繁殖体时，在粘链动物降解后恢复其组织是一个值得关注的问题。然而，在许多研究中，包括现在的息肉，已经能够在25，27，32，36之后的几周内在其组织和外部形态内呈现出具有完整口腔 - 鼻腔极化和触手的虫黄藻细胞。以前的研究还发现，在从急性应激中解脱出来后，暴露于高盐水或加热海水中的释放的珊瑚息肉已经能够将与细胞凋亡，蛋白水解和细胞分裂等过程相关的基因表达恢复到与救助32，36之前相似的水平，甚至增加与组织愈合相关的基因的表达36。
关于方法之间存活率的差异，重要的是要强调，即使使用相同的技术，这段时间也可能因不同的实验而异，并且可能与所用片段的健康状况以及救助过程后息肉的适当维护有关。在通过无钙海水孵育进行救助的情况下，息肉存活率限制为1天。因此，可以得出结论，该方法不太适合所研究物种的长期生存，或者必须更好地适应来自红海的疣状疱 疹 珊瑚的技术。报道的结果显示，当息肉滴落高盐度水时，基于盐度逐渐增加的方法获得了更长的存活时间。与蒸发法相比，这种方法可以提供更可控的盐度增加，同时不会导致海水中发现的其他物质的浓度增加，包括珊瑚的代谢废物，这对生物体具有潜在的毒性。由于所有这些原因，这种方法已被建议作为维持健康息肉27的更安全的替代方案。虽然这种方法被假设对息肉健康更安全，并且能够产生寿命更长的息肉，但这一事实在目前的出版物中得到了证实，但需要进一步的调查来证实这一点。两项高盐度诱导的救助实验都表明，在盐度在24 h内达到59 PSU后息肉完全脱离。如果盐度增加超过救助完成的水平，息肉将受到进一步的压力，从而降低它们生存和从急性应激治疗中恢复的机会。因此，不建议在这样的盐度水平下将息肉维持更长时间。当通过暴露于无钙海水来执行救助诱导方法时，在无钙人工海水中孵育3小时获得完全分离，这意味着也不建议进一步暴露于该培养基。
为了解决更适合在实验室/体外调查中 研究珊瑚息肉的方法，本研究仅关注三个程序，这些程序需要近24小时才能完成救助过程，并用于涉及长期维持巩膜珊瑚虫的研究。据报道，其他方法花费的时间比这段时间要长得多，但没有使用。本研究没有尝试将息肉沉降到基质上，该研究的重点是产生可以转移到不同环境或使用一次性移液器轻松收集以进行分析的息肉。结果表明，来自珊瑚属 的 息肉保持存活，具有相关的虫黄藻细胞，健康的视觉状态和保存的大体外部解剖结构长达8周，即使没有附着在基质上。这些结果表明，使用本研究演示的一些技术，可以从单个珊瑚碎片中产生更多的生物重复。这种生物重复可以保存在受控环境（如培养皿和细胞瓶）中，并在实验室条件下进行为期一个月的实验，并用于多种目的。
自从第一次偶然描述息肉救助42，43以来，已经建立了新的方案来寻找更标准化的方法来诱导息肉释放并保持这种息肉活着，这可用于未来的研究应用。其中包括调查与珊瑚全息体生理学44和宿主 - 微生物组相互作用45相关的不同方面，珊瑚白化5，25所涉及的分子机制，以及珊瑚全息体的健康，恢复力和保护12，13，46，47.此外，释放的珊瑚息肉可用于研究领域以外的应用，并且已被建议用于创建可以附着在基质上并生长的繁殖物，一旦标准化的救助协议变得普遍，可能会产生多个可用于恢复目的的珊瑚个体28.总体而言，尽管应该使用救助息肉进行更深入的实验以使该方法标准化，但已经表明息肉救助是一种可重复的方法，可以用作珊瑚研究的工具，用于多种目的。

