Name: inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use
Uploaded: 2022-04-28T14:00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use at JoVE.com

Nous remercions Adam Barno et Francisca Garcia pour leur soutien dans les expériences et le suivi des polypes coralliens. Nous remercions également le KAUST Coastal & Marine Resources Core Lab pour son aide concernant l’entretien et l’infrastructure de l’aquarium. L’étude a été financée par le numéro de subvention KAUST BAS/1/1095-01-01.

Pour la présente étude, une colonie appartenant à l’espèce de corail Pocillopora verrucosa a été collectée dans le récif d’Al Fahal (22.305118 N; 38.964568 E) par plongée sous-marine à l’aide d’un marteau et d’un ciseau. Le genre de la colonie a été identifié morphologiquement, et son espèce a été classée comme P. verrucosa sur la base de travaux précédemment publiés, y compris Pocillopora de la mer Rouge, indiquant que, d’un point de vue génétique, l’espèce présente dans cette zone est P. verrucosa39,40. Le récif d’Al Fahal ne fait pas partie d’une zone environnementale protégée et aucun permis spécial n’était nécessaire pour la collecte des coraux. La colonie a été conservée dans un aquarium de 300 L pendant un mois avant d’être fragmentée et de voir ses polypes « renfloués ». L’aquarium a été maintenu à 26 °C avec deux chauffe-aquarium, trois pompes et deux sources lumineuses (voir tableau des matériaux), maintenant un cycle de lumière de 12 h. La température de l’aquarium a été maintenue en connectant chacun des deux appareils de chauffage à un régulateur de température. L’émission de lumière a été programmée pour commencer à 6 heures du matin et se terminer à 18 heures, produisant une courbe d’irradiance qui a culminé à 12 heures avec des photons de 230 μmol m−2s−1.
1. Sauvetage des polypes par salinité élevée après évaporation de l’eau
NOTE : Cette méthode a été adaptée de Shapiro et al.25. Si vous utilisez des espèces différentes de Pocillopora verrucosa, la taille des polypes doit être prise en compte avant de déterminer la taille du fragment à couper.
<ol><li>Couper de petits fragments (moins de 1 cm de long) d’une colonie de corail à l’aide d’une pince de coupe diagonale (voir Tableau des matériaux). REMARQUE: Adaptez les outils de coupe en fonction des espèces de coraux utilisées. Les pinces diagonales sont utiles pour couper les coraux aux branches minces. Dans la présente étude, un fragment a été coupé pour chaque traitement, mais le nombre et la taille des fragments peuvent varier en fonction du nombre de polypes souhaités. La taille des fragments coupés ne doit pas dépasser la profondeur de l’eau après évaporation, de sorte que les coraux restent complètement à l’intérieur de l’eau une fois le processus terminé.</li>
	<li>Placez les fragments coupés dans de petites boîtes de Pétri remplies de 12 mL d’eau de mer à laquelle la colonie de corail a été acclimatée. Il peut s’agir d’eau de mer artificielle (voir Tableau des matériaux) ou d’eau de mer filtrée à la même salinité que la colonie de corail a été insérée avant la fragmentation. REMARQUE: Il est important de couvrir complètement le fragment avec de l’eau. Si 12 mL dans une boîte de Pétri ne suffisent pas pour couvrir le fragment coupé, optimisez le récipient et le volume en conséquence. Dans la présente étude, l’eau utilisée a été recueillie dans la mer Rouge et sa salinité était de 40 PSU, mesurée par un compteur multiparamétrique (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Laissez la plaque ouverte pendant environ 24 h à température ambiante afin que l’eau puisse s’évaporer et que sa salinité puisse augmenter progressivement. Lorsque la digestion tissulaire est observable entre les polypes, passez à l’étape 1.4. REMARQUE: Une fois le temps d’incubation écoulé, la salinité de l’eau doit être environ 40% plus élevée qu’au début et les polypes doivent être prêts à être détachés du squelette.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de transfert de 1 mL, créez un écoulement doux près du tissu corallien. Le flux aidera lentement le détachement complet des polypes qui ont déjà digéré le tissu autour d’eux du squelette. REMARQUE: Lorsque l’écoulement d’eau est créé avec la pipette, des polypes séparés ou des groupes de polypes doivent se détacher du squelette sous forme de flocons. Si une substance trouble se détache à la place, cela indique la mort ou la désintégration des tissus, ce qui signifie que les coraux ont été incubés trop longtemps ou dans un état trop stressant (dans ce cas, une salinité élevée). Il est très important de faire un écoulement doux de l’eau pour détacher les polypes, car un écoulement plus fort peut leur causer des dommages physiques.</li>
	<li>Échangez lentement l’eau de la boîte de Pétri avec de l’eau isosmotique (utilisez la même eau qu’à l’étape 1.2.) à l’aide d’une pipette. Un échange d’eau de 50% sur 10 min suffit pour acclimater les polypes à une condition de salinité non stressante. NOTE: Comme des colonies de coraux de l’espèce pocilloporidée Pocillopora verrucosa de la mer Rouge ont été utilisées, des tests ont été effectués pour déterminer dans quelles conditions spécifiques les coraux de cet environnement unique seraient renfloués. Il est important de souligner la salinité élevée de la mer Rouge par rapport à la plupart des autres environnements récifaux.</li>
</ol>2. Sauvetage des polypes par un approvisionnement en eau de mer à haute salinité
NOTE: Cette méthode a été adaptée de Chuang et al.27.
