Name: inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use
Uploaded: 2022-04-28T14:00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use at JoVE.com

אנו מודים לאדם ברנו ולפרנציסקה גרסיה על תמיכתם בניסויים ובניטור של פוליפים של אלמוגים. אנו מודים גם למעבדת הליבה של KAUST למשאבים חופיים וימיים על עזרתם בנוגע לתחזוקת האקווריום ותשתיותיו. המחקר מומן על ידי מענק KAUST מספר BAS/1/1095-01-01.

לצורך המחקר הנוכחי, מושבה השייכת למין האלמוגים Pocillopora verrucosa נאספה משונית אל פאהל (22.305118 N; 38.964568 E) על ידי SCUBA על ידי צלילה באמצעות פטיש ואזמל. הסוג של המושבה זוהה מבחינה מורפולוגית, והמין שלה סווג כ- P. verrucosa בהתבסס על עבודה שפורסמה בעבר, כולל Pocillopora מים סוף, מה שמצביע על כך שמבחינה גנטית, המין הנוכחי באזור זה הוא P. verrucosa39,40. שונית אל-פאהל אינה חלק מאזור סביבתי מוגן, ולא היה צורך באישורים מיוחדים לאיסוף אלמוגים. המושבה הוחזקה באקווריום של 300 ליטר במשך חודש לפני שהתפרקה והפוליפים שלה "הושלכו החוצה". האקווריום נשמר בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס עם שני תנורי חימום של אקווריום, שלוש משאבות ושני מקורות אור (ראו טבלת חומרים), תוך שמירה על מחזור אור של 12 שעות. הטמפרטורה של האקווריום נשמרה על ידי חיבור כל אחד משני תנורי החימום לבקר טמפרטורה. פליטת האור תוכננה להתחיל בשעה 6 בבוקר ולסיים בשעה 18:00, תוך יצירת עקומת הקרנה שהגיעה לשיאה בשעה 12:00 עם פוטונים של 230 מיקרומול m−2s−1.
1. חילוץ פוליפ על ידי מליחות גבוהה לאחר אידוי מים
הערה: שיטה זו הותאמה מתוך שפירא ואח' 25. אם משתמשים במינים שונים מאשר Pocillopora verrucosa, יש לקחת בחשבון את גודל הפוליפים לפני קביעת גודל השבר שיש לחתוך.
<ol><li>חותכים שברים קטנים (באורך של פחות מ-1 ס"מ) ממושבת אלמוגים באמצעות צבתות חיתוך אלכסוניות (ראו טבלת חומרים). הערה: התאם את כלי החיתוך בהתאם למיני האלמוגים שבהם נעשה שימוש. צבתות אלכסוניות שימושיות לחיתוך אלמוגים עם ענפים דקים. במחקר הנוכחי נחתך קטע אחד לכל טיפול, אך מספרם וגודלם של השברים יכולים להשתנות בהתאם למספר הפוליפים הרצויים. גודל השברים החתוכים לא יעלה על עומק המים לאחר האידוי, ולכן האלמוגים נשארים לחלוטין בתוך המים לאחר סיום התהליך.</li>
	<li>הניחו את השברים החתוכים בצלחות פטרי קטנות מלאות ב-12 מ"ל של מי ים שאליהם התאקלמה מושבת האלמוגים. אלה יכולים להיות מי ים מלאכותיים (ראו טבלת חומרים) או מי ים מסוננים באותה מליחות שבה הוכנסה מושבת האלמוגים לפני הפיצול. הערה: חשוב לכסות את השבר לחלוטין במים. אם 12 מ"ל בצלחת פטרי אינו מספיק כדי לכסות את השבר החתוך, יש לייעל את המיכל ואת הנפח בהתאם. במחקר הנוכחי, המים שנוצלו נאספו מים סוף, ומליחותם הייתה 40 PSU, שנמדדה על ידי מטר רב-פרמטרי (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>השאירו את הצלחת פתוחה למשך כ-24 שעות בטמפרטורת הסביבה, כך שהמים יוכלו להתאדות ומליחותם תוכל לעלות בהדרגה. כאשר ניתן להבחין בעיכול רקמות בין פוליפים, המשך לשלב 1.4. הערה: לאחר שזמן הדגירה חלף, מליחות המים חייבת להיות גבוהה בכ-40% מאשר בהתחלה, והפוליפים צריכים להיות מוכנים לניתוק מהשלד.</li>
	<li>באמצעות פיפטת העברה של 1 מ"ל, צור זרימה עדינה קרוב לרקמת האלמוגים. הזרימה תסייע לאט לאט לניתוק מוחלט של הפוליפים שכבר עיכלו את הרקמה סביבם מהשלד. הערה: כאשר זרימת המים נוצרת עם הפיפטה, פוליפים נפרדים או קבוצות של פוליפים חייבים לרדת מהשלד כמו פתיתים. אם חומר מעונן יורד במקום זאת, הוא מצביע על מוות של רקמות או התפוררות, מה שאומר שהאלמוגים דוגרו במשך זמן רב מדי או במצב מלחיץ מדי (במקרה זה, מליחות גבוהה). חשוב מאוד לבצע זרימה עדינה של מים כדי לנתק את הפוליפים, שכן זרימה חזקה יותר עלולה לגרום נזק פיזי להם.</li>
	<li>החליפו באיטיות את המים בצלחת הפטרי במים איזוסמוטיים (השתמשו באותם מים כמו בשלב 1.2.) באמצעות פיפטה. החלפת מים של 50% במשך 10 דקות מספיקה כדי לאקלם את הפוליפים בחזרה למצב מליחות לא מלחיץ. הערה: כאשר נעשה שימוש במושבות אלמוגים של המין pocilloporid Pocillopora verrucosa מים סוף, בוצעו בדיקות כדי לקבוע באילו תנאים ספציפיים האלמוגים מסביבה ייחודית זו יחלצו. חשוב להדגיש את המליחות הגבוהה של ים סוף בהשוואה לרוב סביבות השונית האחרות.</li>
</ol>2. חילוץ פוליפ על ידי מליחות גבוהה של אספקת מי ים
הערה: שיטה זו הותאמה מ- Chuang et al.27.
<ol><li>הכינו 3 ליטר של מי ים בעלי מליחות גבוהה על ידי הוספת NaCl למי הים עד שהמליחות תגדל ב-85%, הנמדדת על ידי בדיקת מליחות. הערה: במחקר הנוכחי, מי ים בעלי מליחות גבוהה של 74 PSU הוכנו מ-40 PSU מי ים מהים האדום.</li>
	<li>חתכו שברים קטנים של אלמוגים כמתואר בשלב 1.1.</li>
	<li>מניחים את השברים החתוכים במיכל של 10 ליטר מלא ב-3 ליטר של מי ים איזוסמוטיים (במקרה זה, מי ים עם מליחות לא מלחיצה עבור האלמוגים, זהה לזה שבו נעשה שימוש בשלב 1.2) המחוברים למשאבה פריסטלטית (ראו טבלת חומרים). הערה: לשמירה טובה יותר על בריאות האלמוגים, ניתן להוסיף בקרי טמפרטורה, משאבות אוויר ואורות כדי לדמות את אותם תנאי אקווריום שאליהם נחשפה המושבה בעבר. במהלך הדגירה בעבודה הנוכחית, שברי האלמוגים הוחזקו במיכלים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס, מתחת למחזור אור יומי של 12 שעות. תנועת המים וההומוגניזציה של הטמפרטורה נשמרו על ידי משאבות אוויר.</li>