巩膜珊瑚或造礁珊瑚是能够形成碳酸盐骨架，形成珊瑚礁和结构复杂的生态系统的桔梗，可以从深水到浅水环境中找到1。热带珊瑚礁拥有高度的生物多样性，并提供基本的生态系统服务，如海岸保护和渔业维护2.大多数浅水造礁珊瑚依赖于与 共生藻科的藻类的互惠关系，共生藻类提供了珊瑚构建骨骼所需的能量。珊瑚和藻类之间的共生关系可以被环境压力破坏，导致珊瑚白化3，4，5，6。最近的温度异常导致世界各地的珊瑚白化事件，导致大规模珊瑚死亡和永久珊瑚礁退化7，8，9，10，11。由于这种现象是基于热应激后相关细胞机制（如细胞凋亡，自噬和胞吐作用）排出共生体，因此珊瑚白化可以被描述为具有生态系统规模后果5，6，12的细胞过程，这意味着珊瑚细胞或组织的 体外 培养将适用于密切研究这种现象。
由于珊瑚礁的重要性及其面临的主要威胁，特别是在过去二十年中2，珊瑚已成为全球保护和恢复目的的研究重点13.然而，开发可靠，可重复且对环境影响最小的方法和实验系统来研究珊瑚是该领域的主要斗争。
微繁殖被定义为通过在受控容器中培养其生物材料来体 外 增殖生物体的基因型14，15。近几十年来，细胞、组织和器官的培养对植物和动物生物学至关重要。它允许在实验室中大规模繁殖生物体，快速评估不同的治疗方法（如药物和药物），并直接研究细胞功能14，15，16，17。一般而言， 体外 模型对于在更好地控制的物理和化学条件下补充和深化不同生物体的研究是有用的。由于 体外 培养技术的优势，不同的动物细胞和组织培养技术已被开发，优化并用作许多研究领域的重要工具，其中多种细胞系已被研究和商业化用于众多应用16，17，18。
自1882年第一次动物组织培养以来，细胞和组织培养的知识已经取得了许多进步17， 例如使用天然和合成培养基， 已建立的细胞系的发明， 以及开发 3D 培养基以更好的方式培养多种细胞类型16，17，18，19.然而，细胞生物学领域主要集中在一组选定的模式生物上，而许多分类群仍然没有完善的细胞，组织或器官20的体外培养物。例如，在珊瑚研究中，没有永生化的细胞系被广泛用于研究，从而限制了珊瑚细胞研究使用原代细胞培养物。这些培养物的生存能力仅限于21周，没有研究记录所有珊瑚组织中单个细胞的存活时间超过13天，直到2021年初22。将要发表的第一份可持续珊瑚细胞系的报告是具有长达6个月的Acropora tenuis细胞，这些细胞对未来研究的效用仍有待探索23.
为了克服培养珊瑚细胞培养物的局限性并保持保留珊瑚整体组织组织的实验室培养，最近提出了使用分离的息肉作为珊瑚生物学研究的模型24，25。息肉是珊瑚的解剖学单位，它们中的每一个都有一个位于口腔圆盘中心的嘴，并通过其腹侧区域的coenosarc连接到其他息肉26。活息肉的分离通过息肉纾困过程自然发生，其中急性应激导致息肉之间腹肉的消化，然后可以从蜂群的骨骼中分离25，27，28。据报道，这种现象发生在多种分类群中，包括八角藻29，30，31，黑珊瑚32和巩刹纪珊瑚25，27，28，32，33，并且已经与多种环境压力源有关，例如水中缺钙24，34，酸度增加35，高渗条件25，27，32，36，高温36，37，饥饿33，空气暴露25，30和杀虫剂污染28，38。例如，息肉救助在斑秃珊瑚19中已有报道，这些珊瑚广泛分布在世界各地，通常用作珊瑚研究的模型。属于该组的物种，如达米角虫和西葫芦，从5毫米的25个碎片中产生了大约30-40个微繁殖体。这个数字强调了使用息肉救助作为珊瑚微繁殖方法的优势，因为它创造了从一小块珊瑚中产生许多遗传上相同的个体的可能性。使用分离的息肉进行研究也具有与细胞培养相同的优势，即在受控的实验室环境中培养的可能性，例如烧瓶和培养皿。此外，维持活息肉的微流体平台已经证明，这些微繁殖体可以保持在相对便宜且易于繁殖的环境中，水流，表面和温度受控24，25。这些微流体平台也可用于在显微镜下直接可视化活珊瑚结构24，25。
在本文中，我们总结并演示了已经开发的从其殖民地分离单个珊瑚虫的技术，展示了如何在实验室条件下维持它们以进行长期培养。所讨论的方法包括通过蒸发和泵送高盐度海水的高渗条件以及在无钙海水中孵育来拯救息肉。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5560 Conductivity/Temperature Probe</td>
			<td>YSI</td>
			<td>5560</td>
			<td>Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2004083</td>
			<td>Used to cut coral fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>Used in DMEM medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt</td>
			<td>Schego</td>
			<td>548</td>
			<td>Heaters used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite Version 4.2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software used for image capture in demonstrative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica IC80 HD</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>12730216</td>
			<td>Camera used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MDG33</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 123</td>
			<td>Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Z6 APO</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Macroscope used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77602-10</td>
			<td>Peristaltic pump head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07557-00</td>
			<td>Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Tubing for peristaltic pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex 33 mm PVDF 0.22 &#181;m Sterile RUO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Used to filter artificial sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Flask usually used for cell culture used for polyp culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker, Advanced 5000, VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2916</td>
			<td>Shaker used inside incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator - I-22VL</td>
			<td>Percival</td>
			<td>NA</td>
			<td>Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton net 200 &#181;m mesh size</td>
			<td>KC Denmark</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for covering petri dishes containing coral polyps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProQuatro Multiparameter Meter</td>
			<td>YSI</td>
			<td>606950</td>
			<td>Used for measuring salinity thoughout the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RADION XR15 G5 PRO</td>
			<td>Ecotech</td>
			<td>NA</td>
			<td>Lights used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Sea Salt 
			Premium grade, moderate Alkalinity</td>
			<td>Red Sea</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to prepare 40 PSU artifical sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRD 112 thermostat</td>
			<td>Schego</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermostat used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbelle Nanostream 6025</td>
			<td>Tunze</td>
			<td>6025 000</td>
			<td>Pumps used in aquarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use