<ol><li>Préparer 3 L d’eau de mer à haute salinité en ajoutant du NaCl à l’eau de mer jusqu’à ce que la salinité augmente de 85 %, mesurée par une sonde de salinité. REMARQUE: Dans la présente étude, une eau de mer à haute salinité de 74 PSU a été préparée à partir de 40 PSU d’eau de mer de la mer Rouge.</li>
	<li>Coupez de petits fragments de corail comme décrit à l’étape 1.1.</li>
	<li>Placez les fragments coupés dans un récipient de 10 L rempli de 3 L d’eau de mer isosmotique (dans ce cas, de l’eau de mer avec une salinité non stressante pour les coraux, la même que celle utilisée à l’étape 1.2) reliée à une pompe péristaltique (voir Tableau des matériaux). REMARQUE: Pour un meilleur maintien de la santé des coraux, des régulateurs de température, des pompes à air et des lumières peuvent être ajoutés pour simuler les mêmes conditions d’aquarium auxquelles la colonie était précédemment exposée. Pendant l’incubation dans le présent travail, les fragments de corail ont été conservés dans des récipients à 26 °C, sous un cycle de lumière quotidien de 12 h. Le mouvement de l’eau et l’homogénéisation de la température ont été maintenus par des pompes à air.</li>
	<li>Remplissez le récipient contenant des fragments de corail avec l’eau de mer à haute salinité préparée à l’étape 2.1 à l’aide de la pompe péristaltique pendant 24 h à un taux de 126 mL/ h. Ajouter un total de 3 L d’eau à une salinité croissante d’environ 40%. REMARQUE: L’eau à haute salinité peut être produite simplement en ajoutant du NaCl à l’eau de mer jusqu’à ce qu’elle atteigne la salinité prévue.</li>
	<li>Créez un écoulement d’eau doux avec une pipette pour libérer les polypes du squelette (étape 1.4.).</li>
	<li>Échangez lentement l’eau dans laquelle les polypes sont contenus contre de l’eau isosmotique (étape 1.5.). Ensuite, passez à l’étape 4 ou à l’étape 5.</li>
</ol>3. Sauvetage des polypes par incubation d’eau de mer sans calcium
NOTE: Cette méthode a été adaptée de Pang et al.24.
<ol><li>Préparer une solution d’eau de mer artificielle sans calcium (CaFSW) en ajoutant 26,29 g de NaCl, 0,872 g de KCl, 2,16 g de MgSO4, 11,94 g de MgCl2, 3,42 g de Na2SO4 et 0,286 g de NaHCO3 (voir tableau des matériaux) à 1 L d’eau désionisée. NOTE: Cette solution a été ajustée par rapport aux protocoles précédents pour être mieux adaptée aux coraux adaptés à une salinité de 40 PSU. Pour les coraux adaptés à d’autres conditions de salinité, utilisez la même proportion de sels mais ajustez la masse totale des solutés pour obtenir la salinité qui convient le mieux aux coraux utilisés.</li>
	<li>Coupez de petits fragments de coraux comme décrit à l’étape 1.1.</li>
	<li>Immergez les fragments de corail dans des boîtes de Petri remplies de CaFSW préparés précédemment (étape 3.1.) et incubez-les dans des incubateurs orbitaux à une vitesse de rotation de 80 tr / min pendant 3 h. REMARQUE: Encore une fois, il est important de couvrir complètement le fragment avec de l’eau. Si une boîte de Petri ne suffit pas à recouvrir le fragment, optimisez le récipient et le volume en fonction des besoins expérimentaux.</li>
	<li>Transférer les fragments dans des boîtes de Petri ou des plaques à 6 puits remplies de 20 % de Milieux d’aigle modifiés (DMEM) de Dulbecco et de 100 mg/mL de solution d’ampicilline (voir tableau des matériaux) préparés avec de l’eau de mer artificielle à 40 PSU. Incuber les fragments à 26 °C et 80 tr/min, en échangeant le milieu tous les jours jusqu’à ce que la digestion des tissus soit observable entre les polypes et que les polypes individuels commencent à se détacher du squelette. REMARQUE: Dans la plupart des cas, la digestion des tissus est terminée dans les 20 heures suivant l’incubation dans ce milieu et aucun échange n’est nécessaire.</li>
	<li>Transférer les polypes dans de l’eau de mer stérilisée pour une récupération initiale à l’aide d’une pipette. Après 1 h d’incubation, passez à l’étape 4 ou à l’étape 5.</li>
</ol>4. Entretien des polypes dans les boîtes de Pétri
<ol><li>Une fois que les polypes sont renvoyés dans de l’eau de mer filtrée avec une salinité non stressante, sélectionnez les polypes viables en observant l’intégrité tissulaire et le mouvement causés par l’écoulement ciliaire sous un stéréomicroscope.</li>
	<li>Placez les polypes sélectionnés dans une boîte de Petri en verre ou en plastique et recouvrez la boîte de Petri d’un filet planctonique (maillage de 200 μm, voir Tableau des matériaux) afin que les polypes ne flottent pas loin du plat. REMARQUE: La taille du filet maillé peut varier en fonction de la taille des polypes. Il est important de noter que les filets doivent avoir des pores plus petits que les polypes et permettre l’échange d’eau et la pénétration de la lumière.</li>
	<li>Placez la boîte de Petri à l’intérieur d’un aquarium avec les conditions appropriées pour les espèces de coraux utilisées. NOTE: Dans la présente étude, les conditions étaient de 40 PSU d’eau de mer filtrée à 26 ° C et un cycle de lumière de 12 h.</li>
	<li>Ouvrez les boîtes de Petri au moins une fois par semaine pour renouveler l’eau et nettoyer la vaisselle. Cette étape est importante pour éliminer la prolifération d’algues qui peuvent concurrencer ou endommager les polypes coralliens en libérant localement des composés toxiques.</li>
</ol>5. Entretien des polypes dans les incubateurs
<ol><li>Sélectionnez les polypes viables comme décrit à l’étape 4.1.</li>