	<li>מלאו את המיכל המכיל שברי אלמוגים במי הים בעלי המליחות הגבוהה שהוכנו בשלב 2.1 באמצעות המשאבה הפריסטלטית במשך 24 שעות בקצב של 126 מ"ל/שעה. מוסיפים סך של 3 ליטר מים במליחות הולכת וגוברת של כ-40%. הערה: ניתן לייצר מים בעלי מליחות גבוהה פשוט על ידי הוספת NaCl למי הים עד להגעה למליחות המיועדת.</li>
	<li>צור זרימת מים עדינה עם פיפטה כדי לשחרר את הפוליפים מהשלד (שלב 1.4.).</li>
	<li>החלף באיטיות את המים שבהם מכילים הפוליפים עבור מים איזוסמוטיים (שלב 1.5.). לאחר מכן, המשך לשלב 4 או שלב 5.</li>
</ol>3. חילוץ פוליפ על ידי דגירה ללא סידן של מי ים
הערה: שיטה זו הותאמה מ- Pang et al.24.
<ol><li>הכן תמיסת מי ים מלאכותיים ללא סידן (CaFSW) על ידי הוספת 26.29 גרם של NaCl, 0.872 גרם של KCl, 2.16 גרם של MgSO4, 11.94 גרם של MgCl2, 3.42 גרם של Na2SO4, ו-0.286 גרם של NaHCO3 (ראה טבלת חומרים) ל-1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה. הערה: פתרון זה הותאם מפרוטוקולים קודמים כך שיתאים יותר לאלמוגים המותאמים למליחות של 40 PSU. עבור אלמוגים המותאמים לתנאי מליחות אחרים, השתמשו באותו שיעור של מלחים אך התאימו את המסה הכוללת של המומסים כדי להשיג את המליחות המתאימה יותר לאלמוגים הנמצאים בשימוש.</li>
	<li>חתכו שברי אלמוגים קטנים כמתואר בשלב 1.1.</li>
	<li>הטביעו את שברי האלמוגים בצלחות פטרי שמולאו ב-CaFSW שהוכן קודם לכן (שלב 3.1)ודגרו אותם באינקובטורים מסלוליים במהירות סיבוב של 80 סל"ד למשך 3 שעות. הערה: שוב, חשוב לכסות את השבר לחלוטין במים. אם צלחת פטרי אינה מספיקה כדי לכסות את השבר, יש לייעל את המיכל ואת הנפח בהתאם לצורך הניסויי.</li>
	<li>העבירו את השברים לצלחות פטרי או צלחות של 6 בארות מלאות ב-20% Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) ו-100 מ"ג/מ"ל של תמיסת אמפיצילין (ראו טבלת חומרים) שהוכנו עם 40 PSU מי ים מלאכותיים. דגירה של השברים ב-26 מעלות צלזיוס ו-80 סל"ד, והחליפו את המדיה מדי יום עד שניתן יהיה להבחין בעיכול רקמות בין הפוליפים לפוליפים הבודדים שמתחילים להתנתק מהשלד. הערה: ברוב המקרים, עיכול הרקמות הושלם תוך 20 שעות מהדגירה במדיה זו, ואין צורך בחילופים.</li>
	<li>מעבירים את הפוליפים למי ים מעוקרים לצורך התאוששות ראשונית באמצעות פיפטה. לאחר שעה אחת של דגירה, המשך לשלב 4 או שלב 5.</li>
</ol>4. תחזוקת פוליפ בצלחות פטרי
<ol><li>לאחר שהפוליפים מוחזרים למי ים מסוננים עם מליחות שאינה מדגישה, בחרו פוליפים בני קיימא על ידי התבוננות בשלמות הרקמה ובתנועה הנגרמת על ידי זרימה סילארית תחת סטריאומיקרוסקופ.</li>
	<li>מניחים את הפוליפים שנבחרו בצלחת פטרי מזכוכית או מפלסטיק ומכסים את צלחת הפטרי ברשת פלנקטון (גודל רשת של 200 מיקרומטר, ראו טבלת חומרים) כך שהפוליפים לא יצופו הרחק מהמנה. הערה: גודל רשת הרשת יכול להשתנות בהתאם לגודל הפוליפים. חשוב לציין כי הרשתות חייבות להיות בעלות נקבוביות קטנות יותר מהפוליפים ולאפשר חילופי מים וחדירת אור.</li>
	<li>הניחו את צלחת הפטרי בתוך אקווריום עם התנאים המתאימים למיני האלמוגים בהם נעשה שימוש. הערה: במחקר הנוכחי, התנאים היו 40 PSU מסוננים מי ים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס ומחזור אור של 12 שעות.</li>
	<li>פתחו את כלי הפטרי לפחות פעם בשבוע כדי לחדש את המים ולנקות את הכלים. שלב זה חשוב כדי למנוע צמיחת יתר של אצות שיכולות להתחרות או לגרום נזק לפוליפים של האלמוגים על ידי שחרור מקומי של תרכובות רעילות.</li>
</ol>5. אחזקת פוליפ באינקובטורים
<ol><li>בחר פוליפים בני קיימא כמתואר בשלב 4.1.</li>
	<li>מניחים את הפוליפים בבקבוקי 75 ס"מ2 של תאי פני השטח המלאים ב-50 מ"ל של מי ים איזוסמוטיים באמצעות פיפטות העברה. הערה: בעבודה הנוכחית, מי ים מסוננים שנאספו מים סוף שימשו לתחזוקת פוליפ. ניתן להשתמש במים עם אותם מאפיינים כמו זה המשמש בשלב 1.2.</li>
	<li>סגרו את הצלוחיות והעבירו אותם לאינקובטורים. הגדר את האינקובטורים למחזורי אור של 12 שעות ב-26 מעלות צלזיוס ו-40 סל"ד. החליפו 50% מנפח המים כל 4 ימים והעבירו את התוכן לצלוחיות נקיות כאשר/אם הן מתמלאות באצות או בביופילם על הקירות. הערה: התמונות צולמו עם מערכת זום אפוכרומטית מלאה המצוידת במצלמת HD (ראה טבלת חומרים) עבור התוצאות המייצגות.