珊瑚是由称为息肉的模块化单元形成的殖民地动物。珊瑚虫在生理上通过组织连接和连接。息肉救助现象是由急性应激引起的一个过程，其中珊瑚虫消化连接它们与殖民地其余部分的组织，并最终从骨骼中分离出来，继续作为单独的个体生活。多年来，珊瑚生物学家已经承认息肉救助的过程，但直到最近，这一过程产生的微繁殖物才被公认为珊瑚生物学研究的典范系统。使用息肉救助可以从单个珊瑚碎片中产生大量的克隆单元。另一个好处是，单个息肉或息肉斑块可以在显微镜下轻松可视化，并在高度标准化的低成本环境中进行维护，例如培养皿，烧瓶和微流体芯片。本方案展示了能够诱导珊瑚微繁殖的可重复方法以及长期维持单个息肉存活的不同方法。这种方法能够在救助后长达8周内成功培育出疣状珊 瑚物种的 息肉，展示了使用单个珊瑚息肉进行珊瑚研究的实用性。

通过三种不同的方法，在属于疣螈属物种的单一殖民地的珊瑚碎片中诱导息肉救助（图1）。在培养皿中浸泡珊瑚碎片24小时后，水蒸发后高盐度诱导的脱脱在培养皿中，最初在40 PSU下充满水，然后在过程结束后达到59 PSU的最终盐度（图2A-C，I）。在最初在40 PSU的水中孵育24小时后，盐水供应也达到了救助，该水在12小时后达到52 PSU的盐度，在过程结束时达到59 PSU，24小时后（图2D-F，I）。在这两个实验中，盐度的增加是息肉诱导组织消化的原因。12 h后，高盐度条件导致息肉收缩，同时辅酶肉逐渐变薄，最终导致息肉在24 h后最终脱离。在CaFSW中孵育3h后，然后在20%DMEM培养基中孵育20h后，通过无钙海水孵育的救助诱导完成（图2G-H）。用移液管将其推开后，在所有三种方法中将组织从骨架上分离出来，直到产生个体化的珊瑚息肉（图3A-C）和“组织球”。
分离后，收集所有三种方法的息肉并使其在海水中恢复，然后分配到覆盖有网或细胞瓶的培养皿中。从蒸发和供水方法中获得的息肉在水族箱内的培养皿中保持，并分别存活6周和8周（图3D 和 图3F）。这些微繁殖体保留了息肉的通常解剖结构，呈现触手，基底盘和口腔1。通过在无钙海水中孵育获得的息肉寿命短，存活长达1天，之后其组织解离。从海水蒸发方法获得的息肉保存在培养箱内的细胞培养瓶中，存活长达3周，而不会使组织解离（图3F）。在所有情况下，即使息肉不能附着在基质上，它们也是视觉健康的并保持其颜色，虫黄藻细胞在其组织内仍然可见1。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig01v2.jpg"> 图1：三种不同测试的息肉救助诱导方法的示意图（左图），然后是在实验室条件下维持获得性息肉的两种方法的图示（右） （A）通过水蒸发来拯救息肉的方法的表示。（B） 通过高盐度海水供应拯救息肉的方法的表述。（C） 无钙海水孵化蚌除息肉的方法说明。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig02.jpg"> 图2：使用珊瑚物种疣螈的碎片，通过三种不同的方法诱导息肉救助过程的图像。 （自动对照）分别在培养皿中使用水蒸发法在培养皿中孵育后0h，12h和24h的珊瑚碎片。（D-F）珊瑚碎片分别在孵育后0 h、12 h和24 h，采用高盐度海水供应法。（G，H）珊瑚碎片分别暴露于无钙海水孵育方法之前和之后。（I）在无钙人工海水中孵育3 h，在20%DMEM中孵育21 h.（I）在水蒸发过程中海水PSU中盐度值的图形表示和高盐度海水供应救助诱导方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig03.jpg"> 图3：从三个演示的救助诱导程序中获得的疣状疱疹息肉的图像（A-C）分别从蒸发，盐水供应和无钙海水方法获得的息肉的图像在从骨骼上分离后立即捕获。（D）在培养皿中存活6周后从蒸发方法获得的珊瑚息肉的图像。（E）在培养皿中存活8周后从盐水供应方法获得的珊瑚息肉的图像。（F）在细胞培养瓶中存活3周后从蒸发方法获得的珊瑚息肉的图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

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Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

息肉救助是由急性应激引起的一个过程，其中珊瑚息肉消化将它们连接到殖民地的组织并从中分离出来作为个体生活。本方案描述了如何使用高盐碱或无钙海水处理来救助珊瑚微繁殖。

诱导珊瑚群落息肉获救，获得个体化微繁殖物，用于实验室实验用途

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of ...