	<li>Placer les polypes dans des flacons cellulaires desurface de 75 cm 2 remplis de 50 mL d’eau de mer isosmotique à l’aide de pipettes de transfert. REMARQUE: Dans les travaux actuels, de l’eau de mer filtrée recueillie dans la mer Rouge a été utilisée pour l’entretien des polypes. L’eau ayant les mêmes caractéristiques que celle utilisée à l’étape 1.2 peut être utilisée.</li>
	<li>Fermez les flacons et déplacez-les dans des incubateurs. Réglez les incubateurs sur des cycles de lumière de 12 h à 26 °C et 40 tr/min. Échangez 50% du volume d’eau tous les 4 jours et transférez le contenu dans des flacons propres lorsqu’ils sont remplis d’algues ou de biofilm sur les murs. REMARQUE: Les images ont été capturées avec un système de zoom entièrement apochromatique équipé d’une caméra HD (voir tableau des matériaux) pour les résultats représentatifs.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le taux de survie des polypes après avoir été soumis à des processus de sauvetage et le temps nécessaire pour que le processus soit terminé varient parmi les recherches précédemment rapportées 25,33,41, ce qui s’explique peut-être par les différentes approches expérimentales appliquées dans chaque étude. Par exemple, différentes espèces de coraux, ou même des coraux de la même espèce mais acclimatés à des conditions environnementales différentes (par exemple, des coraux de la mer Rouge), présentent des seuils différents pour les niveaux de salinité. La méthode de renflouement choisie et les conditions de laboratoire / aquarium jouent également un rôle important dans les résultats. Dans certains cas, le maintien des micropropagates coralliens dans des conditions de laboratoire a dépassé le temps de survie des cultures de cellules coralliennes en atteignant des mois de survie dans les coraux azooxanthellate 3 3,41 et zooxanthellate25. Le temps nécessaire pour que le processus de sauvetage des polypes soit terminé a également varié dans différentes études, allant de quelques heures2 5,2 7,30 à des semaines35 d’incubation exposées au facteur de stress responsable du renflouement. Une autre variable à prendre en compte lors de l’étude du renflouement des polypes est la récupération des polypes après une exposition au stress aigu qui a déclenché leur libération. Il est encore discutable si les polypes après le renflouement sont dans un état suffisant pour être utilisés comme modèles pour étudier la biologie corallienne. La récupération de leurs tissus après la dégradation du coénosarc est un sujet de préoccupation lors de l’utilisation de ces micropropagués. Cependant, les polypes dans de nombreuses études, y compris la présente, ont été en mesure de présenter des cellules zooxanthelles à l’intérieur de leurs tissus et morphologies externes avec une polarisation orale-aborale intacte et des tentacules des semaines après le renflouement 25,27,32,36. Des études antérieures ont également montré que, après avoir été soulagés du stress aigu, les polypes coralliens libérés exposés à de l’eau de mer hautement saline ou chauffée ont été capables de récupérer l’expression de gènes liés à des processus tels que l’apoptose, la protéolyse et la division cellulaire à des niveaux similaires à ceux trouvés avant le renflouement32,36 et même d’augmenter l’expression des gènes liés à la guérison des tissus36.
En ce qui concerne la différence de survie entre les méthodes, il est important de souligner que ce temps peut varier entre différentes expériences même si les mêmes techniques sont utilisées, et il peut être lié à la santé des fragments utilisés et au bon entretien des polypes après le processus de sauvetage. Dans le cas du renflouement par incubation d’eau de mer sans calcium, la survie du polype était limitée à 1 jour. Ainsi, on peut conclure que la méthode n’est pas bien adaptée à la survie à long terme des espèces étudiées, ou qu’une meilleure adaptation de la technique pour les coraux P. verrucosa de la mer Rouge doit être faite. Les résultats rapportés ont montré qu’un temps de survie plus long a été obtenu avec les méthodes basées sur l’augmentation progressive de la salinité, lorsque les polypes ont été soumis à l’écoulement d’eau à haute salinité. Cette méthode peut fournir une augmentation plus contrôlée de la salinité que la méthode d’évaporation, tout en n’étant pas responsable d’une augmentation de la concentration d’autres substances présentes dans l’eau de mer, y compris les déchets métaboliques du corail, qui sont potentiellement toxiques pour l’organisme. Pour toutes ces raisons, cette méthode a été suggérée comme une alternative plus sûre pour maintenir des polypes sains27. Bien que cette méthode ait été supposée être plus sûre pour la santé des polypes et capable de produire des polypes qui vivent plus longtemps, un fait qui a été corroboré dans cette publication, des enquêtes supplémentaires sont nécessaires pour le confirmer. Les deux expériences de renflouement induit par une salinité élevée ont démontré un détachement complet des polypes après que la salinité ait atteint 59 PSU en 24 h. Si la salinité est augmentée au-delà du niveau auquel le renflouement est terminé, un stress supplémentaire sera causé aux polypes, réduisant ainsi leurs chances de survivre et de se remettre du traitement de stress aigu. Par conséquent, il n’est pas recommandé de maintenir les polypes plus longtemps dans de tels niveaux de salinité. Lors de la réalisation de la méthode d’induction de renflouement par exposition à de l’eau de mer sans calcium, un détachement complet a été obtenu à partir d’une incubation de 3 heures dans de l’eau de mer artificielle sans calcium, ce qui signifie qu’une exposition supplémentaire à ce milieu n’est pas non plus recommandée.