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיעור ההישרדות של פוליפים לאחר שהוגשו לתהליכי חילוץ והזמן הדרוש להשלמת התהליך משתנים בין המחקרים שדווחו בעבר 25,33,41, מה שמוסבר ככל הנראה על ידי הגישות הניסוייות השונות המיושמות בכל מחקר. לדוגמה, מיני אלמוגים שונים, או אפילו אלמוגים מאותו המין אך התאקלמו לתנאי סביבה שונים (למשל, אלמוגים מים סוף), מציגים סף שונה לרמות המליחות. גם שיטת החילוץ שנבחרה ותנאי המעבדה/אקווריום ממלאים תפקידים חשובים בתוצאות. במקרים מסוימים, התחזוקה של מיקרו-פרופגאטים של אלמוגים בתנאי מעבדה עלתה על זמן ההישרדות של תרביות תאי אלמוגים בכך שהגיעה לחודשים של הישרדות באזוקסנתלאט3 3,41 ובזואקסנתלאט25 אלמוגים. הזמן להשלמת תהליך החילוץ של הפוליפ השתנה גם במחקרים שונים, החל מכמה שעות2 5,2 7,30 לשבועות 3 5 של דגירה שנחשפה לגורם הלחץ האחראי לגרימת חילוץ. משתנה נוסף שיש לקחת בחשבון כאשר בוחנים את חילוץ הפוליפים הוא התאוששות הפוליפים לאחר חשיפה ללחץ החריף שגרם לשחרורם. זה עדיין שנוי במחלוקת אם פוליפים לאחר חילוץ נמצאים במצב טוב מספיק כדי לשמש כמודלים לחקר הביולוגיה של האלמוגים. ההתאוששות של הרקמות שלהם לאחר פירוק של coenosarc הוא עניין של דאגה בעת שימוש micropropagates אלה. עם זאת, פוליפים במחקרים רבים, כולל ההווה, הצליחו להציג תאי זואו-קסנתליים בתוך הרקמות שלהם ומורפולוגיות חיצוניות עם קיטוב אוראלי-הפלתי שלם וזרועות ציד שבועות לאחר החילוץ 25,27,32,36. מחקרים קודמים מצאו גם כי לאחר שהוקל להם מלחץ חריף, פוליפים של אלמוגים משוחררים שנחשפו למי ים מלוחים מאוד או מחוממים הצליחו לשחזר את הביטוי של גנים הקשורים לתהליכים כגון אפופטוזיס, פרוטאוליזה וחלוקת תאים לרמות דומות לאלה שנמצאו לפני החילוץ32,36 ואף להגביר את הביטוי של גנים הקשורים לריפוי רקמות36.
לגבי ההבדל בהישרדות בין השיטות, חשוב להדגיש כי הפעם יכול להשתנות בין ניסויים שונים גם אם נעשה שימוש באותן טכניקות, וזה יכול להיות קשור לבריאות השברים המשמשים ולתחזוקה נכונה של הפוליפים לאחר תהליך החילוץ. במקרה של החילוץ החוצה באמצעות דגירה של מי ים ללא סידן, ההישרדות מפוליפ הוגבלה ליום אחד. לפיכך, ניתן להסיק כי השיטה אינה מתאימה להישרדות ארוכת הטווח של המינים שנחקרו, או שיש לבצע התאמה טובה יותר של הטכניקה עבור אלמוגי P. verrucosa מים סוף. התוצאות המדווחות הראו כי זמן הישרדות ארוך יותר הושג בשיטות המבוססות על העלייה ההדרגתית במליחות, כאשר הפוליפים היו נתונים לטפטוף של מים בעלי מליחות גבוהה. שיטה זו יכולה להביא לעלייה מבוקרת יותר במליחות מאשר שיטת האידוי, ובמקביל אינה אחראית לעלייה בריכוז של חומרים אחרים המצויים במי הים, כולל הפסולת המטבולית של האלמוגים, שעלולה להיות רעילה לאורגניזם. מכל הסיבות הללו, שיטה זו הוצעה כחלופה בטוחה יותר לשמירה על פוליפים בריאים27. למרות ששיטה זו הושערה שהיא בטוחה יותר לבריאות הפוליפים ומסוגלת לייצר פוליפים שחיים זמן רב יותר, עובדה שאומתה בפרסום הנוכחי, יש צורך בסקרים נוספים כדי לאשר אותה. שני ניסויי החילוץ המושרים על ידי מליחות גבוהה הדגימו ניתוק מוחלט של פוליפים לאחר שהמליחות הגיעה ל-59 PSU תוך 24 שעות. אם המליחות מוגברת מעבר לרמה שבה החילוץ הושלם, ייגרם מתח נוסף לפוליפים, מה שיפחית את סיכוייהם לשרוד ויתאוששו מהטיפול החריף בלחץ. לכן, לא מומלץ לשמור על הפוליפים זמן רב יותר ברמות מליחות כאלה. בעת ביצוע שיטת האינדוקציה של החילוץ על ידי חשיפה למי ים נטולי סידן, הושגה ניתוק מוחלט מדגירה של 3 שעות במי ים מלאכותיים נטולי סידן, כלומר גם חשיפה נוספת למדיום זה אינה מומלצת.
כדי להתמודד עם השיטות שהיו מתאימות יותר לחקר פוליפים של אלמוגים בסקרי מעבדה/מבחנה , מחקר זה התמקד רק בשלושה הליכים שלקחו קרוב ל-24 שעות עד שתהליך החילוץ הושלם, והם שימשו במחקרים שכללו תחזוקה ארוכת טווח של פוליפים של אלמוגים סקלרקטיניים. שיטות אחרות שדווח כי לוקחות הרבה יותר זמן מאשר הפעם לא היו מעורבות. יישוב הפוליפים למצע לא נוסה במחקר זה, שהתמקד בייצור פוליפים שניתן להעבירם לסביבות שונות או לאסוף אותם בקלות לצורך ניתוח באמצעות פיפטות חד פעמיות. התוצאות מראות כי פוליפים ממין האלמוגים P. verrucosa הוחזקו בחיים, עם תאי זואוקסנתליים קשורים, מצב ראייה בריא ומבנה אנטומי חיצוני גס שנשמר, עד 8 שבועות, גם ללא חיבור למצע. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן ליצור יותר שכפולים ביולוגיים מקטעי אלמוגים בודדים באמצעות כמה מהטכניקות שהודגמו במחקר זה. שכפולים ביולוגיים כאלה יכולים להישמר בסביבות מבוקרות (כגון צלחות פטרי וצלוחיות תאים) ולשמור אותם בתנאי מעבדה לניסויים בני חודש ולהשתמש בהם למספר מטרות.
מאז התיאורים המקריים הראשונים של חילוץ פוליפ42,43, נקבעו פרוטוקולים חדשים כדי למצוא שיטות סטנדרטיות יותר לגרימת שחרור פוליפים ושמירה על פוליפים כאלה בחיים, אשר יכולים לשמש ליישומי מחקר עתידיים. אלה כוללים חקר היבטים שונים הקשורים לפיזיולוגיה של הולוביונט אלמוגים44 ואינטראקציות פונדקאי-מיקרוביום45, המנגנונים המולקולריים המעורבים בהלבנת אלמוגים 5,25, והבריאות, העמידות וההגנה של הולוביונט האלמוגים 12,13,46,47 . יתר על כן, פוליפים של אלמוגים משוחררים יכולים לשמש ליישומים מחוץ לתחום המחקר והוצע שהם שימושיים ליצירת פרופגולות שיכולות להיצמד למצע ולגדול, מה שעשוי ליצור מספר פרטים של אלמוגים שיכולים לשמש למטרות שיקום ברגע שפרוטוקולים סטנדרטיים לחילוץ הופכים לנפוצים28 . באופן כללי, אף על פי שיש לבצע ניסויים מעמיקים יותר תוך שימוש בפוליפים משועבדים כדי לתקנן את המתודולוגיה, הוכח כי חילוץ פוליפ הוא גישה ניתנת לשחזור שניתן ליישם ככלי בחקר אלמוגים למספר מטרות.