珊瑚微繁殖仍处于起步阶段。优化息肉救助方案是填补这一空白的关键，使科学家能够使用息肉作为模型来研究实验室环境中的珊瑚。息肉救助使得从小珊瑚碎片中产生多次繁殖成为可能。例如，息肉可用于不同的实验，便于观察珊瑚的微观过程。珊瑚礁受到威胁。我们的目标是使用这种可复制的模型来制定策略，以有效和非侵入性的方式保护珊瑚免受白化和其他环境威胁。这种方法可以帮助研究珊瑚生理学，宿主微生物组相互作用和白化所涉及的机制。例如，这些发现有助于优化珊瑚益生菌。使用盐度充足的海水是关键。盐度必须从珊瑚自然环境的水平开始，并缓慢增加，这样压力就不会造成过度的伤害。在正确的时刻收集息肉并选择最完整的息肉对于它们的生存至关重要。视觉演示对于理解这些线索至关重要。首先，使用对角切割钳从珊瑚群落中切割小碎片，然后将其放入充满12毫升海水的小培养皿中，珊瑚群已经适应了这些培养皿。在环境温度下将板打开约24小时，使水蒸发，其盐度逐渐增加。当息肉之间可以观察到组织消化时，使用1毫升转移移液管在靠近珊瑚组织的地方产生温和的流动。该流动将缓慢地帮助完成已经从骨架上消化其周围组织的息肉的分离，然后使用移液器，将培养皿中的水与等渗水缓慢地交换。要制备高盐度海水，取普通海水，向海水中加入氯化钠，制备三升高盐度海水，直至盐度增加85%切割小块珊瑚后，如前所示，将它们放入10升容器中，将三升等渗海水连接到蠕动泵。用三升先前制备的高盐度海水填充该容器24小时，以每小时126毫升的速度将盐度提高约40%，使用移液器，产生温和的水流以从骨架中释放息肉。将容器中的水与等渗海水缓慢交换。在一升去离子水中加入26.29克氯化钠，0.872克氯化钾，2.16克硫酸镁，11.94克氯化镁，3.42克硫酸钠和0.26克碳酸氢钠，以制备无钙海水，然后用这种无钙海水填充培养皿。切割小珊瑚碎片后，将它们浸没在培养皿中的无钙海水中。将培养皿以80rpm的转速在轨道培养箱中放置三小时，然后将碎片转移到装有20%DMEM的培养皿中，该培养皿由40个实际盐度单位的人造海水制备，每升氨苄青霉素含有100毫克。将片段在26摄氏度和80转/分下孵育。每天交换培养基，直到息肉之间观察到组织消化，单个息肉开始从骨骼中分离，然后将息肉转移到灭菌的海水中并孵育一小时。一旦息肉返回具有非应力盐度的过滤海水中，通过在立体显微镜下观察组织完整性和由纤道流动引起的运动来选择可行的息肉。将选定的息肉放入培养皿中，并用200微米网状物网覆盖培养皿，以使息肉不会漂浮在培养皿中。将培养皿放在水族箱中，为所使用的珊瑚物种提供适当的条件。为了防止藻类过度生长，每周至少打开一次培养皿以更新水并清洁培养皿。如前所述选择息肉后，使用转移移液管，将它们放入装有50毫升等渗海水的75平方厘米表面细胞瓶中，然后关闭烧瓶并将其放入设定为12小时光照周期，26摄氏度和40rpm的培养箱中。如果烧瓶中充满了藻类或生物膜，请将内容物转移到干净的烧瓶中。在这项研究中，息肉救助是通过三种不同的方法诱导的。水分蒸发法在孵育后24小时内完全脱模，24小时后，实际盐度单位从40个增加到59个。盐水供应方法在孵育24小时后也导致息肉获救。在这里，在孵育12小时后，盐度从40个实际盐度单位增加到52个，然后在24小时后增加到59个实际盐度单位。在无钙海水中孵育3小时后，在无钙海水中孵育的救助诱导在息肉中，然后在20%DMEM培养基中孵育20小时，在所有三种方法中，都可以产生个体化的珊瑚息肉。蒸发法产生的珊瑚虫可以存活六周，而高盐度海水供应法产生的珊瑚虫可以在水族箱内的培养皿中存活八周。从海水蒸发方法获得的息肉保存在培养箱内的细胞培养瓶中，存活长达三周，而其组织没有完全解离。当息肉从骨骼上分离时，重要的是要保持温和。如果它们没有完全分离，通过强烈移取水迫使分离将造成损坏并降低存活率。使用这些方法，可以诱导息肉的沉降。息肉沉降可以回答有关其钙化和生长过程的问题。在开发息肉救助诱导后，研究人员能够研究珊瑚骨架的初始形成，并直接可视化息肉尺度中的珊瑚白化。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

生物学

Experimental Approaches to Tissue Engineering

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