Pour aborder les méthodes qui étaient plus adéquates pour l’étude des polypes coralliens dans les enquêtes en laboratoire / in vitro , cette étude s’est concentrée uniquement sur trois procédures qui ont pris près de 24 heures pour que le processus de sauvetage soit terminé et ont été utilisées dans des études impliquant l’entretien à long terme des polypes coralliens des coraux scléractiniens. D’autres méthodes qui ont pris beaucoup plus de temps que ce temps n’ont pas été utilisées. Le tassement des polypes sur un substrat n’a pas été tenté dans cette étude, qui s’est concentrée sur la production de polypes qui pourraient être transférés dans différents environnements ou facilement collectés pour des analyses à l’aide de pipettes jetables. Les résultats démontrent que les polypes de l’espèce de corail P. verrucosa ont été maintenus en vie, avec des cellules zooxanthelles associées, un état visuel sain et une structure anatomique externe brute préservée, jusqu’à 8 semaines, même sans attachement à un substrat. Ces résultats indiquent que davantage de répliques biologiques peuvent être générées à partir de fragments de corail uniques en utilisant certaines des techniques démontrées dans cette étude. Ces répliques biologiques peuvent être conservées dans des environnements contrôlés (comme des boîtes de Pétri et des flacons cellulaires) et maintenues dans des conditions de laboratoire pour des expériences d’un mois et utilisées à plusieurs fins.
Depuis les premières descriptions fortuites du renflouement des polypes42,43, de nouveaux protocoles ont été établis pour trouver des méthodes plus normalisées pour induire la libération de polypes et maintenir ces polypes vivants, qui peuvent être utilisés pour de futures applications de recherche. Il s’agit notamment d’étudier différents aspects associés à la physiologie de l’holobionte corallien44 et aux interactions hôte-microbiome45, aux mécanismes moléculaires impliqués dans le blanchiment des coraux 5,25 et à la santé, à la résilience et à la protection de l’holobiote corallien 12,13,46,47 . De plus, les polypes coralliens relâchés peuvent être utilisés pour des applications en dehors du domaine de la recherche et ont été suggérés comme étant utiles pour créer des propagules qui peuvent se fixer à un substrat et se développer, créant potentiellement plusieurs individus coralliens qui peuvent être utilisés à des fins de restauration une fois que les protocoles normalisés de renflouement se sont répandus28 . Dans l’ensemble, bien que des expériences plus approfondies utilisant des polypes renfloués devraient être effectuées pour normaliser la méthodologie, il a été démontré que le renflouement des polypes est une approche reproductible qui peut être appliquée comme outil dans la recherche sur les coraux à plusieurs fins.

Les coraux scléractiniens ou bâtisseurs de récifs sont des cnidaires capables de former des squelettes carbonatés, de créer des récifs et des écosystèmes structurellement complexes que l’on peut trouver dans des environnements d’eau profonde à peu profonde1. Les récifs coralliens tropicaux abritent une grande biodiversité et fournissent des services écosystémiques essentiels, tels que la protection des côtes et le maintien des pêches2. La plupart des coraux de construction de récifs en eau peu profonde reposent sur une relation mutualiste avec les algues de la famille des Symbiodiniaceae, qui fournissent l’énergie dont les coraux ont besoin pour construire leur squelette. La symbiose entre le corail et les algues peut être brisée par le stress environnemental, provoquant le blanchissement des coraux 3,4,5,6. Les anomalies de température récentes ont provoqué d’importants événements de blanchissement des coraux dans le monde entier, entraînant une mortalité massive des coraux et une dégradation permanente des récifs 7,8,9,10,11. Comme ce phénomène est basé sur l’expulsion des symbiotes par des mécanismes cellulaires post-stress thermique, tels que l’apoptose, l’autophagie et l’exocytose, le blanchiment des coraux peut être décrit comme un processus cellulaire qui a des conséquences à l’échelle de l’écosystème 5,6,12, ce qui signifie qu’avoir des cultures in vitro de cellules ou de tissus coralliens serait applicable pour étudier ce phénomène de près.