אלמוגים סקלרקטיניים או בונים שוניות הם קנידריאנים המסוגלים ליצור שלדי קרבונט, ליצור שוניות ומערכות אקולוגיות מורכבות מבחינה מבנית שניתן למצוא מסביבות מים עמוקים ועד מים רדודים1. שוניות אלמוגים טרופיות מארחות מגוון ביולוגי גבוה ומספקות שירותי מערכת אקולוגית חיוניים, כגון הגנה על החופים ותחזוקת דיג2. רוב האלמוגים הבונים שוניות במים רדודים מסתמכים על מערכת יחסים הדדית עם אצות ממשפחת Symbiodiniaceae, המספקות את האנרגיה שאלמוגים זקוקים לה כדי לבנות את השלדים שלהם. הסימביוזה בין האלמוגים לאצות יכולה להישבר על ידי עקה סביבתית, ולגרום להלבנת אלמוגים 3,4,5,6. חריגות בטמפרטורה לאחרונה גרמו לאירועי הלבנת אלמוגים גדולים ברחבי העולם, מה שהוביל לתמותה המונית של אלמוגים ולהתפרקות קבועה שלהשונית 7,8,9,10,11. מכיוון שתופעה זו מבוססת על גירוש של סימביונטים על ידי מנגנונים תאיים הקשורים ללחץ חום לאחר לחץ חום, כגון אפופטוזיס, אוטופגיה ואקסוציטוזה, ניתן לתאר הלבנת אלמוגים כתהליך תאי שיש לו השלכות בקנה מידה של מערכת אקולוגית 5,6,12, מה שאומר שתרביות חוץ גופיות של תאי אלמוגים או רקמות יהיו ישימות כדי לחקור את התופעה מקרוב.
בשל חשיבותן של שוניות האלמוגים והאיומים הגדולים העומדים בפניהן, במיוחד בשני העשורים האחרונים2, אלמוגים הפכו למוקד המחקר למטרות הגנה ושיקום ברחבי העולם13. עם זאת, פיתוח גישות ומערכות ניסוי שהן אמינות, ניתנות לשחזור ומציעות השפעה סביבתית מינימלית לחקר אלמוגים הוא מאבק גדול בתחום זה.
מיקרו-פרופגציה מוגדרת כהתפשטות חוץ גופית של הגנוטיפ של אורגניזם על ידי התרבות החומר הביולוגי שלו בכלי עבודה מבוקרים14,15. התרבות של תאים, רקמות ואיברים הייתה חיונית לביולוגיה של צמחים ובעלי חיים בעשורים האחרונים. הוא מאפשר רבייה המונית של אורגניזמים במעבדות, הערכה מהירה של טיפולים שונים (כגון תרופות ותרופות), ומחקר ישיר של תפקוד התא 14,15,16,17. באופן כללי, מודלים במבחנה היו שימושיים להשלמת והעמקת המחקרים של אורגניזמים שונים בתנאים פיזיקליים וכימיים מבוקרים טוב יותר. בשל היתרונות של טכניקות התרבות במבחנה, טכנולוגיות שונות של תאי בעלי חיים ותרביות רקמה פותחו, עברו אופטימיזציה ושימשו ככלים חשובים בתחומי מחקר רבים, שבהם קווי תאים מרובים נחקרו והתמסחרו עבור יישומים רבים 16,17,18.
התקדמות רבה בידע על תרבית תאים ורקמה נעשתה מאז תרבית רקמת החיה הראשונה בשנת 188217, כגון שימוש במדיה טבעית וסינתטית, המצאת קווי תאים מבוססים ופיתוח מדיה תלת-ממדית לטיפוח מספר רב של סוגי תאים בצורה טובה יותר16,17, 18,19. עם זאת, תחום הביולוגיה של התא התמקד בעיקר בקבוצה נבחרת של אורגניזמי מודל, בעוד שלטקסונים רבים עדיין אין תרביות חוץ גופיות מבוססות היטב של תאים, רקמות או איברים20. לדוגמה, במחקר אלמוגים, לא נעשה שימוש נרחב בקווי תאים מונצחים למחקר, מה שמגביל את חקר תאי האלמוגים לשימוש בתרביות תאים ראשוניות. לתרביות אלה יש יכולת קיום המוגבלת למספר שבועות21, ללא מחקרים המתעדים את הישרדותם של תאים בודדים מכל רקמות האלמוגים במשך יותר מ-13 יום עד תחילת 202122. הדו"ח הראשון על קווי תאי אלמוגים בני קיימא שפורסם היה עם תאי Acropora tenuis שחיו עד 6 חודשים, והתועלת של תאים אלה למחקר עתידי נותרה לחקור23.
כדי להתגבר על המגבלות של גידול תרביות תאי אלמוגים ולתחזק תרבית מעבדה המשמרת את הארגון הכולל של הרקמות של אלמוגים, השימוש בפוליפים מבודדים הוצע לאחרונה כמודל למחקר ביולוגיה של אלמוגים24,25. פוליפים הם היחידות האנטומיות של אלמוגים, ולכל אחד מהם יש פה הממוקם במרכז הדיסק האוראלי שלהם והוא מחובר לפוליפים אחרים על ידי הקואנוזרק באזור ההפלה שלו26. ההפרדה של פוליפים חיים מתרחשת באופן טבעי על ידי תהליך של חילוץ פוליפ, שבו עקה חריפה גורמת לעיכול של הקואנוזרק בין הפוליפים, אשר לאחר מכן יכול להתנתק משלד המושבה 25,27,28. תופעה זו דווחה כמתרחשת במגוון טקסונים, כולל תמנונים 29,30,31, אלמוגים שחורים 32 ואלמוגים סקלרקטיניים 25,27,27,28,32,33, ונקשרה לגורמי עקה סביבתיים מרובים, כגון מחסור בסידן במים 24,34, חומציות מוגברת35, תנאים היפר-אוסמוטיים 25,27,32,36, טמפרטורות גבוהות 36,37, רעב 33, חשיפה לאוויר25,30 וזיהום קוטל חרקים28,38. חילוץ פוליפ דווח, למשל, באלמוגים פוצ'ילופורידים19, המפוזרים באופן נרחב ברחבי העולם ומשמשים בדרך כלל כמודלים בחקר אלמוגים. מינים השייכים לקבוצה זו, כגון Pocillopora damicornis ו- Styllophora pistillata, יצרו כ-30-40 מיקרו-פרופגאטים מקטע 5 מ"מ25. מספר זה מדגיש את היתרון של שימוש ב-polyp bail-out כשיטה למיקרו-פרופגציה של אלמוגים, שכן הוא יוצר את האפשרות ליצור פרטים רבים זהים גנטית מפיסת אלמוגים קטנה. לשימוש בפוליפים מבודדים למחקר יש גם את אותם יתרונות כמו לתרביות תאים לגבי האפשרות להיות מתורבתים בסביבות מעבדה מבוקרות, כגון צלוחיות וצלחות פטרי. בנוסף, פלטפורמות מיקרופלואידיות לשמירה על פוליפים חיים הראו כי ניתן לשמור על מיקרו-פרופגטים אלה בסביבות זולות יחסית וקלות לשחזור, עם זרימת מים מבוקרת, פני השטח והטמפרטורה24,25. פלטפורמות מיקרופלואידיות אלה יכולות לשמש גם כדי לדמיין מבני אלמוגים חיים תחת מיקרוסקופ ישירות24,25.
במאמר הנוכחי אנו מסכמים ומדגימים את הטכניקות שפותחו כדי לבודד פוליפים של אלמוגים בודדים ממושבותיהם, ומראים כיצד לשמור עליהם בתנאי מעבדה לתרבית ארוכת טווח. השיטות הנדונות כוללות חילוץ פוליפ-אאוט באמצעות תנאים היפר-אוסמוטיים על ידי אידוי ושאיבת מי ים בעלי מליחות גבוהה ודגירה במי ים נטולי סידן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5560 Conductivity/Temperature Probe</td>
			<td>YSI</td>
			<td>5560</td>
			<td>Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2004083</td>
			<td>Used to cut coral fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>Used in DMEM medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt</td>
			<td>Schego</td>
			<td>548</td>
			<td>Heaters used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite Version 4.2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software used for image capture in demonstrative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica IC80 HD</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>12730216</td>
			<td>Camera used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MDG33</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 123</td>
			<td>Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Z6 APO</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Macroscope used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77602-10</td>
			<td>Peristaltic pump head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07557-00</td>
			<td>Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Tubing for peristaltic pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex 33 mm PVDF 0.22 &#181;m Sterile RUO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Used to filter artificial sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Flask usually used for cell culture used for polyp culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker, Advanced 5000, VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2916</td>
			<td>Shaker used inside incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator - I-22VL</td>
			<td>Percival</td>
			<td>NA</td>
			<td>Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton net 200 &#181;m mesh size</td>
			<td>KC Denmark</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for covering petri dishes containing coral polyps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProQuatro Multiparameter Meter</td>
			<td>YSI</td>
			<td>606950</td>
			<td>Used for measuring salinity thoughout the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RADION XR15 G5 PRO</td>
			<td>Ecotech</td>
			<td>NA</td>
			<td>Lights used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Sea Salt 
			Premium grade, moderate Alkalinity</td>
			<td>Red Sea</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to prepare 40 PSU artifical sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRD 112 thermostat</td>
			<td>Schego</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermostat used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbelle Nanostream 6025</td>
			<td>Tunze</td>
			<td>6025 000</td>
			<td>Pumps used in aquarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use