En raison de l’importance des récifs coralliens et des principales menaces auxquelles ils ont été confrontés, en particulier au cours des deux dernières décennies2, les coraux sont devenus le centre de la recherche à des fins de protection et de restauration dans le monde entier13. Cependant, le développement d’approches et de systèmes expérimentaux fiables, reproductibles et offrant un impact environnemental minimal pour étudier les coraux est une lutte majeure dans ce domaine.
La micropropagation est définie comme la prolifération in vitro du génotype d’un organisme en cultivant son matériel biologique dans des vaisseaux contrôlés14,15. La culture de cellules, de tissus et d’organes a été cruciale pour la biologie végétale et animale au cours des dernières décennies. Il permet la reproduction de masse des organismes en laboratoire, l’évaluation rapide de différents traitements (tels que les médicaments et les produits pharmaceutiques) et l’étude directe de la fonction cellulaire 14,15,16,17. En général, les modèles in vitro ont été utiles pour compléter et approfondir les études de différents organismes dans des conditions physiques et chimiques mieux contrôlées. En raison des avantages des techniques de culture in vitro, différentes technologies de culture de cellules et de tissus animaux ont été développées, optimisées et utilisées comme outils importants dans de nombreux domaines de recherche, où plusieurs lignées cellulaires ont été étudiées et commercialisées pour de nombreuses applications 16,17,18.
De nombreux progrès dans la connaissance de la culture cellulaire et tissulaire ont été réalisés depuis la première culture de tissus animaux en 188217, tels que l’utilisation de milieux naturels et synthétiques, l’invention de lignées cellulaires établies et le développement de milieux 3D pour cultiver une multitude de types de cellules d’une meilleure manière16,17, 18,19. Cependant, le domaine de la biologie cellulaire s’est principalement concentré sur un groupe restreint d’organismes modèles, alors que de nombreux taxons n’ont toujours pas de cultures in vitro bien établies de cellules, de tissus ou d’organes20. Par exemple, dans la recherche sur les coraux, aucune lignée cellulaire immortalisée n’a été largement utilisée pour la recherche, ce qui limite la recherche sur les cellules coralliennes à l’utilisation de cultures cellulaires primaires. La viabilité de ces cultures est limitée à quelques semaines21, aucune étude n’enregistrant la survie des cellules individuelles de tous les tissus coralliens pendant plus de 13 jours jusqu’au début de 202122. Le premier rapport sur les lignées cellulaires coralliennes durables à être publié concernait des cellules Acropora tenuis qui ont vécu jusqu’à 6 mois, et l’utilité de ces cellules pour les recherches futures reste à explorer23.
Pour surmonter les limites de la culture de cellules coralliennes et maintenir une culture en laboratoire qui préserve l’organisation tissulaire globale des coraux, l’utilisation de polypes isolés a récemment été proposée comme modèle pour la recherche en biologie des coraux24,25. Les polypes sont les unités anatomiques des coraux, et chacun d’eux a une bouche située au centre de leur disque buccal et est relié à d’autres polypes par le coénosarc dans sa région aborale26. La séparation des polypes vivants se produit naturellement par le processus de sauvetage des polypes, dans lequel un stress aigu provoque la digestion du cénosarc entre les polypes, qui peut alors se détacher du squelette de la colonie 25,27,28. Ce phénomène a été signalé dans une variété de taxons, y compris les octocoraux 29,30,31, les coraux noirs32 et les coraux scléractiniens25,27,28,32,33, et a été lié à de multiples facteurs de stress environnementaux, tels que le manque de calcium dans l’eau24,34, l’augmentation de l’acidité 35, conditions hyperosmotiques 25,27,32,36, températures élevées 36,37, famine33, exposition à l’air25,30 et contamination par lesinsecticides 28,38. Le renflouement des polypes a été, par exemple, signalé dans les coraux pocilloporides19, qui sont largement distribués dans le monde entier et sont couramment utilisés comme modèles dans la recherche sur les coraux. Des espèces appartenant à ce groupe, telles que Pocillopora damicornis et Styllophora pistillata, ont généré environ 30 à 40 micropropagués à partir d’un fragment de 5 mm25. Ce nombre souligne l’avantage d’utiliser le renflouement des polypes comme méthode de micropropagation des coraux, car il crée la possibilité de générer de nombreux individus génétiquement identiques à partir d’un petit morceau de corail. L’utilisation de polypes isolés pour la recherche présente également les mêmes avantages que les cultures cellulaires en ce qui concerne la possibilité d’être cultivés dans des environnements de laboratoire contrôlés, tels que des flacons et des boîtes de Pétri. De plus, les plates-formes microfluidiques pour maintenir les polypes vivants ont démontré que ces micropropagués peuvent être conservés dans des environnements relativement bon marché et faciles à reproduire, avec un débit d’eau, une surface et une température contrôlésde 24,25. Ces plates-formes microfluidiques peuvent également être utilisées pour visualiser directement au microscope24,25.
Dans le présent article, nous résumons et démontrons les techniques qui ont été développées pour isoler les polypes coralliens individuels de leurs colonies, montrant comment les maintenir dans des conditions de laboratoire pour une culture à long terme. Les méthodes discutées comprennent le sauvetage des polypes par des conditions hyperosmotiques par évaporation et pompage d’eau de mer à haute salinité et l’incubation dans de l’eau de mer sans calcium.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5560 Conductivity/Temperature Probe</td>
			<td>YSI</td>
			<td>5560</td>
			<td>Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2004083</td>
			<td>Used to cut coral fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>Used in DMEM medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt</td>
			<td>Schego</td>
			<td>548</td>
			<td>Heaters used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite Version 4.2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software used for image capture in demonstrative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica IC80 HD</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>12730216</td>
			<td>Camera used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MDG33</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 123</td>
			<td>Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Z6 APO</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Macroscope used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77602-10</td>
			<td>Peristaltic pump head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07557-00</td>
			<td>Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Tubing for peristaltic pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex 33 mm PVDF 0.22 &#181;m Sterile RUO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Used to filter artificial sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Flask usually used for cell culture used for polyp culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker, Advanced 5000, VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2916</td>
			<td>Shaker used inside incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator - I-22VL</td>
			<td>Percival</td>
			<td>NA</td>
			<td>Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton net 200 &#181;m mesh size</td>
			<td>KC Denmark</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for covering petri dishes containing coral polyps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProQuatro Multiparameter Meter</td>
			<td>YSI</td>
			<td>606950</td>
			<td>Used for measuring salinity thoughout the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RADION XR15 G5 PRO</td>
			<td>Ecotech</td>
			<td>NA</td>
			<td>Lights used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Sea Salt 
			Premium grade, moderate Alkalinity</td>
			<td>Red Sea</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to prepare 40 PSU artifical sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRD 112 thermostat</td>
			<td>Schego</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermostat used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbelle Nanostream 6025</td>
			<td>Tunze</td>
			<td>6025 000</td>
			<td>Pumps used in aquarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use

Les coraux sont des animaux coloniaux formés par des unités modulaires appelées polypes. Les polypes coralliens sont physiologiquement liés et reliés par les tissus. Le phénomène de renflouement des polypes est un processus induit par un stress aigu, dans lequel les polypes coralliens digèrent le tissu les reliant au reste de la colonie et se détachent finalement du squelette pour continuer à vivre en tant qu’individus séparés. Les biologistes coralliens reconnaissent le processus de sauvetage des polypes depuis des années, mais ce n’est que récemment que les micropropagates générées par ce processus ont été reconnues comme un système modèle pour les études de biologie corallienne. L’utilisation du renflouement des polypes peut créer un grand nombre d’unités clonales à partir d’un seul fragment de corail. Un autre avantage est que les polypes simples ou les plaques de polypes peuvent être facilement visualisés au microscope et maintenus dans des environnements hautement standardisés à faible coût tels que les boîtes de Pétri, les flacons et les puces microfluidiques. Le présent protocole démontre des méthodes reproductibles capables d’induire la micropropagation des coraux et différentes approches pour maintenir les polypes uniques en vie à long terme. Cette méthodologie a permis de cultiver avec succès des polypes de l’espèce de corail Pocillopora verrucosa jusqu’à 8 semaines après le sauvetage, démontrant l’aspect pratique de l’utilisation de polypes coralliens individuels pour la recherche sur les coraux.

Le renflouement des polypes a été induit dans des fragments de corail appartenant à une seule colonie de l’espèce P. verrucosa selon trois méthodes différentes (Figure 1). Le renflouement induit par une salinité élevée après évaporation de l’eau a été complet après 24 h d’incubation de fragments de corail dans des boîtes de Pétri à température ambiante remplies d’eau initialement à 40 PSU, qui a ensuite atteint une salinité finale de 59 PSU une fois le processus terminé (Figure 2A-C,I). Le renflouement par l’approvisionnement en eau salée a également été atteint après 24 h d’incubation dans l’eau initialement à 40 PSU qui a atteint une salinité de 52 PSU après 12 h et 59 PSU à la fin du processus, après 24 h (Figure 2D-F,I). Dans les deux expériences, une augmentation de la salinité était responsable de l’induction de la digestion tissulaire par les polypes. Après 12 h, l’état de salinité élevée a provoqué la contraction des polypes en conjonction avec l’amincissement progressif du coénosarc, provoquant finalement le détachement final des polypes après 24 h. L’induction de sauvetage par incubation dans de l’eau de mer sans calcium a été achevée après une incubation de 3 heures dans CaFSW suivie d’une incubation de 20 heures dans le milieu DMEM à 20 % (Figure 2G-H). Le tissu a été détaché du squelette dans les trois méthodes après l’avoir repoussé avec une pipette jusqu’à ce que des polypes coralliens individualisés (Figure 3A-C) et des « boules de tissu » soient générés.