אלמוגים הם בעלי חיים קולוניאליים הנוצרים על ידי יחידות מודולריות הנקראות פוליפים. פוליפים של אלמוגים מקושרים מבחינה פיזיולוגית ומחוברים על ידי רקמה. תופעת חילוץ הפוליפ היא תהליך המושרה על ידי עקה חריפה, שבה פוליפים של אלמוגים מעכלים את הרקמה ומחברים אותם לשאר המושבה ובסופו של דבר מתנתקים מהשלד כדי להמשיך לחיות כפרטים נפרדים. ביולוגים של אלמוגים הכירו בתהליך של חילוץ פוליפ במשך שנים, אך רק לאחרונה המיקרו-פרופגאטים שנוצרו על ידי תהליך זה הוכרו כמערכת מודל למחקרים בביולוגיה של אלמוגים. השימוש ב-polyp bail-out יכול ליצור מספר גבוה של יחידות קלונליות מקטע אלמוגים יחיד. יתרון נוסף הוא שניתן לדמיין בקלות פוליפים בודדים או טלאים של פוליפים תחת מיקרוסקופ ולתחזק אותם בסביבות סטנדרטיות מאוד בעלות נמוכה כגון צלחות פטרי, צלוחיות ושבבים מיקרופלואידיים. הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטות הניתנות לשחזור המסוגלות לגרום למיקרו-פרופגציה של אלמוגים ולגישות שונות לשמירה על הפוליפים הבודדים בחיים בטווח הארוך. מתודולוגיה זו הייתה מסוגלת לטפח בהצלחה פוליפים של מין האלמוגים Pocillopora verrucosa במשך עד 8 שבועות לאחר החילוץ, והציגה את המעשיות של שימוש בפוליפים אלמוגים בודדים לחקר אלמוגים.