Après le détachement, les polypes des trois méthodes ont été collectés et autorisés à récupérer dans l’eau de mer avant d’être affectés à des boîtes de Pétri recouvertes de filets ou de flacons cellulaires. Les polypes obtenus à partir de l’évaporation et des méthodes d’approvisionnement en eau ont été maintenus dans des boîtes de Petri à l’intérieur des aquariums et ont survécu pendant 6 semaines et 8 semaines, respectivement (Figure 3D et Figure 3F). Ces micropropagués ont conservé l’anatomie habituelle des polypes, présentant des tentacules, des disques basaux et des bouches1. Les polypes obtenus par incubation dans de l’eau de mer sans calcium ont eu une courte durée de vie, survivant jusqu’à 1 jour, après quoi leur tissu s’est dissocié. Les polypes obtenus à partir de la méthode d’évaporation de l’eau de mer conservés dans des flacons de culture cellulaire à l’intérieur des incubateurs ont survécu jusqu’à 3 semaines sans dissociation des tissus (Figure 3F). Dans tous les cas, même si les polypes ne pouvaient pas s’attacher au substrat, ils étaient visuellement sains et conservaient leur couleur, les cellules zooxanthelles étant toujours visibles à l’intérieur de leurs tissus1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig01v2.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique des trois différentes méthodologies testées pour l’induction du renflouement des polypes (à gauche) suivie de l’illustration de deux méthodes pour maintenir les polypes acquis dans des conditions de laboratoire (à droite). (A) Représentation de la méthodologie pour le renflouement des polypes par évaporation de l’eau. (B) Représentation de la méthodologie pour le renflouement des polypes par un approvisionnement en eau de mer à haute salinité. C) Représentation de la méthodologie pour le renflouement des polypes par incubation d’eau de mer sans calcium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig02.jpg"> Figure 2 : Images du processus de sauvetage des polypes induit par trois méthodologies différentes utilisant des fragments de l’espèce de corail P. verrucosa. (A-C) Un fragment de corail à 0 h, 12 h et 24 h après l’incubation, respectivement, dans une boîte de Pétri en utilisant la méthode d’évaporation de l’eau. (D-F) Un fragment de corail à 0 h, 12 h et 24 h après l’incubation, respectivement, en utilisant la méthode d’approvisionnement en eau de mer à haute salinité. (G,H) Fragments de corail exposés à la méthode d’incubation de l’eau de mer sans calcium avant et après, respectivement. Les incubations dans l’eau de mer artificielle sans calcium ont duré 3 h et dans 20 % de DMEM pendant 21 h. (I) Représentation graphique des valeurs de salinité dans l’UAP de l’eau de mer au fil du temps pendant l’évaporation de l’eau et les méthodes d’induction de sauvetage de l’eau de mer à haute salinité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig03.jpg"> Figure 3 : Images de polypes de P. verrucosa obtenues à partir des trois procédures d’induction de renflouement démontrées. (A-C) Les images des polypes obtenues à partir des méthodes d’évaporation, d’approvisionnement en eau salée et d’eau de mer sans calcium, respectivement, ont été capturées immédiatement après leur détachement du squelette. (D) L’image d’un polype corallien obtenu à partir de la méthode d’évaporation après avoir survécu 6 semaines dans une boîte de Pétri. (E) L’image d’un polype corallien obtenu à partir de la méthode d’approvisionnement en eau salée après avoir survécu 8 semaines dans une boîte de Pétri. (F) L’image d’un polype corallien obtenu à partir de la méthode d’évaporation après avoir survécu 3 semaines dans une fiole de culture cellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

Le renflouement des polypes est un processus induit par un stress aigu, dans lequel les polypes coralliens digèrent le tissu les reliant à leur colonie et s’en détachent pour vivre en tant qu’individus. Le présent protocole décrit comment induire la micropropagation des coraux par renflouement à l’aide de traitements à l’eau de mer hypersaline ou sans calcium.

Induire le renflouement des polypes dans les colonies de coraux pour obtenir des micropropagués individualisés à des fins expérimentales en laboratoire

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of ...

La micropropagation des coraux en est encore à ses balbutiements. L’optimisation des protocoles de sauvetage des polypes est essentielle pour combler cette lacune permettant aux scientifiques d’utiliser les polypes comme modèles pour étudier les coraux dans des environnements de laboratoire. Le renflouement des polypes permet de créer de multiples multiplications à partir de petits fragments de corail.Les polypes peuvent être utilisés dans différentes expériences facilitant l’observation de processus microscopiques chez les coraux, par exemple. Les récifs coralliens sont menacés. Notre objectif est d’utiliser ce modèle reproductible pour développer des stratégies visant à protéger les coraux du blanchiment et d’autres menaces environnementales de manière efficace et non invasive.Cette méthode pourrait aider à étudier la physiologie du corail, les interactions du microbiome de l’hôte et les mécanismes impliqués dans le blanchiment. De telles découvertes peuvent contribuer à l’optimisation des probiotiques coralliens, par exemple. L’utilisation d’eau de mer avec une salinité adéquate est la clé.La salinité doit commencer au niveau de l’environnement naturel du corail et augmenter lentement afin que le stress ne soit pas excessivement nocif. Collecter les polypes au bon moment et choisir ceux qui sont les plus intacts est crucial pour leur survie. Une démonstration visuelle peut être vitale pour comprendre ces indices.Tout d’abord, utilisez des pinces de coupe diagonales pour couper de petits fragments d’une colonie de corail, puis placez-les dans de petites boîtes de Pétri remplies de 12 millilitres d’eau de mer auxquelles la colonie de corail a été acclimatée. Laissez la plaque ouverte pendant environ 24 heures à température ambiante afin que l’eau s’évapore et que sa salinité augmente progressivement. Lorsque la digestion des tissus est observable entre les polypes, utilisez une pipette de transfert de 1 millilitre pour créer un écoulement doux près du tissu corallien.L’écoulement aidera lentement à compléter le détachement des polypes qui ont déjà digéré le tissu autour d’eux du squelette, puis avec la pipette, échangez lentement l’eau dans la boîte de Petri avec de l’eau isosmotique. Pour préparer de l’eau de mer à haute salinité, prenez de l’eau de mer normale et ajoutez du chlorure de sodium à l’eau de mer pour préparer trois litres d’eau de mer à haute salinité jusqu’à ce que la salinité augmente de 85% Après avoir coupé de petits fragments de corail comme démontré précédemment, mettez-les dans un récipient de 10 litres avec trois litres d’eau de mer isosmotique connecté à une pompe péristaltique. Remplissez ce récipient avec trois litres d’eau de mer à haute salinité préalablement préparée pendant 24 heures à raison de 126 millilitres par heure pour augmenter la salinité d’environ 40% À l’aide d’une pipette, créez un flux d’eau doux pour libérer les polypes du squelette.Échangez lentement l’eau dans le récipient avec de l’eau de mer isosmotique. Ajouter 26,29 grammes de chlorure de sodium, 0,872 gramme de chlorure de potassium, 2,16 grammes de sulfate de magnésium, 11,94 grammes de chlorure de magnésium, 3,42 grammes de sulfate de sodium et 0,26 gramme de bicarbonate de sodium à un litre d’eau désionisée pour préparer de l’eau de mer sans calcium, puis remplir les boîtes de Petri avec cette eau de mer sans calcium. Après avoir coupé de petits fragments de corail, immergez-les dans de l’eau de mer sans calcium dans les boîtes de Pétri.Mettez les plats dans un incubateur orbital pendant trois heures à une vitesse de rotation de 80 tr / min, puis transférez les fragments dans des boîtes de Petri remplies de 20% de DMEM préparées avec de l’eau de mer artificielle de 40 unités de salinité pratiques et contenant 100 milligrammes par litre d’ampicilline. Incuber les fragments à 26 degrés Celsius et 80 tr/min. Échangez le milieu tous les jours jusqu’à ce que la digestion des tissus soit observable entre les polypes et que les polypes individuels commencent à se détacher du squelette, puis transférez les polypes dans de l’eau de mer stérilisée et incubez pendant une heure.Une fois que les polypes sont renvoyés dans de l’eau de mer filtrée avec une salinité non stressante, sélectionnez les polypes viables en observant l’intégrité des tissus et le mouvement causés par l’écoulement ciliaire sous un stéréomicroscope. Placez les polypes sélectionnés dans une boîte de Pétri et recouvrez la boîte de Pétri d’un filet planctonique de 200 micromètres afin que les polypes ne flottent pas loin du plat. Placez la boîte de Petri à l’intérieur d’un aquarium avec des conditions appropriées pour les espèces de coraux utilisées.Pour éviter la prolifération d’algues, ouvrez la boîte de Petri au moins une fois par semaine pour renouveler l’eau et nettoyer la boîte. Après avoir sélectionné les polypes comme indiqué précédemment, à l’aide d’une pipette de transfert, placez-les dans une fiole de cellule de surface de 75 centimètres carrés remplie de 50 millilitres d’eau de mer isosmotique, puis fermez la fiole et mettez-les dans un incubateur réglé à des cycles de lumière de 12 heures, 26 degrés Celsius et 40 tr / min. Si la fiole est remplie d’algues ou de biofilms, transférez le contenu dans une fiole propre.Dans cette étude, le renflouement des polypes a été induit par trois méthodes différentes. La méthode d’évaporation de l’eau a entraîné un renflouement complet dans les 24 heures suivant l’incubation, et la salinité est passée de 40 à 59 unités de salinité pratiques après 24 heures. La méthode d’approvisionnement en eau salée a également entraîné le sauvetage des polypes après 24 heures d’incubation.Ici, la salinité est passée de 40 à 52 unités de salinité pratiques après 12 heures d’incubation, puis à 59 unités de salinité pratiques après 24 heures. L’induction de sauvetage par incubation dans de l’eau de mer sans calcium était terminée après trois heures d’incubation de polypes, suivie de 20 heures d’incubation dans le milieu DMEM à 20%, Dans les trois méthodes, des polypes coralliens individualisés ont pu être générés. Les polypes coralliens générés par la méthode d’évaporation pourraient survivre pendant six semaines, tandis que ceux produits par la méthode d’approvisionnement en eau de mer à haute salinité pourraient survivre pendant huit semaines dans des boîtes de Pétri à l’intérieur des aquariums.Les polypes obtenus à partir de la méthode d’évaporation de l’eau de mer conservés dans des flacons de culture cellulaire à l’intérieur des incubateurs ont survécu jusqu’à trois semaines sans dissociation complète de leurs tissus. Lors du détachement des polypes du squelette, il est important d’être doux. S’ils ne sont pas complètement détachés, forcer le détachement en pipetant fortement l’eau causera des dommages et des taux de survie plus faibles.En utilisant ces méthodes, le tassement des polypes peut être induit. La colonisation des polypes peut répondre aux questions sur ses processus de calcification et de croissance. Après le développement de l’induction du renflouement des polypes, les chercheurs ont pu étudier la formation initiale du squelette de corail et visualiser directement le blanchiment des coraux à l’échelle des polypes.

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

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Recherche

Biologie

Experimental Approaches to Tissue Engineering

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