חילוץ פוליפ הושרה בשברי אלמוגים השייכים למושבה אחת של המין P. verrucosa בעקבות שלוש שיטות שונות (איור 1). חילוץ שהושרה על ידי מליחות גבוהה לאחר השלמת אידוי המים לאחר 24 שעות של דגירה של שברי אלמוגים בצלחות פטרי בטמפרטורת סביבה מלאה במים בתחילה ב-40 PSU, שהגיעו למליחות סופית של 59 PSU לאחר סיום התהליך (איור 2A-C,I). חילוץ על ידי אספקת מים מלוחים הושג גם לאחר 24 שעות של דגירה במים בתחילה ב-40 PSU שהגיעו למליחות של 52 PSU לאחר 12 שעות ו-59 PSU בסוף התהליך, לאחר 24 שעות (איור 2D-F,I). בשני הניסויים, עלייה במליחות הייתה אחראית על אינדוקציה של עיכול רקמות על ידי הפוליפים. לאחר 12 שעות, מצב המליחות הגבוהה גרם להתכווצות הפוליפים בשילוב עם דילול הדרגתי של הקואנוזרק, ובסופו של דבר גרם לניתוק הסופי של הפוליפים לאחר 24 שעות. האינדוקציה של החילוץ באמצעות דגירה במי ים נטולי סידן הושלמה לאחר דגירה של 3 שעות ב-CaFSW ואחריה דגירה של 20 שעות במדיה של 20% DMEM (איור 2G-H). הרקמה נותקה מהשלד בכל שלוש השיטות לאחר שדחפה אותה עם פיפטה עד שנוצרו פוליפים של אלמוגים מותאמים אישית (איור 3A-C) ו"כדורי רקמה".
לאחר הניתוק נאספו הפוליפים מכל שלוש השיטות והותר להם להתאושש במי ים לפני שהוקצו לכלי פטרי מכוסים ברשתות או בצלוחיות תאים. הפוליפים שהתקבלו מהאידוי ומשיטות אספקת המים נשמרו בצלחות פטרי בתוך אקווריומים ושרדו במשך 6 שבועות ו-8 שבועות, בהתאמה (איור 3D ואיור 3F). מיקרו-פרופגאטים אלה שמרו על האנטומיה הרגילה של פוליפים, והציגו זרועות ציד, דיסקות בסיס ופיות1. הפוליפים שהתקבלו באמצעות הדגירה במי ים נטולי סידן היו בעלי תוחלת חיים קצרה, ושרדו עד יום אחד, ולאחר מכן הרקמה שלהם התנתקה. פוליפים שהתקבלו משיטת אידוי מי הים שהוחזקו בצלוחיות תרביות תאים בתוך אינקובטורים שרדו עד 3 שבועות ללא דיסוציאציה של רקמות (איור 3F). בכל המקרים, למרות שהפוליפים לא יכלו להתחבר למצע, הם היו בריאים מבחינה חזותית ושמרו על צבעם, כאשר תאי זואוקסנתלי עדיין נראים בתוך הרקמות שלהם1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig01v2.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של שלוש המתודולוגיות השונות שנבדקו עבור אינדוקציה של חילוץ פוליפ (משמאל) ולאחר מכן המחשה של שתי שיטות לשמירה על הפוליפים הנרכשים בתנאי מעבדה (מימין). (A) ייצוג המתודולוגיה לחילוץ פוליפ על ידי אידוי מים. (ב) ייצוג המתודולוגיה לחילוץ פוליפ על ידי אספקת מי ים במליחות גבוהה. (ג) ייצוג המתודולוגיה לחילוץ פוליפ על ידי דגירה נטולת סידן של מי ים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig02.jpg"> איור 2: תמונות של תהליך חילוץ הפוליפ המושרות על ידי שלוש מתודולוגיות שונות תוך שימוש בשברים של מין האלמוגים P. verrucosa. (א-ג) שבר אלמוגים ב-0 שעות, 12 שעות ו-24 שעות לאחר הדגירה, בהתאמה, בצלחת פטרי בשיטת אידוי המים. (ד-ו) שבר אלמוגים ב-0 שעות, 12 שעות ו-24 שעות לאחר הדגירה, בהתאמה, בשיטת אספקת מי הים במליחות גבוהה. (ז,ח) שברי אלמוגים שנחשפו לשיטת הדגירה נטולת הסידן של מי הים לפני ואחרי, בהתאמה. הדגירות במי ים מלאכותיים נטולי סידן היו במשך 3 שעות וב-20% DMEM למשך 21 שעות( I) ייצוג גרפי של ערכי המליחות ב-PSU של מי הים לאורך זמן במהלך אידוי המים ושיטות האינדוקציה של אספקת מי הים במליחות גבוהה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig03.jpg"> איור 3: תמונות של פוליפים מסוג P. verrucosa שהתקבלו משלושת הליכי האינדוקציה שהוכחו על-ידי חילוץ.(A-C) התמונות של הפוליפים שהתקבלו משיטות האידוי, אספקת המים המלוחים ומי הים נטולי הסידן, בהתאמה, נלכדו מיד לאחר שנותקו מהשלד. (D) תמונה של פוליפ אלמוגים שהתקבלה משיטת האידוי לאחר ששרדה 6 שבועות בצלחת פטרי. (E) תמונה של פוליפ אלמוגים שהתקבלה משיטת אספקת המים המלוחים לאחר ששרדה 8 שבועות בצלחת פטרי. (F) תמונה של פוליפ אלמוגים שהתקבלה משיטת האידוי לאחר ששרדה 3 שבועות בבקבוקון תרבית תאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use at JoVE.com

Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

חילוץ פוליפ הוא תהליך המושרה על ידי עקה חריפה, שבה פוליפים של אלמוגים מעכלים את הרקמה המחברת אותם למושבה שלהם ומתנתקים ממנה כדי לחיות כפרטים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לגרום למיקרו-פרופגציה של אלמוגים על ידי חילוץ באמצעות טיפולים בהיפר-סלין או במי ים נטולי סידן.

גרימת חילוץ פוליפ במושבות אלמוגים כדי להשיג מיקרו-פרופגאטים מותאמים אישית לשימוש ניסיוני במעבדה

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of ...

מיקרו-פרופגציה של אלמוגים עדיין בחיתוליה. אופטימיזציה של פרוטוקולים לחילוץ פוליפים היא המפתח להשלמת הפער הזה, המאפשרת למדענים להשתמש בפוליפים כמודלים לחקר אלמוגים בסביבות מעבדה. חילוץ פוליפ מאפשר ליצור התפשטות מרובה מקטעי אלמוגים קטנים.ניתן להשתמש בפוליפים בניסויים שונים המאפשרים תצפית על תהליכים מיקרוסקופיים באלמוגים, למשל. שוניות אלמוגים מאוימות. המטרה שלנו היא להשתמש במודל הניתן לשכפול זה כדי לפתח אסטרטגיות להגנה על אלמוגים מפני הלבנה ואיומים סביבתיים אחרים בצורה יעילה ולא פולשנית.שיטה זו עשויה לסייע בחקר הפיזיולוגיה של האלמוגים, אינטראקציות המיקרוביום של המארחים והמנגנונים המעורבים בהלבנה. ממצאים כאלה יכולים לתרום לאופטימיזציה של פרוביוטיקה של אלמוגים, למשל. שימוש במי ים עם מליחות נאותה הוא המפתח.המליחות חייבת להתחיל ברמת הסביבה הטבעית של האלמוגים ולהתגבר לאט כדי שהלחץ לא יזיק יתר על המידה. איסוף פוליפים ברגע הנכון ובחירת אלה שהם השלמים ביותר הוא חיוני להישרדותם. הדגמה חזותית יכולה להיות חיונית להבנת רמזים אלה.ראשית, השתמשו בצבתות חיתוך אלכסוניות כדי לחתוך שברים קטנים ממושבת אלמוגים, ואז הניחו אותן בצלחות פטרי קטנות מלאות ב-12 מי ים שאליהן התאקלמה מושבת האלמוגים. השאירו את הצלחת פתוחה למשך כ-24 שעות בטמפרטורת הסביבה, כך שהמים מתאדים ומליחותם עולה בהדרגה. כאשר ניתן להבחין בעיכול הרקמה בין הפוליפים, השתמשו בפיפטת העברה של 1 מיליליטר כדי ליצור זרימה עדינה קרוב לרקמת האלמוגים.הזרימה תסייע לאט לאט להשלים את ניתוק הפוליפים שכבר עיכלו את הרקמה סביבם מהשלד, ואז עם הפיפטה, החליפו באיטיות את המים בצלחת פטרי במים איזוסמוטיים. כדי להכין מי ים בעלי מליחות גבוהה, קחו מי ים רגילים והוסיפו נתרן כלורי למי ים כדי להכין שלושה ליטרים של מי ים בעלי מליחות גבוהה עד שהמליחות תגדל ב-85% לאחר חיתוך שברים קטנים של אלמוגים כפי שהוכח קודם לכן, הכניסו אותם למיכל של 10 ליטר עם שלושה ליטרים של מי ים איזוסמוטיים המחוברים למשאבה פריסטלטית. מלאו את המיכל הזה בשלושה ליטרים של מי ים בעלי מליחות גבוהה שהוכנו בעבר במשך 24 שעות בקצב של 126 מיליליטר לשעה כדי להגדיל את המליחות בכ-40% באמצעות פיפטה, צרו זרימה עדינה של מים לשחרור הפוליפים מהשלד.לאט לאט להחליף את המים במיכל במי ים איזוסמוטיים. מוסיפים 26.29 גרם נתרן כלורי, 0.872 גרם אשלגן כלורי, 2.16 גרם מגנזיום גופרתי, 11.94 גרם מגנזיום כלוריד, 3.42 גרם נתרן גופרתי ו-0.26 גרם נתרן ביקרבונט לליטר אחד של מים שעברו דה-יוניזציה כדי להכין מי ים נטולי סידן, ואז למלא את מנות פטרי במי ים נטולי סידן. לאחר חיתוך שברי אלמוגים קטנים, הטביעו אותם במי ים נטולי סידן בצלחות הפטרי.שים את הכלים באינקובטור מסלולי למשך שלוש שעות במהירות סיבוב של 80 סל"ד, ואז העבר את השברים לצלחות פטרי מלאות ב-20% DMEM שהוכנו במי ים מלאכותיים של 40 יחידות מליחות מעשיות ומכילות 100 מיליגרם לליטר אמפיצילין. הדגירה של השברים ב-26 מעלות צלזיוס ו-80 סל"ד. החליפו את המדיה מדי יום עד שניתן יהיה להבחין בעיכול רקמות בין פוליפים ופוליפים בודדים מתחילים להתנתק מהשלד, ואז מעבירים את הפוליפים למי ים מעוקרים ודגירה למשך שעה.לאחר שהפוליפים מוחזרים למי ים מסוננים עם מליחות שאינה מדגישה, בחר את הפוליפים בני הקיימא על ידי התבוננות בשלמות הרקמה ובתנועה הנגרמת על ידי זרימה סילארית תחת מיקרוסקופ סטריאו. מניחים את הפוליפים שנבחרו בצלחת פטרי ומכסים את צלחת הפטרי ברשת פלנקטון בגודל רשת של 200 מיקרומטר, כך שהפוליפים לא צפים הרחק מהתבשיל. הניחו את צלחת הפטרי בתוך אקווריום עם תנאים מתאימים למיני האלמוגים בהם נעשה שימוש.כדי למנוע צמיחת יתר של אצות, פתחו את צלחת הפטרי לפחות פעם בשבוע כדי לחדש את המים ולנקות את התבשיל. לאחר בחירת הפוליפים כפי שהוצג קודם לכן, באמצעות פיפטת העברה, מניחים אותם לתוך בקבוקון תא פני שטח בגודל 75 סנטימטרים רבועים המלא ב-50 מיליליטר של מי ים איזוסמוטיים, ואז סוגרים את הבקבוקון ומכניסים אותם לחממה שנקבעה במחזורי אור של 12 שעות, 26 מעלות צלזיוס ו-40 סל"ד. אם הבקבוקון מתמלא באצות או בביופילמים, העבירו את התכולה לבקבוקון נקי.במחקר זה, חילוץ פוליפ הושרה על ידי שלוש שיטות שונות. שיטת אידוי המים הביאה לחילוץ מוחלט תוך 24 שעות מרגע הדגירה, והמליחות עלתה מ-40 ל-59 יחידות מליחות מעשיות לאחר 24 שעות. שיטת אספקת המים המלוחים הביאה גם לחילוץ פוליפ לאחר 24 שעות של דגירה.כאן, המליחות עלתה מ -40 ל -52 יחידות מליחות מעשיות לאחר 12 שעות של דגירה, ולאחר מכן ל -59 יחידות מליחות מעשיות לאחר 24 שעות. האינדוקציה של החילוץ באמצעות דגירה במי ים נטולי סידן הושלמה לאחר שלוש שעות של דגירה של פוליפים בתוכה, ולאחר מכן 20 שעות של דגירה במדיה של 20% DMEM, בכל שלוש השיטות ניתן היה ליצור פוליפים אלמוגים אינדיבידואליים. פוליפים של אלמוגים שנוצרו על ידי שיטת האידוי יכלו לשרוד במשך שישה שבועות, ואילו אלה המיוצרים על ידי שיטת אספקת מי הים בעלת המליחות הגבוהה יכלו לשרוד במשך שמונה שבועות בצלחות פטרי בתוך אקווריומים.פוליפים שהתקבלו משיטת אידוי מי הים שהוחזקו בצלוחיות תרביות תאים בתוך אינקובטורים שרדו עד שלושה שבועות ללא דיסוציאציה מוחלטת של הרקמות שלהם. כאשר מנתקים פוליפים מהשלד, חשוב להיות עדינים. אם הם לא מנותקים לחלוטין, כפיית ניתוק על ידי צנרת חזקה של מים תגרום לנזק ושיעורי הישרדות נמוכים יותר.באמצעות שיטות אלה, התיישבות של פוליפים יכול להיות מושרה. התיישבות פוליפס יכולה לענות על שאלות לגבי הסתיידותה ותהליכי הצמיחה שלה. לאחר התפתחות האינדוקציה של פוליפ, החוקרים הצליחו לחקור את ההיווצרות הראשונית של שלד האלמוגים ולדמיין באופן ישיר הלבנת אלמוגים בסולם הפוליפים.

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogenesis קליפתיים: מעבר מן ההתקדמות מעבדה כדי Cell טיפולים מבוססי

Experimental Approaches to Tissue Engineering

גישות ניסויית כדי הנדסת רקמות

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

שימוש Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) לפתח כלים לאבחון

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

הידרופובי אוטומטי אינטראקציה כרומטוגרפיה טור בחירה עבור שימוש ב טיהור חלבון

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

פרוטוקול עבור המעבדה דיור של טורקיז דגים גמבוזיים (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

נסיוני באמצעות דרוזופילה כמערכת מודל הגעה לבדיקת רעילות במעבדה

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Inducing Apical Periodontitis in Mice

לגרימת חניכיים הרשמי בעכברים

The mechanisms involved in local induced inflammation can be studied using several available animal models. One of these is the induction of apical ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

הייצור של עמילואיד-β-הפרשה Alginate מיקרו חרוזי לשימוש ב דוגמנות מחלת אלצהיימר

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...